Spektral Teknikler Ders - İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi
advertisement
BİYOKİMYADA SPEKTROSKOPİK TEKNİKLER M.Koray GÜMÜŞTAŞ, İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, Fatih-İSTANBUL Işık, Madde ve Radyan Enerjinin Özellikleri. Işık elektromanyetik bir enerjidir ve büyük bir hıza sahiptir. Biz görünür ışığı gözle, infrared ışınları-UV ışınları ise ısı şeklinde algılarız. Işın yayan bu elektromanyetik enerjinin bir dalga boyu ( λ, nm) ve saniyede tekrar etme sayısı olan bir frekansı ( ν ) söz konusudur. Bu özellikler ışık hızıyla orantılıdır. c : ışık hızı (vakum ortamında, 33x1010m / sn) λ : dalga boyu (nm , 10-9 m) ν : Frekans (saniyedeki siklüs / döngü) C V= Yayılan ışın enerjisi en küçük bileşen olarak foton dediğimiz taneciklerden oluşmuştur. Fotonların enerjisi tamamen yayılan ışığın frekansına (ν) veya dalga boyuna (λ) bağlıdır. Fotonun enerjisi (E) ve frekansı arasındaki ilişki aşağıdaki gibi formüllendirilir. E = hν veya E= E = Enerji (erg) h ; Plank Sabiti (6.62x1027 erg.sn) hc Bu formülden anlaşılacağı gibi, kısa dalga boylarında fotonlar yüksek dalga boyuyla kıyaslandığında, daha yüksek enerjiye sahiptirler. Elektromanyetik spektrumun geniş alanları ve dalga boyu ile ilişkisi aşağıda tablodaki gibidir. Dalga Boyu (nm) Gamma Işınları X Işınları 0,1 1 Ultraviole Bölge(UV) 180 Görünür Bölge Kızıl ötesi Mikrodalga (IR) Bölge 390 Tablo I: Elektromanyetik Spektrumunda Başlangıç Değerleri 780 400x103 Güneş ışığı veya tungsten filamandan yayımlanan ışın değişik dalga boylarının karışımı olan ve beyaz renkli olarak gördüğümüz bir enerjidir. Bu görünür bölgedeki ışının absorblanan ve yansıtılan renkleri ayrıldığında aşağıdaki dalga boylarına göre dizilim oluşur. Şekil 1: Dalga boylarına göre frekanslar ve ışık tayfı Buna göre tanımlanan ışık 430-480 nm mavi bölgede absorbsiyon yapan bir çözeltiden geçirilirse diğer renkleri geçirir ve gözümüze sarı gözükür. Bundan dolayı sarı rengin, mavinin tamamlayıcı rengi olduğu kabul edilir. İnsan gözü 390-780 nm dalga boyu aralığındaki ışıklara tepki verip değerlendirme yaparken, laboratuvar aletleri daha düşük dalga boylarından UV ve büyük dalga boylarında örneğin kızıl ötesi (IR) bölgede ölçüm yapabilmektedir. Şekil 2: Absorbansların dalga boyları ve tamamlayıcı renkleri. Işığın Madde ile Etkileşimi: Bir foton bir atomla, iyonla veya molekülle etkileştiğinde eklenen bir uyarılma enerjisi söz konusudur ve uyarılma enerjisi dalga boyuna bağlı olarak molekülde bazı değişimlere neden olur ki bu değişimler aşağıdaki tabloda toplanmıştır. Işık dalga boyu (nm=10-6m) Işığın türü Maddeyle etkileşimi 0,1> 1> 180> 390> 780> 400x103> 100 cm> Gamma X1 Işım Ultraviole Görünür bölge Kızılötesi (Infrared) Mikrodalga Radyo dalga Çekirdeksel geçiş olayları İç kabuk elektronik geçiş İyonizasyon Valens Elektronlarda uyarım Kovalent bağlarda titreşim Dönme ve elektron spin Çekirdek Spin uyarımı Tablo II: Uyarım enerjisine bağlı çekirdek ve elektron olayları. Yukarıdaki tablodan da görüldüğü gibi uyarılma dalga boyu kısaldıkça molekülün kovalent bağlarından başlayarak dönme ve titreşimler, daha sonra elektronik geçişler ve en son yüksek enerjili uyarılmalarda çekirdek