İdrar Sediment İncelemesi-Otomatize İdrar

Clinica Chimica Acta 384 (2007) 28-34
İDRAR SEDİMENT İNCELEMESİ:
OTOMATİZE İDRAR ANALİZ SİSTEMLERİ
VE MANUEL MİKROSKOPİNİN
KARŞILAŞTIRILMASI
Tzu-I Chein, Jau-Tsuen Kao, Hui-Lan Liu, Po-Chang Lin, JhihSian Hong, Han-Peng Hsieh, Miao-Ju Chien
Çeviren
Dr.Naciye KILIÇARSLAN
ADÜTF BİYOKİMYA AD
Ocak 2007
GİRİŞ
•İdrar analizi, klinik uygulamada, serum kimyası
ve tam kan sayımından sonra kullanılan üçüncü
majör testtir.
•Doğru bir idrar incelemesi sonucu, hastanın
böbrek ve genitoüriner sistem durumunun ve
diğer vücut sistemlerinin izlenmesinde direkt bir
göstergedir.
•İdrar sedimentinin incelenmesi genellikle
santrifüj edilmiş idrarda ve eğitimli teknisyenlerce
yapılır.
•Manuel analiz uygulamaları standardize
edilmesine rağmen, idrar sedimentinin
geleneksel mikroskopisi, yoğun çalışma
gerektirir, zaman alıcıdır, kesin değildir ve geniş
bir değişkenlik gösterir.
•İdrar analizinin otomasyonu ve santrifüj
edilmemiş idrarın kullanımını kapsayan
çalışmalar, manuel analizdeki değişkenlikleri
azaltmıştır.
•Otomatize idrar analizi uygulaması, zaman ve iş
gücü tasarrufu sağlar ve iş yoğunluğu fazla olan
laboratuvarlar için daha uygundur.
•Manuel mikroskopiyi otomatize etmek için
halen, farklı teknolojileri kullanan iki sistem
vardır. Biri, partikülleri saptamak ve ayırmak
için önceden tanımlanmış partikül
büyüklüğünü esas alan video kamera
kullanan görüntü tabanlı analiz sistemidir.
Diğer tip, flow sitometri prensibine dayanır.
Her iki sistem, manuel mikroskopi ile
karşılaştırıldığında artmış kesinlik ve modele
sahiptirler.
•Bu çalışmanın amacı idrar sediment
testlerinde Sysmex UF-100 ve Iris iQ200
cihazlarının performansını değerlendirmek ve
manuel mikroskopi ile karşılaştırmaktır.
MATERYALLER VE METODLAR
Örnekler ve yapılan işlemler
Iris iQ200
Sysmex UF-100
Manuel mikroskopi
Kesinlik testleri
Sonuçların analizi
Örnekler ve yapılan işlemler
Sediment sonuçlarında geniş bir dağılımı sağlamak için,
Ulusal Taiwan Üniversite Hastanesi laboratuvarına tanı
amaçlı idrar analizi için gelen farklı anormallikleri
kapsayan 436 hastanın taze toplanmış idrarları ile
çalışıldı.
İdrar toplamak için temiz saklama kapları kullanıldı. Her
iki cihazla otomatize sediment testi yapıldıktan sonra,
kalan idrar örneği 1500 rpm’de (400g) 5 dakika santrifüj
edildi ve sediment, eğitimli teknisyenlere mikroskopi için
gönderildi. Tüm örnekler, alındıktan sonra 2 saat içinde
tamamen işlendi.
Iris iQ200
iQ200 cihazı 0.95 mL idrarı flow mikroskop içine alır. İdrar
örneğindeki elementler, hidrodinamik sıvı zarfı odaklama suretiyle
akım hücresinde bir düzlemde görüntülenir. Bir CCD dijital kamera
örnek başına 500 fotoğraf çeker. Analiz işlemcisi, oto partikül tanıma
(APR) yazılımı kullanarak partikülleri tanır ve sayar. Her görüntü
büyüklüğüne, şekline, kontras ve doku özelliklerine göre otomatik
olarak sınıflandırılır. Sonuçlar otomatik olarak 12 kategoride
gösterilir ve eritrosit, lökosit, lökosit kümeleri, hiyalin silendirler,
patolojik silendirler (veya sınıflandırılmayan silendirler), squamoz
epitelial hücreler, nonsquamoz epitelial hücreler, bakteriler, mayalar,
kristaller, mukus ve sperm konsantrasyonları kantitatif (nicel) olarak
rapor edilir. Sonuçlar, son rapordan önce tekrar gözden geçirilebilir
ve düzenlenebilir. Cihaz saatte 60 idrar analizi yapabilmektedir.
