bölüm 5 - Erzurum Teknik Üniversitesi
advertisement
BÖLÜM5 BESLENME,LABORATUVARKÜLTÜRÜ VEMİKROORGANİZMALARIN METABOLİZMASI • • • • • • • • • A k t i va s yo n e n e r j i s i ; E n z i m i n substrat(lar)ını reaktif duruma getirmek için gerekli olan enerji Anabolizma; Hücredeki biyosentetik tepkimelerin tümü. Aseptik teknik; Çalışma sırasında mikrobiyal kültürlerin veya steril objelerin kontaminasyonuna engel olmak için alınan önlemler serisi ATP sintaz (ATPaz); proton itici gücün ortadan kalkması ile eşleşmiş olan ATP sentezini katalizleyen ve sitoplazmik zara gömülü halde bulunan, çoklu-protein yapısındaki enzim kompleksi Ekzergonik; enerji açığa çıkaran Elektron alıcısı; elektron vericisinden elektronları alabilen ve bu sırada indirgenen madde Endergonik enerjiye gereksinim duyan Enzim; Özgül bir kimyasal tepkimeyi hızlandırabilen (katalizleyen) protein Fermentasyon; Organik maddenin hem elektron alıcısı hem de elektron vericisi olarak görev yaptığı ve ATP’nin substrat seviyesinde fosforilasyon aracılığı ile üretildiği anaerobik katabolizma • • • • • • • • Fotofosforilasyon; Işık-güdümlü elektron taşınması sırasında oluşan proton proton itici güçten ATP üretilmesi Glikoliz; Glukoz molekülünün ATP ve çeşitli fermentasyon ürünleri oluşturacak şekilde fermente olduğu biyokimyasal yol; aynı zamanda Embden-Meyerhof yolu olarak da isimlendirilir K atabolizma; Hücre tarafından kullanılabilir enerji (genelde ATP) üretimine yol açan biyokimyasal tepkimeler Katalizör; Kimyasal tepkimeyi hızlandıran, ancak tepkime sırasında tüketilmeyen madde Kemiosmoz; Proton itici gücün ortadan kalkması ile eşleşmiş ATP sentez süreci Koenzim; Enzimin bir parçası olarak katalitik tepkimelere katılan ve protein yapısında olmayan küçük molekül Kompleks besi ortamı ; Maya ve et özütleri gibi kimyasal olarak tanımlanmamış maddeler içeren besi ortamı Kültür ortamı; Mikroorganizmaların gelişmesi için uygun olan çeşitli besinleri içeren sıvı çözelti • Oksidatif fosforilasyon; Elektron taşınması ile oluşan proton itici gücün varlığında ATP üretimi • Ototrof; Tek karbon kaynağı olarak CO2’i kullanarak, tüm hücre mater yallerinin biyosentezini gerçekleştirebilen organizma • Proton itici güç; Zarın iki yüzeyi arasında • yükün ve su elementlerinin (H+’e karşı OH–) ayrımından ortaya çıkan enerji yüklü zar durumu • Redüksiyon potansiyeli; (E 0 ’) maddenin içsel elektron bağışlama eğiliminin volt birimi cinsinden ölçülen değeri; E0’ standart koşullar altındaki redüksiyon potansiyelidir • Saf kültür ; Tek tip organizma içeren kültür • Serbest enerji (G); İş yapmak için elverişli olan enerji; G0’ standart koşullar altındaki serbest enerjidir • S i d e r o f o r ; Ç o k d ü ş ü k konsantrasyonlardaki demire bağlanarak kelat yapan bileşik • Sitrik asit döngüsü; Asetatın iki CO2 molekülüne dönüştüğü döngüsel tepkimeler serisi • Solunum; Bir bileşiğin son elektron alıcısı olan O2 (veya O2 yerine geçen diğer bileşikler) ile oksitlendiği ve oksidatif fosforilasyon ile genelde ATP molekülünün üretildiği süreç • Substrat düzeyinde fosforilasyon; Fosfat grubu taşıyan bir organik bileşikteki enerji bakımından zengin fosfat molekülünün, doğrudan ADP molekülüne aktarılması ile ATP üretimi • Tanımlanmış besi ortamı; Kimyasal bileşimi kesin olarak bilinen kültür ortamı • Karbon ve enerji için organik maddeleri gereksinen kemoorganotroflar’dır. • Makrobesin (karbon ve azotu vs.) olarak isimlendirilen bazı besinlere fazla miktarlarda ih;yaç duyulurken, mikrobesin olarak isimlendirilen diğerlerine çok az miktarlarda ha@a bazen eser miktarlarda ih;yaç duyulmaktadır. • Prokaryotların çoğu karbon kaynağı olarak organik maddeye gereksinim duyar. Kuru ağırlık esas alındığında ;pikbirhücrenin%50’sikarbondur. • Karbondansonrahücredeenbolbulunanelementazottur. Tipik bir bakteri hücresinin kuru ağırlığının yaklaşık %12’si azo@anoluşur. • Azot proteinler, nükleik asitler ve diğer hücre birleşenleri içingereklidir.Azotdoğadahemorganikhemdeinorganik formda bulunmakla birlikte, bu azotun büyük kısmı amonyak (NH3), nitrat (NO3–) ya da N2 halinde olup, inorganikformdadır. • Bakterilerin çoğu tek azot kaynağı olarak amonyağı kullanırken, diğerleri aynı zamanda nitraT da kullanabilir. Bununla beraber, azot-fikse eden bakteriler için tek azot kaynağıazotgazı(N2)dır. • Diğermakrobesinler:P,S,K,Mg,Ca,Na’dur. • Fosfor doğada organik ya da inorganik fosfat formunda olabilir ve hücrede