olaylarına kadar değişimler gözlenmektedir. Burada enerjinin olduğu kadar moleküle özgü bağların karekteristikleri de absorplamada önemlidir. Bu nedenle bir çok molekül sahip oldukları bağlardan dolayı farklı elektronik absorpsiyon Bu bantlar molekülün kalitatif tanımlanmasında önemlidir. Şekil 3: Elektronik Geçişlerin Enerji Seviyeleri ve Etkileri Bunun gibi elektromanyetik ışığın madde ile etkileşimi yalnız absorpsiyon veya emisyon olarak değil, çoğu zamanda ışığın kırılması, yansıması (refraktometri), saçılması (nefelometri), polarizasyonu (polarimetri), veya elektron koparılması veya farklı ışın oluşumuyla da sonuçlanabilir. Bunlar daha sonra tek tek inceleyeceğimiz yöntemlerin prensiplerini oluşturacaktır. Bu bölümde sıkça kullanılacak olan “spektrum” kelimesi şöyle tarif edilebilir. Elektromanyetik ışının madde ile etkileşmesi sonucu, şiddetlerindeki azalmanın yada maddenin saçtığı yeni ışınların şiddetlerini elektromanyetik ışığın dalga boyuna, sayısına ya da frekansına karşı çizilen değişim eğrilerine spektrum denir. Foton ile uyarılma 10-8 sn gibi kısa zamanda olmakta, uyarılan elektronların büyük kısmı, kısa sürü içerisinde temel hale dönüp, tekrar uyarılmakta ve sürekli soğurma bu şekilde oluşmaktadır. Soğurma atomal düzeyde ise (örn. Sodyum Soğurması) soğurma bandı keskindir ve belirgin frekanslardadır. Yani o atama özgündür. Buna atomal soğurma denir. Fotonların uyarılma enerjisi yalnız elektron uyarımında kullanılır ve grafikte keskin pik oluşturur. Bu nedenle, E uyarma = E elektronik. Bir molekülün yapısında birden fazla atom ve bağ oluşumu söz konusu olduğundan foton enerjisi farklı uyarımlarda kullanılır ve toplam enerji bu uyarımların toplamıdır. Buna molekülsel soğurma denir ve genellikle grafiklerde yaygın bir pik oluşumu söz konusudur. Aşağıdaki şekillerde hem atomal hemde molekülsel soğurmaya örnek gösterilmiştir. E uyarma = E elektronik + E titreşim + E dönme + E vs. Şekil 5: 242 nm de molekülsel soğurma Şekil 4 :589 nm de maksimum sodyum soğurması ABSORPSİYON SPEKTROSKOPİSİ Bir çözeltiden belli dalga boyunda elektromanyetik ışık geçirildiğinde çıkan ışığın şiddetinde bir azalma olur. Burada giren ışık şiddeti Io , çıkan ışık şiddeti I ise, I/Io oranı Transmittans olarak adlandırılır. Genellikle yüzde transmittans kullanıldığından → Tranmitans (T) = I / Io Transmittans (%T) = 100 x T olarak ifade edilir. Transmittans ölçümleri, çözeltinin farklı konsantrasyonları için yapıldığında lineer olmayan hiperbolik bir eğri çıkar. Böyle bir eğride hesap zorluğu göz önüne alınarak, %Transmittans ın eksi logaritması alınarak, Absorbans (optik densite) dediğimiz, lineer bir ifadeye dönüştürülür. Absorbans (A) = - log O / Io = A = log 1 / T x %100 %100 - logT = log 1 / T = log %100 %T A = log %100 - log % T A = 2 - log % T Bu nedenle Absorbans Skalası 0 - 2.0 arası değişir. Absorbans, Lambert-Beer kanunu ile matematik olarak en iyi ifade edilmiştir. Buna göre Absorbans, çözeltinin karakteristikleri, ışık yolu ve çözeltinin konsantrasyonu ile lineer ilişkilidir. Transmittans ise logaritmik (hiperbolik) bir grafik ilişkisi gösterir. Şekil 6: Absorbans-konsantrasyon grafiği A = ε . l .c Şekil 7: Transmittans-konsantrasyon grafiği A; Absorbans (optik densite) ε; Ekstingsiyon katsayısı, molar absorptivite (cm / mol) l; ışık yolu (cm) c; konsantrasyon (mol / L) Bu ifadeyle, absorbans ölçümüyle çözeltideki analitlerin kantitatif analizi mümkündür. Lambert-Beer kanunun çalışma sınırları vardır. Aşağıdaki kurallara uyulması gereklidir. 