Sysmex UF-100
Örnekler iQ200 cihazı ile test edildikten sonra UF-100
cihazına manuel olarak transfer edildi. Raklar otomatik
olarak proba doğru hareket eder ve orada bir pipet
vasıtasıyla yaklaşık 0.8 mL idrar aspire edilir. Hücreler,
bakteriler ve silendirler, volüme göre elektriksel özdirenç
(empedans), büyüklüğe göre ileriye doğru ışık saçması,
çekirdek ve sitoplazmik karakteristiklerine göre floresan
boyanması vasıtasıyla ölçülür. Hücreler ve şekilli
elementler, büyüklük, şekil, volüm ve boyanma
karakteristikleri temelinde çok boyutlu alanda
sınıflandırılır. Sonuçlar, ekranda saçılım grafilerinde
gösterilir ve bir kopya sonuç elde edilebilir. İşleme
kapasitesi saatte 100 örnektir.
Manuel mikroskopi
7 mL iyi karıştırılmış idrar santrifüj edildi. Supernatant
(üst faz) döküldü, kalan 0.6 ml çökelti yeniden
süspansiyon haline getirildi ve S-Y lamının karelerinden
birine kapiller etki vasıtasıyla dolduruldu. Her lamda total
0.9 µL volüm için her biri 3x3x0.1 mm (0.9 mm3)
derinlikte olan 10 büyük kare vardır. Hücresel bileşenler
yerleşmeye bırakıldı ve ışık mikroskopisi ile incelendi.
Bir mikroskopik alanda görülen hücreler veya partikülleri
ilişkilendirebilmek için, bir ölçüm cetveliyle (scale) düşük
güç alan (LPF) ve yüksek güç alan (HPF) bölgeleri
belirlendi. Manuel mikroskopi sonuçları, 10/7 dilüsyon
faktörü ile çarpıldı.
Kesinlik testleri
Sonuçların tutarlılığını test etmek açısından, bir
çalışmada çalışma içi (within-run) tekrarlanabilirlik için 3
idrar havuzu düzeyi 20 kere analiz edildi.
Her ölçüm metodunun kesinliği, elde edilen yüzde
varyasyon katsayısı (CV) vasıtasıyla incelendi.
Çalışmalar arası (between-run) imprecision (kesin
olmama) için, her yapımcı tarafından sağlanan, idrarda
majör elementlerin büyüklüklerini taklit eden kalite
kontrol örnekleri kullanıldı. Bu örnekler, çalışma
süresince 20 ayrı günde analiz edildi ve her bileşen için
CV’ler hesaplandı.
Sonuçların analizi
Üç metodun karşılaştırılabilir elemanları, eritrosit, lökosit, epitelial
hücre, bakteri, maya, kristal, sperm ve mukus sayılarını kapsar.
Sayısal veri toplanması, çizelge haline getirilmesi, grafikler ve
regresyon analizleri için Microsoft Excel elektronik çizelgesi
kullanıldı. Yöntemler arası uyum, Bland ve Altman metodu
vasıtasıyla incelendi. Metodlar arası farkın anlamlılığını test etmek
için 2-kuyruklu Student t-testi kullanıldı. p<0.05 olması halinde
sonuçlar anlamlı kabul edildi.
Üç metoddaki bakteri, maya, kristal, sperm ve mukus sayılarının
performansını karşılaştırmak için metodlar arası sınıflandırma
sistemleri arasındaki farklılıklar veri analizinden önce aynı ölçeklere
çevrildi.
İdrar sediment sonuçları, 1 derece farkı içindeyse uyumlu kabul
edildi ve 3 sistem arasında ikili gruplar halinde uyum oranı, en
uygun çizgiden ±1 derece içindeki sonuçların yüzdesi olarak
tanımlandı.
SONUÇLAR
Otomatize cihazlar ve manuel mikroskopi
kullanarak eritrositler, lökositler, epitelial hücreler
ve bakterilerin tespiti için çalışma içi (within-run)
tekrarlanabilirlik tablo 1’de gösterilmiştir.
Üç sistem küçük
partikül sayılarında
büyük CV’lere sahip
olma eğiliminde olsa
da genelde, manuel
idrar analizi,
otomatize
sistemlerden daha
yüksek çalışma içi
CV göstermektedir.
2 otomatize cihaz ve manuel mikroskopi arasında
majör elementler lökosit, eritrosit ve epitelial
hücre sonuçlarının lineer regresyon çizgisi tablo
2’de listelenmiştir.