öncelikli olarak nükleik asitlerin ve fosfolipidlerinsenteziiçingereklidir. • Sisteinveme;oningibiaminoasitlerin,;yamin,biyo;nve lipoikasitgibibazıvitaminlerinvekoenzimA’nınyapısında kükürtbulunur. • Hücredekikükürtünçoğuyasülfat(SO4–2)yadasülfit(HS–) halindekiinorganikkaynaklardansağlanmaktadır. • Potasyum protein sentezinde görev yapanlar da dahil olmak üzere, çeşitli enzimler ak;vite gösterebilmek için özgülolarakpotasyumagereksinimduyarlar. • Magnezyum ribozomları, zarları ve nükleik asitleri kararlı halege;rmedeişlevgörmesininyanısıra,pekçokenzimin ak;vitesiiçindegereklidir. • Kalsiyum,hücreduvarınıstabilizeetmeyeyardımcıolurve endosporların ısıya karşı direnç göstermelerinde çok önemlibirroloynar. • Demir, elektron taşınmasında görev alan sitokromların ve demir-kükürt proteinlerinin önemli bileşeni olarak hücre solunumundaoldukçaönemlibirroloynar • Oksijensiz koşullar alTnda demir genelde +2 oksidasyon durumunda (ferrus, Fe+2) ve çözünmüş haldedir, oksijenli koşullarda ise demir genelde +3 oksidasyon durumunda (ferrik,Fe+3)olup,çözünmeyençeşitlimineralleroluşturur. Hücreler bu tür minerallerden demir elde etmek için, demire bağlanıp onu hücre içine aktaran ve sideroforlar olarakisimlendirilendemir-bağlayıcıajanlarüre;rler. • Hayvansal dokularda kısa süreli depolanır; çünkü demir temizleme sistemleri demiri bağlar ve mikroorganizmalar içinkullanılamazdurumage;rir. • Bazı prokaryotlar hiç demir içermeyen ortamlarda yaşayabilirler.Örneğin,LactobacillusplantarumveBorrelia burgdorferii bakterileri (Lyme hastalığı etkenidir) demir içermez. Bu bakterilerin normalde Fe+2 içermesi gereken enzimlerinde, metal bileşen olarak demir yerine Mn+2 bulunur. • Mikrobesinler (İz Elementler): Her ne kadar sadece eser miktarlarda ih;yaç duyulsa da, mikrobesinler hücre işlevleri için yine de haya; önem taşırlar. Mikrobesinler (örneğin demir) metal oldukları için, sıklıkla iz elementler olarakadlandırılırlar. • Büyüme Faktörleri; Büyüme faktörleri organik maddeler olup, bunlara da Tpkı mikrobesinler gibi sadece bazı hücreler taraandan ve çok az miktarlarda gereksinim duyulur. Vitaminler, amino asitler, pürin ve pirimidinler büyüme faktörleri olarak işlev görürler. Her ne kadar mikroorganizmaların çoğu bu maddeleri sentezleyebilseler de, bazı mikroorganizmalar bunların bir ya da bir kaçını çevreden hazır olarak alır. Bu nedenle laboratuvar kültürlerinde bu maddelerin ortama eklenmesi gerekmektedir.Vitaminlerenyaygınolarakih;yaçduyulan büyüme faktörleridir. Vitaminlerin çoğu koenzimlerin bileşenleriolarakişlevgörürler. • Mikroorganizmalarınenyaygınolarakgereksindiğivitaminler ;yamin (vitamin B1), biyo;n, piridoksin (vitamin B6) ve kobalamin(vitaminB12)dir. • Kültürortamı,mikroorganizmalarınlaboratuvardaüre;lmesi içinkullanılanbesinçözel;leridir. • Mikrobiyolojide kullanılan iki büyük kültür ortamı sınıa vardır: kimyasal olarak tanımlanmış olanlar ve kimyasal olaraktanımlanmışolmayanlar(kompleksbesiortamları). • Kimyasal olarak tanımlanmış besi ortamları (kısaca tanımlanmış besi ortamları), miktarları kesin olarak bilinen oldukçasafinorganikyadaorganikkimyasallarındis;lesuya eklenmesi ile hazırlanır. Bu nedenle, tanımlanmış besi ortamınınkimyasalbileşimikesinolarakbilinir. • Herhangi bir kültür ortamının en önemli bileşeni karbon kaynağıdır;çünkübütünhücreleryenihücremateryallerini yapabilmek için çok miktarda karbona gereksinim duyar. Basit tanımlanmış bir besi ortamında, tek bir karbon kaynağımevcu@ur. • Kompleks besi ortamı’nda hayvansal ya da bitkisel parçalanma ürünleri bulunur. Bunlar arasında örneğin, kazein(sütproteini),sığıre;,soyafasulyesi,mayahücreleri ya da henüz kimyasal olarak tanımlanmamış oldukça besleyici diğer maddeler yer alır. Bu özütler toz şeklinde ;cariolaraksaTnalınırvebesiortamınıhazırlamakiçinçok kolaylıkla tarTlıp dis;le su içinde çözülür. Bununla birlikte, kompleks besi ortamı kullanmanın en önemli dezavantajı kesinbesinbileşimininkesinolarakkontroledilememesidir. • Klinik mikrobiyolojide, kültür ortamları selekAf veya diferansiyelşekildehazırlanır(veyaherikişekilde). • SelekVf besi ortamı bazı mikroorganizmaların bazı mikroorganizmaların üremesini seçici olarak engellerken diğerleriniengellemez. • Buna karşılık, diferansiyel besi ortamı, genelde boya gibi bir takım indikatörlerin eklendiği bir besi yeridir. Bu besi yeri gelişme sırasında gerçekleşen belirli kimyasal