1) Konsantrasyon C < 10-2 M olması uygundur (Kurulma indeksi minimumdur). 2) Absorpsiyon sonucu tanecik, çözgenle etkileşmemelidir (Stabil komplex oluşumu gereklidir). 3) Gelen ışın monokromatik olmalıdır. (Net dalga boyunda). 4) Tanecik büyüklüğü önemlidir (Saçılmaların en aza indirilmesi). Tek Işık Yollu Spektrofotometreler Tek ışık yollu spektrofotometrenin temel bileşenleri şematik olarak aşağıdaki şekilde gösterilmiştir. Bunda bir ışık kaynağı giriş yarığından geçtikten sonra bir monokromatör tarafından uygun dalga boylarına ayrılır. Daha sonra uygun dalga boyundaki ışık çıkış yarığından absorbsiyon hücresine (küvet) düşürülür.Radyant enerjinin bir bölümü çözeltinin doğasına ve konsantrasyonuna bağlı olarak bu küvette soğurulur. Soğurulmadan geçen ışık enerjisi dedektör tarafından algılanıp kaydedicide digital olarak sergilenir. Uygulamada reaktif körü içeren çözelti spektrofotometreye yerleştirilip sıfır absorbansa ayarlanır. Sonra sırasıyla varsa reaktif körü ve bilinmeyen çözeltilerin absorbans değerleri ölçülür. Kıyaslama yöntemiyle hesap yapılır Şekil 8: Klasik tek ışık yollu spektrofotometre. Çift Işık Yollu Spektrofotometreler. Aşağıda şematik olarak gösterilen çift ışık yollu spektrofotometrelerde tek kaynaktan üretilen ışık enerjisi dalga boyu ayarlayıcı bir sistemden geçtikten sonra bir ayna yardımıyla iki giriş yarığından iki özdeş aynı dalga boyunda çıkan ışınlar aynı örnek ve referans küvetine düşürülür. Işık şiddetindeki azalma aynı anda iki farklı dedektör tarafından algılanır. Kıyaslanan ışık enerjisi kaydedilip digital olarak sergilenir. Bu yolla dedektörün ışık kaynağındaki değişimleri ve duyarlılık değişiklikleri anında değerlendirmesi sayesinde güvenli bir okuma yapılmış olur. Şekil 9: Çift ışık yollu spektrofotometre Spektroskopi Aletlerinin Bileşenleri: Spektroskopi aletlerinin temel bileşenleri ve bunların farklı spektral tekniklere göre alternatifleri aşağıdaki gibi özetlenebilir. 1. Işık Kaynağı: Akkor lambaları olarak bilinen ışık kaynakları çalışılan dalga boyuna göre (ışın enerji şiddetine göre) farklılık göstermektedir. Genellikle görünür bölge spektrum ölçümlerinde tungsten lambası kullanılmaktadır. (370-780 nm) Tungsten flamentin ömrü, lambada düşük basınçlı iyodür ya da bromür buharının bulunması ile büyük ölçüde arttırılmaktadır. Geniş bir spektrum aralığında yüksek şiddette ışık sağlaması 2000-5000 çalışma saati gibi uzun ömre sahiptirler. 