Metodlar arasında,
epitelial hücre
sayıları hariç
0.935-0.968 r
değerlerine
dayanan iyi bir
uyum vardı.
Epitelial hücreler
için farklı
sistemlerle ölçülen
değerler zayıf
olarak korele idi
(r=0.888-0.922).
Tüm sistemlerin Bland-Altman grafikleri şekil 13’de gösterilmiştir.
Şekil 1. Lökosit sayıları için
Bland-Altman grafikleri
Şekil 2. Eritrosit sayıları için
Bland-Altman grafikleri
Şekil 3.Epitel sayıları için
Bland-Altman grafikleri
Grafik, artan epitelial
hücre sayılarıyla,
iQ200 ve UF-100 için
manuel metoddan
daha yüksek sonuçlar
eğilimi göstermektedir
İkili gruplar halinde 3 metodun bakteri, maya,
kristal, sperm ve mukus sayıları için, farklı analitik
sistemlerin uyumunu gösteren 1 derece içinde
fark oranı tablo 3’de özetlenmiştir.
İdrarda kristal için, iQ200 ve manuel mikroskopi
daha iyi uyum göstermiştir (%96.0).
3 metod arasında bakteri ve maya sonuçları tablo 4-5’de
listelenmiştir. Açık gölgelenmiş alan bir derece içindeki
farklılıkları, koyu alan aynı derecedeki uyumlulukları
gösterir.
Tablo 4. Bakteri sonuçları
Tablo 5. Maya sonuçları
Bakteri sayıları, 3 metod
arasında büyük farklılık
göstermektedir. iQ200’den
oldukça çok örnek, ışık
mikroskobu incelemesi
vasıtasıyla bakteri pozitif
bulundu. Diğer taraftan,
manuel mikroskopi
incelemesinden daha
pozitif örnekler UF-100
vasıtasıyla bulundu.
Silendirler için UF-100’de 26 ve iQ200’de 15
örnek pozitif sonuç, fakat manuel mikroskopide
negatif sonuç verdi. Karşıt olarak UF-100’de 6
ve iQ200’de 13 idrar örneği negatif, manuel
mikroskopide pozitif sonuç verdi. Bu, UF-100’ün
silendirler için, diğer 2 sistemden daha sık
olarak pozitif sonuç verme eğilimini gösterir
(veriler gösterilmemiştir).
TARTIŞMA
Otomatize idrar analiz sistemleri, laboratuara
yüksek işlem hacmi, çalışma ve bakımda en az
tıbbi teknisyen gereğini sağlar. Bu sistemler,
tamamen integre edilmiş kimyasal ve mikroskopik
idrar analiz yeri sağlamak için, bir reagent strip
kimya analizörüne bağlanabilirler.
Bu çalışmada iki otomatize cihaz ve manuel
mikroskopi performansları değerlendirilmiştir.
Otomatize idrar analiz sistemlerin her ikisi,
manuel mikroskopiden daha fazla kabul edilebilir
kesinlik ve doğruluk göstermiştir.
Linko ve ark, iQ200 CV’sini gün içinde %4.3 ve günler
arasında %23.9; yüksek pozitif havuz ve düşük pozitif
havuz için sırasıyla %6.93 ve %34.4 bildirmişlerdir. Aynı
cihazlar için Lamchiagdhase ve ark, çalışmalar arası
eritrosit CV’sini negatif kontrol için %61.6 ve pozitif kontrol
için %6.4 olarak bildirmişlerdir.
Ottiger ve Huber tarafından, UF-100’ün deney arası
imprecisionu, CV’ler ile eritrosit için %4.8 ve lökosit için
%2.1 olarak bildirilmiştir. Bununla birlikte Ben-Ezra ve ark,
UF-100 cihazında, eritrosit için CV’yi çalışma içi %1.1-38
ve çalışmalar arası %2.7-6; lökosit için CV’yi çalışma içi
%2.3-24 ve çalışmalar arası %4.9-27 bildirmişlerdir.
Bu çalışmadaki otomatize idrar analiz
sistemlerinin imprecision verileri, diğer raporlarla
benzerdir ve manuel mikroskopiden daha iyidir.
Santrifugasyon ve volüm ölçümü gibi birçok
faktör, manuel mikroskopinin imprecisionu ile
ilişkili olabilir. Bakteri sayımı için manuel
mikroskopide negatif, 1+, 2+, 3+, 4+ şeklinde
sırasal (ordinal) sonuç ölçeği (scale) kullanıldı,
bu yüzden CV’yi tanımlamak ve diğer iki
otomatize cihazla elde edilen nicel (kantitatif)
sonuçlarla karşılaştırma yapmak zor olmuştur.