tepkimelerinayırtedilmesineolanaksağlar. • Diferansiyelbesiortamı,bazıtepkimelerigerçekleş;rebilen ya da gerçekleş;remeyen bakteri türleri arasında ayrım yapabilmekiçinoldukçakullanışlıdır. • Müşkülpesent(besintalebifazla) • ZenginleşVrilmişbesiortamı,serumyadatamkangibi ekstra besinlerin eklendiği kompleks bir ortamdır. Ortama eklenen bu besinler konakçıdaki koşulları oldukça iyi taklit eder ve Streptococcus pyogenes ve Neisseria gonorrheae gibi organizmaların başarılı laboratuvarkültürleriiçingereklidir. • Başarılıbirmikroorganizmakültürüyapabilmekiçin,o mikroorganizmanınbesingereksinimlerinianlamakve dahasonrabubesinleriuygunformlardaveoranlarda kültürortamınaeklemekgerekmektedir. • Saf kültür, sadece tek %p mikroorganizma içeren kültürdemekVr. • Bakteri kolonileri organizmanın ;pine, kültür koşullarına, besin desteğine (mevcut oksijen miktarı da dahil olmak üzere) ve çeşitli fizyolojik parametrelere bağlı olarak çeşitli şekillerde ve büyüklüklerde olabilirler. Bazı bakteriler koloninin renklenmesine sebep olan pigmentler üre;rler (Şekil5.2). • KaT besi ortamları da sıvı besi ortamları gibi hazırlanmakla birlikte, bu ortama sterilizasyon işleminden önce jelleş;rici ajanolarak%1.5konsantrasyondaagareklenir. • Pek çok kültür ortamı ısı ile steril edilir. Bu işlem, nemli sıcaklıksağlayanveotoklavadıverilenyüksekbasınçlıcihaz içindeyapılır. • Sterilkültürortamıhazırlandıktansonra,dahaönceüre;lmiş olan saf kültür ile inoküle edilir. Bu işlem asepVk teknik ile yapılır(Şekil5.3). ENERJİVEENZİMLER • Enerji; iş yapabilme kapasitesi olarak tanımlanır. Mikrobiyoloji’de enerji, ısı enerjisi ölçüsü olan kilojul (kJ)birimiileifadeedilir. • E n e r j i a ç ı ğ a ç ı k a r a n b u ; p t e p k i m e l e r e EKZERGONİK’;r. • Mikrobiyal hücre için ekzergonik tepkimeler enerji sağlarken, endergonik tepkimeler enerji gereksinir. Oksijen ve hidrojen atomlarının su oluşturmak üzere yeniden düzenlenmesi için öncelikle bu reaktantların kimyasal bağlarının kırılmasını gerek;rmektedir. Bağlarınkırılmasıiçinenerjiyeih;yaçvardır.Buenerji AKTİVASYONENERJİSİolarakadlandırılır. EnerjiveEnzim • Biyolojikkatalizörlereenzimadıverilir. • Enzimle katalizlenen bir tepkimede enzim ile substrat (S) geçici olarak bir araya gelir ve enzim-substrat kompleksi oluşur. Reaksiyon sonucunda oluşan ürün (P) enzimden ayrılırveenzim(E)başlangıçtakidurumunageridöner: E+S↔E—S↔E+P • Enzim üzerinde substraTn bağlandığı kısım enzimin akVf bölgesiolarakisimlendirilmektedir. • Enzimlerinçoğuproteinyapısındadır.Herproteinözgül,üç boyutlubirşeklesahip;r. EnerjiveEnzim • Birçok enzim, kataliz işlemine kaTlan ancak protein yapısında olmayan küçük moleküller içerir. Enzim ile birlikteişgörenbuküçükmoleküllerenzimileortaklık kurma şekillerine göre iki sınıfa ayrılırlar: prosteAk gruplarvekoenzimler. • ProsteVk gruplar enzimlerine kovalent bağlarla ve daimi olarak sıkıca bağlanmışlardır. Sitokromlarda bulunanhemgrubuproste;kgruplaraaitbirörnek;r. • Koenzimler ise enzimlerine gevşek olarak bağlanır ve tekbirkoenzimmolekülübirkaçfarklıenzimileilişkiye girebilir.Koenzimlerinçoğuvitaminlerintürevleridir. EnerjiveEnzim • Oksidasyon, bir bileşikten elektron (veya elektronların) uzaklaşErılmasıdır. • Redüksiyon ise, bir bileşiğe elektron (veya elektronlar) eklenmesiolaraktanımlanır. • Biyokimyadaki oksidasyon ve redüksiyonlar sadece elektron aktarımını değil, elektron (e–) ve protonların (H+) birlikte aktarımınıiçermektedir. • Redoks tepkimeleri, elektron vericisinden açığa çıkan elektronların elektron alıcısı taraandan alındığı durumlarda gerçekleşir. • H2+½O2→H2O • Bu ;p tepkimelerde oksitlenen bileşik (bu örnekte H2) elektron vericisi, redüklenen bileşik (bu örnekte O2) ise elektronalıcısıolarakadlandırılır. Elektrontaşıyıcıları • Elektrontaşıyıcılarıikisınıfaayrılır: serbestçe difüze olabilenler (koenzimler) ve sitoplazmik zardaki enzimlere sıkıca tutunmuş olanlar (prosteVk gruplar) • Difüze olabilen taşıyıcılar, nikoVnamid adenin d i n ü k l e o V d ( N A D + ) v e N A D - f o s f a t ( N A D P + ) koenzimleridir.NAD+veNADP+hemelektron,hemdeH+ taşıyıcılarıdırvebirseferde2e–ve2H+aktarırlar. • Redoks tepkimelerinde açığa çıkan kimyasal enerji, fosforlanmış bileşikler ve özellikle de ATP halinde korunur. Elektrontaşıyıcıları • Bu tür maddelere enerji-açısından zengin maddeler denir; çünkü fosfat bağının hidrolizi ile açığa çıkan potansiyel enerji, hücredeki normal bir kovalent bağınhidroliziileaçığaçıkanpotansiyelenerjidençok