320 nm altında yeterli miktarda raydant enerji sağlayamadıklarından UV bölgesi spektrum ölçümlerinde genellikle döteryum veya hidrojen lambaları (190-370 nm) kullanılmaktadır. Burada döteryum lambası hidrojen lambasına göre daha kararlı olup uzun ömre sahiptir. Yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) dedektörlerinde boş-katot lambasıda kullanılmakta ve 214 nm de peptit bağı absobsiyonun maksimum dalga boyuna yeterince yakın (206 nm) bir çizgi vermekte ve peptit ve proteinlerinin ölçümlerinde sıklıkla kullanılmaktadır. Laserlerde spektrofotometreler için ışık kaynağı olarak kullanılabilir ve değişik frekanslardaki ışığı son derece şiddetli, odaklanmış ve hemen hemen hiç ayrılmayan monokromatik ışık hüzmesine transforma edebilirler. Yakın IR bölge laserleri galyum-arsenik materyalinden yapılmış katı hal cihazları olarak 1,5 V gibi düşük potansiyaldeki enerjiyi bu cihazlarda kullanılmaktadır. 2. Renk Ayırıcılar: Belli dalga boyunda ışığı üretmek için kullanılan bu ayırıcıların en basitleri filtrelerdir. Filtreler girişim filtreleri, renkli çözeltiler ve renkli camlardan oluşabilir. Bu filtreler net bir dalga boyu ayırımı değil belli dalga boyu aralığında (genellikle 50 nm gibi geniş bant) geçirgenliğe sahiptirler. Bu nedenle çok tercih edilmezler. Günümüzde en iyi renk ayırıcıları monokromotörlerdir. Bunlar cam, silika, kuarts gibi prizmalar yanında, optik ağ (grating) olarak bilinen pürüzlü yüzeyde ışığın dağılmasıyla oluşturulan farklı dalga boylarını içeren monokromatörler yaygın olarak kullanılır. Şekil 10: Renk ayırıcılar 3. Örnek Kapları (küvetler): Genellikle bir cm iç ışık yollu cam, silika, kuarts veya plastik türevi malzemeden yapılmış olabilir. Kare yada dikdörtgen prizma yapısında borosilikat cam küvetler görünür bölge spekrumlarının ölçülmesinde, bazı plastik hücreler ise hem görünür hem de UV bölgede yeterli berraklık gösterirler fakat organik çözücü tarafından lastiklerin etkilenebilir olması bazı problemlere de yol açabilir. Küvetlerin temiz olması alkalen çözeltilerde uzun süre bekletilmemesi hafif deterjanda asit, su ve etenol karışımında (1: 3: 4 oranında) bekletilmeleri temizlik için en uygun yöntemdir. Özellikle UV bölgede görülmeyen çizgiler ve parmak izleri dahi ölçümleri olumsuz etkileyebilmektedir. Şekil 11: Küvetlerin optik geçirgenlik özellikleri Şekil 12: (a) Standart (b) Küçük hacim std. Şekil 13: (a) Mikro (b) Akışkan tip 4. Silitler: Işığın monokromatör öncesi giriş siliti ve monokromatör sonrası çıkış siliti olmak üzere iki tip silit söz konusudur. Özellikle ikinci silitin bant genişliği monomkromatörden seçimli çıkan ışığın yönlendirilmesi açısından önemlidir. Bant genişliği arttırılması numuneye geçen enerjinin artışına sebep olsada eğer yeterli güç kaynağı söz konusu değilse spektral saflıkta bir düşüş söz konusu olabilir. Saçılımlı-grating tipi monokromatörlerde çıkış siliti genellikle sabit genişlikte ve sabit bant geçişine uygundur. Buna karşılık prizma tipi monokromatörlerde değişken tip çıkış silit kullanılır. Burada amaç ışın şiddetine göre spektral kaliteyi arttırmaktır. Filtreli fotometrelerde silitler başıboş saçılmaları azaltmak ve ışığı paralel yönlendirmek içinde kullanılır. 