Eritrosit ve lökosit sayımı için, UF-100 sistem ile
manuel mikroskopi arasında korelasyon
(karşılıklı ilişki) daha iyi idi. Ottiger ve Hubber
UF100’ü KOVA sistem ile karşılaştırmıştır.
Korelasyon katsayıları eritrosit için 0.966 ve
lökosit için 0.935 idi.
iQ200 ile görsel (visuel) mikroskopi arasında
eritrosit ve lökosit sayıları için iyi korelasyonlar
vardı. Linko ve ark, eritrosit, lökosit ve epitelial
hücreler bulunmasında manuel mikroskopi ile
iQ200’ü karşılaştırdılar. Korelasyon sonuçları,
eritrositler için 0.948, lökositler için 0.978 ve
epitelial hücreler için 0.927 idi.
Bu çalışmada 2 otomatize sistem ve manuel mikroskopi arasında
istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulunmamasına rağmen, BlandAltman grafiklerden (şekil 1 ve 2) görülebileceği gibi, UF-100 sistem
vasıtasıyla eritrositler ve lökositler hafifçe daha fazla ölçüldü.
Şekil 1. Lökosit sayıları
için Bland-Altman
grafikleri
Şekil 2. Eritrosit sayıları
için Bland-Altman
grafikleri
Daha yüksek eritrosit ve lökosit seviyelerinde, iQ200 sistem ile elde
edilen eritrosit ve lökositler manuel mikroskopiden daha çok olma
eğilimindedirler (şekil 1 ve 2). Benzer bulgular rapor edilmiştir.
Şekil 1. Lökosit sayıları
için Bland-Altman
grafikleri
Şekil 2. Eritrosit sayıları
için Bland-Altman
grafikleri
Bu hücresel bileşenler için UF-100 ve manuel metodlar arasında iyi
uyuma karşın UF-100 cihazı, daha fazla eritrosit, lökosit ve epitelial
hücre bulmuştur. Bu olasılıkla santrifüjün yetersiz olması veya manuel
saymada hatalar yüzündendir, çünkü iki otomatize sistem arasında iyi
uyum vardır ve aralarında istatistiksel olarak anlamlı bir fark
bulunmamıştır.
Şekil 1. Lökosit sayıları
için Bland-Altman
grafikleri
Şekil 2. Eritrosit sayıları
için Bland-Altman
grafikleri
Ottiger ve Hubber, çalışılan örneklerin
%12’sinde eritrosit ve bazı örneklerde hem
eritrosit hem lökositlerin UF-100 ile yanlış
sınıflandırıldığını ve bunun da yanlış sonuçlarda
artışa sebep olduğunu rapor etmişlerdir.
Langlois ve ark, UF-100’ün eritrositi daha fazla
saymasının ya kristal ya maya hücre sayısı
yüksekliğine bağlı olduğuna dikkat çekmişlerdir.
Wah ve ark, eritrosit, lökosit ve epitelial hücreler
için, iQ200 sistem ve Fuchs-Rosenthal sayma
odaları kullanarak manuel hücre sayımı
arasında iyi korelasyon olduğunu, bununla
birlikte iQ200’ün manuel metodlara göre daha
az hücre tanımladığını rapor etmişlerdir.
Eritrosit ve lökosit sayıları açısından UF-100 ile
iQ200 sistemleri arasında daha iyi korelasyon
gözlenmekle birlikte, iQ200 sistem ile manuel
mikroskopi arasında epitelial hücreler için daha
iyi korelasyon bulunmuştur. İki otomatize sistem
arasında epitelial hücreler için 0.888 korelasyon
katsayısı gözlendi; aynı zamanda iki otomatize
sistem arasında istatistiksel olarak anlamlı bir
fark vardı (p=0.01).
UF-100 sistem, şekil 3’teki
Bland-Altman grafiğinden
görülebileceği gibi, manuel
mikroskopiye oranla daha
fazla epitel hücresi
tanımlamıştır.
Manuel metoda,
santrifügasyon, üstteki sulu
kısmı çökeltiden ayırma ve
çökeltiyi tekrar
suspansiyonlaştırma
adımları ya yetersizdir ya
da hücrelerin kaybına ve
parçalanmasına yol
açmıştır.
Ben-Ezra ve ark, proteinin, yanlış olarak yüksek
epitelial hücre sayısı sonucunu veren lökosit
kümeleri için en olası neden olduğunu
belirtmişlerdir. 3 sistem arasında düşük korelasyona
neden olan bir başka olasılık, idrarda düşük epitelial
hücre sayısıdır. Epitelial hücre sayısı daha yüksek
değerde idrar örnekleri kullanılırsa korelasyon
düzelebilir.