dahafazladır. • AdenozinTrifosfat(ATP) • Hücrelerde enerji-açısından zengin en önemli fosfat bileşiği adenozin trifosfat (ATP) dır. ATP, adenozin ribonükleosidine bağlanmış üç fosfat molekülü içermektedir. ATP; ekzergonik tepkimeler sırasında oluşturulan ve belirli endergonik tepkimelerde tükeVlenenönemlihücreselenerjikaynağıdır. Elektrontaşıyıcıları KoenzimA • Hücreler enerji açısından zengin fosfat bileşiklerine ek olarak, ekzergonik tepkimelerde açığa çıkan enerjiyi koruyabilen diğer bileşikleri de üre;rler. Bunlar koenzim A türevleridir. (örneğin ase;l-CoA). • Koenzim A türevleri ;oester bağları içerir. Bunların hidrolizi, enerjiaçısındanzenginfosfatbağınınsentezinigerçekleş;rmeye yetecekmiktardaserbestenerjisağlar. • Örneğin: • Ase;l-S-CoA + H2O + ADP + Pi → asetat– + HS-CoA + ATP + H+ tepkimesinde, koenzimA molekülünün hidrolizinden açığa çıkan enerjiATPsenteziilekorunur. Elektrontaşıyıcıları • Büyümekte olan bir hücrede ATP konsantrasyonu oldukçadüşükolup,yaklaşık2milimolar(mM)kadardır. • Mikroorganizmalar uzun-dönemli enerji deposu olarak oksitlenebilen ve suda çözünmeyen polimerler üre;r ve bunlarıdahasonraATPüre;miiçinkullanırlar. • Prokaryotlardaki uzun-dönemli enerji depolarına örnek olarak, glukoz polimeri olan glikojen, lipid polimeri olan poli-β-hidroksibü;rat ve diğer polihidroksialkanoatlar ve birçok kükürt kemolitotrofu taraandan depolanan elementerkükürtverilebilir. • Ökaryo;k mikroorganizmalardaki en temel depo maddeleri,glukozpolimeriolannişasta,yadalipiddir. EnerjininKorunması • Kemoorganotroflardaenerjininsaklanmasıileilgiliiki mekanizmavardır:fermentasyonvesolunum. • Her iki mekanizmada da, ATP sentezi oksidasyonredüksiyon tepkimelerinden açığa çıkan enerji ile sürdürülür. • Fermentasyondaki redoks süreci, eksojen elektron alıcılarınınyokluğundagerçekleşir. • Solunumda ise, son elektron alıcısı olarak moleküler oksijenyadadiğerelektronalıcılarıbulunur. EnerjiÜreVmYolları • Fermentasyonda substrat düzeyinde fosforilasyon ile ATP üre;lir.BusüreçtekiATPsentezi,organikbirbileşiğinyıkım basamaklarısırasındagerçekleş;rilir. • OksidaVf fosforilasyon sırasındaki ATP sentezi proton mo;vegüçvarlığındagerçekleşir. • ATPsentezininüçüncübirşekliolanfotofosforilasyonolup, fototrofikorganizmalardasözkonusudur. • Fotofosforilasyonun temel mekanizması oksida;f fosforilasyona benzemekle birlikte, fotofosforilasyondaki proton mo;ve gücü oluşturan redoks tepkimeleri, bir kimyasalbileşiktaraandandeğil,ışıktaraandansürdürülür. I.GLİKOLİZ • Fermentasyonda enerji, substrat-düzeyinde fosforilasyon ile korunmaktadır. Glukozun fermentasyonu için yaygın olan biyokimyasal yol, aynı zamanda keşfedicisinin adı olan Embden-Meyerhof yolu olarak da isimlendirilen glikolizdir. • Glikoliz oksijen içermeyen bir süreç olup, üç temel evre içerir. Bu evrelerin her biri ayrı enzimler taraandan katalizlenenenzima;ktepkimeserileriiçerir. • Glikolizin I. Evresi, oksidasyonredüksiyon içermeyen, enerjiaçığaçıkarmayan,glukozdan2molekülgliseraldehit 3-fosfat oluşumuna yol açan, hazırlık tepkimeleridir. Bu evredeglukoz,ATPtaraandanfosforileedilirveglukoz6fosfat oluşur. Glukoz 6-fosfat daha sonra izomerik formu olanfruktoz6-fosfatadönüştürülür. I.GLİKOLİZ • IIEvredeoksidasyon-redüksiyontepkimeleriyeralır,enerji ATPşeklindekorunurveikimolekülpiruvatoluşur. • III. Evrede ise, bir kez daha oksidasyon-redüksiyon tepkimelerigerçekleşirvefermentasyonürünlerioluşur. • Glikolizin ilk redoks tepkimesi II. evrede, gliseraldehit 3fosfaTn 1,3-bifosfogliserik aside dönüşümü sırasında cereyan eder. Bu tepkimeyi katalizleyen gliseraldehit 3fosfat dehidrogenaz enzimi koenzim olarak NAD+ içerir ve NADHoluşturmaküzere2e–ve2H+alır. I.GLİKOLİZ • ATPsentezi:(1)herbir1,3-bifosfogliserikasitmolekülü3fosfogliserik aside dönüştüğünde ve (2) her bir fosfoenolpiruvat molekülü piruvata dönüştüğünde gerçekleşir. • Glikolizin I. evresinde glukozun fosforile edildiği iki basamakta2molekülATPharcanır, • II. Evre tepkimeleri sırasında ise dört molekül ATP sentezlenir (piruvata dönüştürülen her bir 1,3bifosfogliserikasi@enikiadetolmaküzere). • Dolayısıyla, glikoliz sürecinde organizmanın net kazancı fermente olan her glukoz molekülü başına iki molekül ATP’dir. Fermentasyon • Fermentasyon, eksojen (dış) elektron alıcısı yokluğunda cereyanederveoldukçaazmiktardaenerjiaçığaçıkarır. • Bukadarazmiktardaenerjininaçığaçıkmasıoksidasyonredüksiyon tepkimelerinin prensiplerine dayanarak açıklanablir: • (1)başlangıçbileşiğindekikarbonatomlarısadecekısmen oksitlenmektedir • (2) birincil elektron vericisi ile son elektron alıcısının redüksiyonpotansiyelleriarasındakifarkküçüktür. • Buna karşılık, eğer ortamda O2 ya da başka bir son elektron alıcısı varsa, glukoz molekülü tamamen CO2’e oksitlenir ve ATP verimi çok daha yüksek olur. Son elektron alıcısının O2 olması halinde, bu ;p oksidasyon aerobiksolunumolarakadlandırılır. ELEKTRONTAŞIYICILARI • Elektron taşıma sistemleri zara-bağlı elektron taşıyıcılarıdır.Busistemlerinikitemelişlevivardır. 