5. Dedektörler: Fotodedektörler ışığı foto duyarlı düzeye çarpan foton sayısı ile orantılı olarak elektrik sinyale dönüştüren cihazlardır. Spektrumun UV ve görünür bölgesindeki ışık şiddetinin ölçümünde sıklıkla kullanılırlar. Fotoçoğaltıcıkatlandırıcı tüpler fotodiyodlar ve yük kenetlenmiş dedektörler gibi tipleri söz konusudur. Fotoçoğaltıcıda katot olarak ışığa duyarlı materyalin yüzeye çarpan radyant enerji ile orantılı olarak ışığı soğuran ve elektromla yayan bir ışığa duyarlı bir metal içermektedir. Birinci evrede oluşan elektronlar ikinciyi evreye geçerek her bir elektron 4 ile 6 arasında elektron oluşturarak bir kaskat olayı başlatır. Bu yolla son akım başlangıç akımından 1 milyon kez şiddetli olabilir. Fotoçoğaltıcı tüplerde 10-15 arasında evre yada diyod mevcuttur. Fotodiyodlar ise her biri spesifik bir dalga boyuna yanıt veren iki boyutlu diyod array”in oluştuğunda aftodiyodarray olarak bilinmektedir. 200-340 Nm arasında 2 Nm’lik çözüm sağlayan ve 340-800 Nm arasında 1 Nm’lik çözüm sağlayan fotodiyodarraylar tasarlanmıştır. Tüm diyodlar 5 V yüklenir ve ışık aldıklarında yüklerini boşaltırlar (deşarj olurlar). Daha sonra her diyod sırasıyla taranır ve 5 volta tekrar yüklenir. Tekrar yükleme işlemi için gerekli olan enerji o diyoda giren ışığın miktarı ile orantılıdır. Yükle kenetlenmiş dedektörler, tiplerine göre daha iyi dinamik özellik ve sinyal-gürültü oranı gösteren çok kanallı cihazlardır. Bu katı-hal cihazların işleyişi, çok sayıda yatay ve dikey olarak nöbetleşe okunan bir dizi foto dedektör sayacına benzer. Çok düşük ışık düzeylerini algılama kapasiteleri nedeniyle, floresan moleküllerin çok düşük konsantrasyonlarının floresans ölçümlerinde kullanılmaktadırlar. Şekil14: Fotokatlandırıcılar Şekil 15: Fotodiyod dedektör IŞIN SAÇILMA SPEKTROSKOPİSİ Türbidimetri Işık saçılımı, ışığın çözelti içindeki tanecikler ile etkileşimi sonucuyla oluşan fiziksel bir olaydır. Saçılan ışık floresans yayılmadan farklı olarak, gelen ışık ile aynı frekanstadır. Türbidimetri saçılan ışığın ışık şiddetindeki azalmayı ölçen bir tekniktir. Cihaz dizaynı düşünüldüğünde çoğu zaman spektrofotometreye benzer. Fakat ölçüm küvetinde spektrofotometreden farklı olarak saçılmaya sebep olacak süspansiyon halindeki partikül söz konusudur. Bu nedenle bir ışık saçılım tekniği olan tirbidimetride analizlenen tanecik büyüklüğü dalga boyunun derecesi gözlem uzaklığı, gelen ışığın polarizasyonu taneciklerin konsantrasyonu, taneciklerin moleküler ağırlığı önem kazanmaktadır. Işık saçılımının konsantrasyon ve moleküler ağırlık arasında ilişkisi aşağıdaki formülde ifade edilebilir. = İs = Polarize ışıkla uyarılmış küçük taneciklerden saçılan ışık şiddeti Io = Gelen ışık şiddeti dn/dc = Çözgen kırma/refraktiv indeksinde, çözünmüş konsantrasyonundaki değişimine bağlı gözle değişim. M = Moleküler ağırlık (g/mL) C = Tanecik konsantrasyonu (g/mL) Ө = Gözlem açısı Na = Avogadro sayısı Λ = Gelen ışığın dalga boyu r = Işık saçılılımının dedektöre uzaklığı Tanımlanan bu formülden özellikle ışığın gelme yönünden farklı açıyla ölçüm yapan nefelometrelerde süspansiyon taneciğin konsantrasyonu ve molekül ağırlığı hakkında nicel ve nitel analiz yapmak mümkündür. Işık saçılımı tanecik büyüklüğü ve ışığın dalga boyundan etkilenmektedir. Buna göre üç tip temel saçılma aşağıdaki şekilde tanımlanmıştır. Küçük Partiküller - 900’de minimum olan simetrik ışık saçılması (Rayleigh) Çok Büyük Partiküller - Büyük oranda ileri ışık saçılması (Mie) Büyük Partiküller - Tercihen ileri ışık saçılması (Rayleigh-Debye) Şekil 16: Homojen bir çözeltide uyarım ışığı sonucu oluşan saçılmaya partikül büyüklüğünün etkisi