Bakteri sayıları üç metod arasında büyük farklılık
göstermiştir. UF-100 ve manuel mikroskopik
inceleme, diğerlerinden daha iyi korelasyon
göstermiştir (%92). Parlak ışık mikroskopisi ile
incelemede, iQ200 ve UF-100 sistem ile olandan
daha çok örnek bakteri pozitif bulundu.
Toffaletti ve ark, bakterilerin 2 floresan boya ile
boyandığı ve flow sitometri vasıtasıyla analiz edildiği
IRIS900UDx ile UF-100 karşılaştırıldığında bakteri
sayısı açısından büyük oranda farklılıklar olduğunu
göstermişlerdir. Tıbbi teknisyenler tarafından,
otomatize iQ200’ün basiller dışında küçük kok
görüntülerini bakteri olarak yorumlamak zordur.
Hem Lamchiagdhase ve ark hem Alves ve ark,
bakteri varlığında manuel mikroskopi ile doğrulama
gerektiğini ileri sürmüşlerdir.
Maya hücreleri için iQ200 sonuçları, daha yüksek
yalancı pozitif sayısı göstermiştir. Benzer sonuçlar
bildirilmiştir. iQ200’in diğer şekilli elemanları maya
hücreleri olarak saptadığı açıktır. Bu nedenle son
rapor onaylanmadan önce bellek görüntülerini
incelemek veya manuel mikroskopi vasıtasıyla
sonuçları doğrulamak gereklidir.
Longlois ve ark, UF-100’ün maya hücresi sayısında
daha fazla farklılık gösterdiğini ve sıklıkla yalancı
pozitif olduğunu rapor etmişlerdir. Onlar, pozitif UF100 maya hücrelerinin daima mikroskopik inceleme
gerektirdiğini ileri sürdüler.
Bu çalışmada iQ200’de yanlış rapor edilen maya veya
kristaller çok sık olmasına rağmen, bu partiküller esas
partikülerin analizinde anahtar eleman değillerdir ve rutin
iQ200 raporlarında uygun eşikleri ayarlama suretiyle bertaraf
edilebilir.
Bazı idrar örneklerinin soğutulmasını takiben ara sıra üre
veya fosfat kristalleri gözlenebilecektir.
Silendirler, iki otomatize sistem vasıtasıyla zor ayırt
edilmektedir. Bu tüm otomatize idrar analizörlerinin
kısıtlamasıdır. Yine de UF-100, silendir, kristal ve bakteri
varlığında teknisyenlere onların varlığını ve mikroskopi
altında daha ileri karakterize etmek gerektiğini işaret eder.
Tekrar gözden geçirme oranı %26.7’dir (veriler
gösterilmemiştir).
Trichomonas, UF-100 cihazı ile
tanımlanamamaktadır. Longlies ve ark, yanlış pozitif
UF-100 silendirli bazı örneklerde Trichomonas
bulunduğunu, bunların ekranda tekrar gözden
geçirme işaretlerine neden olduğunu ve bu
örneklerin mikroskopik inceleme suretiyle
tanımlanabileceğini rapor etmişlerdir.
Lamchiogdhase ve ark, iQ200 sistem vasıtasıyla,
Trichomonas türlerinin ilk olarak nonsquamoz
epitelial hücreler olarak bildirildiğini rapor
etmişlerdir.
Bazen Trichomonaslar iQ200’de CDD dijital kamera
ile bir görüntü olarak belirmekle birlikte hareket
kaybı nedeni ile tanımlanmaları zordur.
İki otomatize idrar sediment analizöründe bazı
sınırlamalar olmasına rağmen kısıtlamayı azaltma,
otomatize sonuçları eritrosite karşı gizli kan, lökosite
karşı lökosit esteraz, silendire karşı protein ve
bakteriye karşı nitrit gibi stript verileri ile çapraz
karşılaştırma suretiyle başarılabilir.
Özet olarak; iki otomatize idrar analiz
sistemi, idrar sediment incelemesinde
birbiriyle iyi korelasyon göstermiştir. Bu
yüzden, idrarın kimyasal analizi ile
birleştirildiğinde bu analizörler, rutin idrar
analizlerinde hızlı ve doğru tarama aracı
sağlayabilirler. İdrar sediment incelemesinin
otomasyonu; farklı personelden kaynaklanan
farkı azaltabilir, manuel gözden geçirme
oranını azaltır ve manuel mikroskopiye
benzer sonuçlar verir.