1. Elektron taşıma sistemleri elektronların birincil vericidensonalıcıyaaktarımınaaracılıkederler. 2. Elektron aktarımı sırasında açığa çıkan enerjinin bir kısmınıATPsenteziilekorurlar. • Elektron aktarımı için çeşitli oksidasyon-redüksiyon enzimleri gereklidir. Bunlar arasında NADH dehidrogenaz, flavoproteinler, demir-kükürt proteinlerivesitokromlaryeralmaktadır. ELEKTRONTAŞIYICILARI • NADH dehidrogenazlar; Sitoplazmik zarın iç yüzeyine bağlanmış proteinlerdir. Bunlar NADH’ın bağlandığı ak;f bölge içerir. Bu bölge 2e– ve 2H+ kabul eder. Böylece NADH, NAD+ ye dönüşür. Daha sonra bu 2e– ve2H+,flavoproteinlereaktarılır. • Flavoproteinler, riboflavin türevleri içeren proteinlerdir.Proteinebağlıolanflavinkısmı,hidrojen atomlarını aldığında indirgenen ve elektronları aktardığı zaman oksitlenen proste;k bir gruptur. Flavoproteinlerin 2e– ve 2H+ kazanırken, sadece elektronlarıverirler. • Sitokromlar; Proste;k grup olarak demir içeren porfirin halkasına (hem) sahip proteinlerdir. Sitokromlardakihemgrubundayeralandemiratomu, tek bir elektron kazanır ya da kaybeder. Sitokrom bu şekildeoksidasyonaveredüksiyonauğrar: Sitokrom—Fe+2Sitokrom—Fe+3+e– • Sitokromlar içerdikleri hem grubunun ;pine bağlı olarak, sitokrom a, sitokrom b, sitokrom c olarak adlandırılırlar. • Demir-kükürt proteinleri; Bu proteinler, demir ve kükürtatomlarındanoluşmuşbirkümeiçerir.Bunların enyaygınolanlarıFe2S2veFe4S4(Ikümeleridir. • Kinonlar, protein-içermeyen ve hidrofobik özellikte olanelektrontaşımazinciriüyeleridir.Flavoproteinler gibi kinonlar da, 2e– + 2H+ alır; fakat zincirde kendilerinden bir sonra yer alan taşıyıcıya sadece elektronlarıaktarırlar. ProtonMoVveGüç:Kemiosmoz • Elektron aktarımı sırasındaki ATP sentezi, oksidaAf fosforilasyonsüreciilegerçekleşir.ATP’ninüre;lmesi zarın iki yüzeyi arasında ortaya çıkan proton moVve güç(pmf)ilebağlanTlıdır. • NADHgibibirmoleküldenuzaklaşTrılanikielektronveikiproton özgül taşıyıcılar aracılığıyla zincirin başından sonuna doğru taşınırlar. Bu sırada protonlar hücre dışına pompalanır (Gramnega;f prokaryotlarda protonlar periplazmaya pompalanır). Protonlarındışarıyaçıkışı,zarındışyüzeyininnispetenasidikhale gelmesinenedenolur. • Elektronlar, elektron taşıma zincirinin sonunda son elektron alıcısınaaktarılırlar.Aerobiksolunumyapanorganizmalardason elektron alıcısı O2’dir. Böylece oksijen suya indirgenmiş olur. O2’ninH2O’yaindirgenmesiiçin,reaksiyonutamamlamakadına sitoplazmadaki protonlara gerek vardır. Bu protonlar su molekülününH+veOH–vermeküzeredisosiyeolmasıylaoluşur. • H+’larhemO2’ninH2O’yaindirgenmesindekullanıldığı,hemde hücredışınapompalandıklarıiçin,zarıniçtaraandaOH–birikir. • KüçükboyutluolmalarınarağmenneH+nedeOH–zardandifüze olabilir; çünkü her ikisi de elektriksel olarak yüklüdür. Dolayısıyla,kendiliğindendengeyeulaşılmasımümkünolmaz. • Elektron taşınmasının net sonucunu, zarın iki yüzeyi arasında hem pH gradiyenA hem de elektrokimyasal potansiyelortayaçıkarmaktadır. • Zarıniçyüzeyinega;felektrikyüklüvebazikhalegelirken, dışyüzeyielektrikselolarakpozi;fveasidik;r. • Bu pH gradiyen; ve elektrokimyasal potansiyel (ikisi bir arada proton moAve güç olarak isimlendirilir) zarın bir batarya gibi enerji yüklü hale gelmesine neden olur. Ortaya çıkan elektriksel enerjinin bir kısmı hücre taraandanATPşeklindekorunur. • KemiozmoAk teori, fermentasyon hariç her türlü enerji metabolizmasının açıklanmasında çok önemli katkı sağlamışTr. Bu teori, Bacteria, Archaea ve Eukarya’nın tümündegerçekleşir. • Proton i;ci gücü ATP molekülüne dönüştüren katalizör, zarda yerleşmiş büyük bir kompleks olan ATP sentaz enzimidir. • ATPazlar iki ana kısım içerir: F1 olarak adlandırılan ve zarın sitoplazmik taraanda yerleşmiş olan çoklu alt üniteye sahip baş kısım ve Fo olarak adlandırılan ve zarı boydanboyakatederekprotongeçişineolanaksağlayan kanalkısmı.F1/Fokompleksi,ATPileADP+Piarasındaki tersinir tepkimeyi katalizler. ATPaz proteinlerinin yapısı tümcanlıdomeynlerindekorunmuştur. • F1kısmı;beşfarklıpolipep;dden o l u ş a n α 3 β 3 γ εδ ko m p l eks i halindedir. F1, ADP + Pi’ın ATP’ye dönüşümünden sorumlu olankataliVkkompleksVr. • Fo, zara gömülü olup, ab2c12 k o m p l e k s i h a l i n d e ü ç ; p polipep;;d içermektedir. a alt birimi, protonları zarın içine doğru kanalize ederken, iki adet baltbirimizardandışarıyadoğru birçıkınTyaparveδaltbirimiile birliktestatoruoluşturur. • Protonlar içeri girdikçe proton mo;ve güçün ortadan kalkması ATP sentezini mümkün kılar. A T P a z ’ ı n e t k i s i g e r i dönüşüm lüdür ; yani, AT P hidrolizi proton moVve güç oluşumunayolaçar. II.SolunumdaKarbonAkışı:SitrikAsitDöngüsü • Glikolizdeki anahtar ara-ürün piruvat’dır. Piruvat molekülü fermentasyon sürecinde indirgenir ve fermentasyon son ürünlerine dönüştürülür (Tüm fermentasyon ürünleri pirüva@an oluşur), solunum sırasında ise tamamen CO2’ye oksitlenir. Piruvahn tümüyle CO2’e oksitlendiği ana yol birçokorganizmadayeralansitrikasitdöngüsü’dür. • Fermentasyonda açığa çıkan elektronlar piruvaT indirgemek için kullanıldığı halde, solunum sürecinde açığa çıkan elektronlar elektron taşıma zinciri aracılığıyla NADH’dan oksijeneveyadiğersonelektronalıcılarınakadaraktarılır. • Dolayısıyla, fermentasyonun aksine, solunumda bir elektron alıcısının bulunması nedeniyle glukoz tamamen CO2’e oksitlenirveoldukçayüksekenerjikazancısağlanır.Alkolikya da lak;k asit fermentasyonunda her bir glukoz başına 2ATP üre;lirken, solunum süreci sonunda bir glukoz molekülü başınatoplam30-32ATPüre;lir. 30-32 ATP • Oksijenli solunum, aerobik solunum olarak da bilinir. OrganikbesinlerinOksijenyoluylayakılarakATPeldeetme işidir. • Hücrede besinlerdeki kimyasal enerjinin oksijen kullanarak açığaçıkarılmasıdemek;r. • Üçşekildeincelenir: Glikoliz(sitoplazmada) Krebsdevri(mitokondride) Elektrontaşımasistemi(mitokondride) • HücreselSolunum OksijenliSolunum;Glikoliz→Krebsdöngüsü→ETS sonelektronalıcısıO2 OksijensizSolunum;sonelektronalıcısıSO43−&NO3−,sülfürvb. • ArkelerdemetanojenlersonelektronalıcısıCO2,ase;kasitgibi.. • Glikoliz→AlkolfermantasyonuveyaLak;kasitfermantasyonu • Sitrik asit döngüsünde pirüva@an oluşan aseVl-CoA, yağ asidibiyosenteziiçingerekliolanbaşlangıçmateryaliolarak görev yapar. Dolayısıyla, sitrik asit döngüsü hücrede; biyoenerje%kvebiyosente%krolüstlenir. • AnaerobikSolunum • Solunumla enerji üre;minin bir başka alterna;fi, oksijenden başka elektron alıcılarının kullanıldığı solunumdur. Bu süreç anaerobik solunum olarak adlandırılır. Anaerobik solunumda kullanılan elektron alıcılarındanbazılarınitrat(NO3–),ferrikdemir(Fe3+),sülfat (SO42–), karbonat (CO32–), ve bazı organik bileşiklerdir. Elektronkulesindekipozisyonlarındandolayı,oksijenyerine bu elektron alıcılarının kullanılması halinde, daha az enerji açığaçıkar. Kemolitotrofi • Elektron vericisi olarak inorganik kimyasalları kullanabilen organizmalar kemolitotroflar olarak isimlendirilmektedir. • Bu ;p metabolizmada görev alan elektron vericileri arasında hidrojen sülfit (H2S), hidrojen gazı (H2), ferrus demir(Fe+2)veamonyak(NH3)yeralır. • Kemolitotrof metabolizma ;pik olarak aerobik;r; fakat organik elektron vericisinin değil inorganik elektron vericisininoksidasyonuilebaşlar • Kemoorganotroflar, karbon kaynağı olarak organik maddeleri(glukoz,asetat,vb)kullanırlar.Bununtersine, kemolitotroflar karbon kaynağı olarak karbon dioksit (CO2)kullanırlar,vebuyüzdenototrofturlar. Fototrofi; • Çok sayıda mikroorganizma fototrof olup, fotosentez içinenerjikaynağıolarakışığıkullanır. • Fotofosforilasyon olarak isimlendirilen işlemle gerçekleşecek olan ATP sentezinde kullanılabilecek protonmo;vegüçoluşturulur. • Karbon dioksit biyosentez için karbon kaynağı görevi yapar. Bu gruptaki organizmalar fotoototroflar olarak adlandırılır. • Bazı fototroflar ise karbon kaynağı olarak organik bileşikleri, enerji kaynağı olarak da ışığı kullanırlar. Bu gruptakiorganizmalarfotoheterotroflardır. • İki farklı fotosentez ;pi vardır: oksijenli ve oksijensiz. Siyanobakteriler ve bunların akrabaları taraandan gerçekleş;rilen oksijenli fotosentez yüksek bitkilerdekine benzerlikgösterirveO2oluşumunasebepolur. • Oksijensizfotosentezisemorveyeşilbakterilerdebulunanve O2üre;lmeyenoldukçabasitbirformdur. • Elektronlar ister organik ya da inorganik bileşiklerin oksidasyonundan, isterse fototrofik süreçlerden gelsin, zar aracılığı ile gerçekleşen biyoenerje;k proseslerde bu elektronların tümü zara-bağlı elektron taşıma zincirinden geçerler. Bu arada, proton mo;ve güç oluştururlar. Bütün bu durumlarda enerjinin korunması ATPaz ak;vitesi aracılığıyla gerçekleşir. Kemoorganotrof ve kemolitotrof organizmalarda oksida;f fosforilasyon, fototroflarda ise fotofosforilasyon söz konusudur. • Anabolizma için gerekli olan enerji ATP’den ya da proton iVci güçtensağlanır. • KataboliktepkimelersırasındaaçığaçıkanveATPyadaproton i;ci güç şeklinde korunan enerji, monomer sentezi ve makromolekülleri oluşturmak üzere monomerlerin polimerizasyonusırasındakolaycatüke;lebilir. • Hücredekienerjininbüyükkısmıproteinvenükleikasitsentezi içinharcanır.Lipidvepolisakkaritsenteziiçinnispetenazenerji gerekir. BÖLÜM 6 MİKROBİYALÜREME • Mikrobiyolojide kullanılan gelişme terimi hücre sayısındakiarEşanlamınagelir. • Prokaryotlarınçoğunda,hücrebüyümesihücreniniki yenihücreyebölünmesinekadardevameder. • Escherichia coli gibi çubuk-şeklindeki bir bakterinin üremekte olan kültüründe, hücreler kendi orijinal uzunluklarınınyaklaşıkikikaTnaçıkanakadaruzarlar ve daha sonra hücreyi iki kardeş hücreye ayıracak olanbölmeoluşturulur. • Birhücreninikihücreoluşturmaküzerebölünmesibir generasyonoluşumuolaraktanımlanır. • Bakterilerde bir generasyonun ortaya çıkması için gereken zaman oldukça değişkendir ve beslenme olanakları ile geneVk etmenlere bağlıdır. İdeal beslenme koşullarında, E. coli bakterisi yaklaşık 20 dakikadadöngüyütamamlayabilir. • Fts Proteinleri, Hücre Bölünme Düzlemi ve Hücre Morfolojisi • F t s p r o t e i n l e r i h ü c r e b ö l ü n m e s i n d e r o l oynamaktadırlar. • Fts; “Filamentous Temperature SensiVve (sıcaklığa duyarlıfilamentöz)”ifadesininkısaltmasıdır. • Escherichia coli ve diğer bakterilerde bu gruba ait üzerindeençokçalışmayapılmışolanproteinFtsZ’dir. • FtsZ-Vpi proteinler mitokondri ve kloroplastlarda da bulunur. Bu durum bu organellerin Bacteria ile evrimsel bağlanT içinde olduklarını ortaya koymaktadır. FtsZ proteininin ökaryo;k hücre bölünmesinde önemli bir görev yapan tubulin ile yapısalbenzerliktaşımasıdailginçbirbulgudur. • Fts proteinleri birbirleri ile etkileşerek hücrede divizom olarak isimlendirilen bölünme aparaTnı oluştururlar. • Çubuk-şeklindeki hücrelerde divizom oluşumu, FtsZ moleküllerinin hücre silindirinin tam ortasına rastlayan kısmındaki halkaya bağlanması ile başlar. Sonuçtabukısımhücrebölünmedüzlemihalinegelir. • Escherichia coli hücrelerinde yaklaşık 10,000 FtsZ molekülü halkaoluşturacakşekildepolimerizeolurvedahasonrabu halka FtsA ve ZipA dahil olmak üzere diğer hücre bölünme proteinleriniçeker. • FtsA, pek çok proteinin divizom’da bir araya gelmesi için enerjisağlayanATP-hidrolizenzimidir. • ZipA ise FtsZ halkasını sıkıca sitoplazmik zara bağlayan bir çapagibiişgörür. • Divizom, FtsI gibi pep;doglikan sentezinde gerekli olan Fts proteinlerini de içerir. FtsI, penisilin-bağlanma proteini olarak da isimlendirilir; çünkü bu proteinin ak;vitesi penisilinan;biyo;ğitaraandanengellenir. • Hücreninuzunluğuorijinalboyununikimislineçıkanakadar herikiyönedoğrugerçekleşenyenisitoplazmikzarvehücre duvarımateryalininsentezidivizomtaraandandüzenlenir. DNAReplikasyonuveHücreBölünmesi • DNAreplikasyonuFtsZhalkasıoluşmadanöncegerçekleşir. DNAsentezinindurması,FtsZhalkasınınoluşumuiçinbir sinyaloluşturur. • Halka, duplike olmuş nükleoidler arasındaki boşlukta ortayaçıkar.FtsZproteinininhücrenintamortanoktasına yerleşmesineMinproteinleriolarakisimlendirilenbirseri protein,özellikledeMinCveMinE,yardımcıolur. • MinC, hücrenin tam merkezi bulunana kadar FtsZ halka oluşumunuengelleyenhücrebölünmeinhibitörüdür.MinE ise MinC ak;vitesini inhibe eder ve hücre merkezine bağlanır. Bu olay FtsZ eksikliğinin giderilmesini ve divizom’unbaşlamasınıte;kler. • Hücrenin boyu uzadıkça, kromozomun iki kopyası birbirinden uzaklaşır ve her biri yeni hücrelerden birinegeçer. • FtsK adı verilen Fts proteini ve başka bazı proteinler busüreceyardımcıolur.Daralma(büzülme)meydana geldikçe, FtsZ halkası depolimerize olmaya başlar ve hücre duvarı materyalinin içeriye doğru büyümesini te;kler.Sonuçtakardeşhücrelerbirbirindenayrılır. • FtsZ guanosin trifosfat (GTP) molekülünü hidroliz edecek enzima;k ak;viteye sahip olduğu için, hem FtsZ’nin polimerizasyon ve depolimerizasyonu hem debunuizleyenFtsZhalkasınınkurulmasıveyıkılması içingereklienerjiyisağlar. HücreŞekliveProkaryotlardakiAkVnBenzeri Proteinler • Prokaryotlarda; hücre şeklinin belirlenmesinde özgül proteinlerin rol oynadığı, pepVdoglikanın ise oldukça küçük bir role sahip olduğu açıklık kazanmışTr. İlginç olan nokta, şekil belirleyen bu proteinlerin ökaryo;k hücrelerdeki hücre iskele;nin temel bileşeni olan akAn ile dikkate değer bir benzerliktaşımasıdır. • Prokaryo;k hücrelerin şeklini belirleyen temel proteinMreBolarakadlandırılır. • MreB, sitoplazmik zarın hemen alTnda hücre içeriğini çevreleyecek şekilde spiral-şekilli ipliksi bantlaroluşturur. • MreByapısındakihücreiskele;muhtemelensitoplazmik zar üzerine belirli bir güç uygulayarak, hücre şeklini belirlemektedir. • İlginç olan nokta, kok-benzeri bakterilerin hem MreB proteinini hem de bu proteini kodlayan geni taşımamalarıdır. • Bu da bakterinin aslında küre şekilli olduğunu göstermektedir. Küresel olmayan bakteri hücrelerinde MreB filamentlerinin farklı biçimlerde düzenlenişi muhtemelen çeşitli prokaryotların çubuk şeklindeki ve diğerhücremorfolojilerindensorumludur. PepVdoglikanSenteziveHücreBölünmesi • Hücre bölünmeden önce, yeni hücre duvarının sentezlenmesi gerekir. Duvar sentezinin en önemli aşaması yeni duvar materyalinin mevcut duvarın bütünlüğünübozmayacakşekildeeklenmesidir. • Otolizinler; FtsZ halkasından başlayarak, hücre duvarındaaçıklıklaroluşturur. • Otolizinler divizom protein kompleksinin içinde yer alırlar. Yeni hücre duvarı materyali daha sonra bu aralıklaraeklenir.Yeniveeskipep;doglikanınbirleşme yeri Gram-pozi;f Bacteria’nın hücre yüzeyinde yara izinebenzerbirkabarToluşturur. • Pep;doglikansentezindeyenihücreduvarıöncülerinin eklenme noktasında, pep;doglikan bütünlüğünü bozmamakiçineşgüdümlüolarakmevcutpep;doglikan tabakasına eklenmesi gerekmektedir. Eğer bu gerçekleşmezse hücre kendiliğinden erir. Bu olay otolizisolarakadlandırılır. • Büyüme sırasında yeni pep;doglikan tabakasının sentezi mevcut pep;doglikan tabakasının otolizinler taraandan kontrollü kesimini ve bununla eşzamanlı olarak pep;doglikan öncülerinin eklenmesini gerekli kılmaktadır.Baktoprenoladıverilenlipidtaşıyıcımolekül buişlemdeönemlibirroloynar. • Baktoprenol, pep;doglikan öncülü olan N-ase;l glukozamin/N-ase;l muramik asit/pentapep;d birimlerine bağlanan oldukça hidrofobik karakterde bir C55alkoldür. • Baktoprenol, pep;doglikan öncülerini yeterli düzeyde hidrofobik hale ge;rerek bunların sitoplazmik zardan aktarılmasını sağlar. Bu haliyle periplazmaya ulaşan baktoprenol,yenihücreduvarıöncülerinihücreduvarının büyümenoktasınaekleyecekveglikozidikbağoluşumunu katalizleyecekenzimlerleetkileşimegirer. • H ü c r e d u v a r ı s e n t e z i n i n s o n b a s a m a ğ ı transpepVdasyonolarakisimlendirilir. • Bu süreç, komşu glikan zincirlerindeki muramik asit reziduları arasında çapraz pep;d bağları kurulmasını gerek;rir. • Transpep;dasyon Tbbi açıdan önem taşır; çünkü penisilinan;biyo;ğibutepkimeyidurdurur.Dahaönce bahse}ğimiz FtsI proteini de dahil olmak üzere bazı penisilin bağlanma proteinlerinin Gram nega;f Bacteria’nınperiplazmasındabulunduğusaptanmışTr. • Bu proteinlere bağlanan penisilin bunların katali;k ak;vitesiniortadankaldırır.Yeniduvarsenteziolmadığı zaman, otolizinlerin ak;vitesinin devam etmesi sonucundahücreduvarızayıflarvehücreerir. • İki sebepten dolayı penisilin klinik Tp alanında yaygın olarakkullanılanbirilaçTr. • Birincisi,insanlarEukaryadomeynindeyeraldıklarıiçin hücrelerinde pep;doglikan tabakası bulunmaz; dolayısıylapenisilinyüksekdozlardauygulanabilir. • İkinci neden, hemen hemen tüm bakteriyel patojenler pep;doglikan içerdiklerinden ötürü penisilinin potansiyelhedefiolmalarıdır. • Gram-nega;f Bacteria’da (örneğin Escherichia coli) çapraz-bağbirpep;ddekidiaminopimelikasitilekomşu pepVddekiD-alaninarasındakurulur. • E.coli’dekiFtsIproteininintranspep;dasyoniçinönemli birproteinolduğudüşünülmektedir. • Gram-pozi;f Bacteria’da ise çapraz bağlar bir pep;d üzerindeki L-lizin ile diğer pepVd üzerindeki D-alanine glisinarasındaoluşur. • Özetle;Bakteriüremesisırasındakiduvarsentezimevcut hücre duvarı materyaline yeni glikan birimlerinin eklenmesiyle gerçekleşir. Duvarın büyüme noktasına eklenecek olan yeni glikan birimleri baktoprenol adı verilen hidrofobik alkol aracılığı ile sitoplazmik zar içinden taşınır. Duvar öncüllerinin pep;doglikana eklenmesitranspep;dasyontepkimesiilemümkünolur.