Türbidimetride, spektrofotometrik ölçümdeki duyarlılığı sınırlayıcı etmenler yanında background saçılması ve körün olmamasından önemli derecede etkilenir ayrıca saçılmanın yeterli sinyal oluşturmaması da önemli bir dezavantajdır. Bu nedenle uygun dalga boyu, ışık şiddeti ve uygun konsantrasyonda partikül hazırlanması tayin zamanın iyi belirlenmesi önemlidir. Şematik olarak türbidimetri aşağıdaki şekilde gösterilmiştir. Nefelometride ise temel fark aşağıda şekillerde görüldüğü gibi ışığın gözleme (ölçüm) açılarıdır. a b Şekil 17: (a) Türbidimetri, (b) Nefolometrinin şematik diyagramı. (b)Nefelometre (a)Türbidimetre Geçen Işık Absorpsiyon Saçılma Kırılma Saçılma Kırılma Şekil 18: (a) Türbidimetre ve (b) Nefelometre ışığın gözleme açıları Nefelometri Spektroskopisi Türidimetride anlatılan saçılan ışık, tanecik büyüklüğü ve uygun dalga boyu seçimi nefelometri içinde geçerlidir. Aşağıdaki şemada görüldüğü gibi türbidimetriden farklı olarak nefelometride saçılan ışık, ışığın geldiği doğrultudan farklı açılarda (0-90o) ölçülmesi söz konusudur. Örnek Küveti Işık Kaynağı Optik Ağ Filtre Saçılan Işık Kapanı Şekil 19: Nefelometrenin temel bileşenlerinin şeması Dedektör Sinyal 300 nm ‘de protein ve 400-425 nm’de porfirin absorpsiyonu göz önüne alındığında genellikle nefelometrik analizlerde 320-380 nm ve 500-650 nm dalga boylarında cihazların ölçüm yapması uygundur. Dilüsyon yaparak protein konsantrasyonunun azaltılması antijen tayinlerinde yüksek affiniteli antikor kullanımı, duyarlılığı arttırıcı faktörlerdir. Bu yolla kinetik ve son nokta analizlerine hem türbidimetri hemde nefrelometri uygundur. En çok 250-1500 nm çapındaki antijen-antikor komplekslerinin belirtilmesinde günümüzde sıklıkla kullanılmaktadır. Refraktometre Spektroskopisi Işık az yoğun ortamdan çok yoğun ortama girdiğinde sınır yüzeyinde bir kırılmaya maruz kalır. Birinci ortamdaki hızı ile ikinci ortamdaki hızı arasındaki oran kırılma indeksi olarak tanımlanır. Havanın kırılma indeksi ise 1 kabul edilir. Kırılma indeksi, ışığın girdiği ortama dik kabul edilen normal çizgisine göre geliş açısı ve ikinci ortamda kırıldıktan sonra normal çizgisiyle yaptığı açıların oranı ile tanımlanır. Aşağıdaki şekilde ışığın kırılması şematize edilmiştir. Şekil 20: Işığın az yoğun ortamdan çok yoğun ortama doğru kırınımı. Sıvı çözgenlerde kırılma gelen ışığın dalga boyuna, sıcaklığına, sıvının özelliğine ve sıvıda çözünen analitlere bağlıdır. Eğer ilk üç tanımlanan faktör ölçümde sabitlenir ise kırılma indeksi çözgende çözünen analit konsantrasyonuyla ilişkilidir.Aşagıdaki eşitliklerden analitin konsantrasyon tayini yanında,molekül büyüklüğüde tayin edilebilir. n = c/v Sini / Sinr = V1 / V2 = n1 / n2 n: kırılma indisi, c: Işık hızı v: Işığın ortamdaki hızı V1: Işığın 1. ortamdaki hızı V2: Işığın 2. ortamdaki hızı n1: 1. ortamın kırılma indisi n2: 2. ortamın kırılma indisi R = (n2-1). M / (n2+2).d R: Lorentz-Lorenz molar kırılma indisi, M: Molekülün molar ağırlığı, d: yoğunluk Şekil 21: Tanımlanan bu ifadeden önce standart çözeltilerle daha sonra analizlenecek numunelerle yapılan tayinlerden proteinlerin elektrolitlerin ve küçük moleküllü organik yapıların birçok biyolojik sıvıda kantitatif analizin yapılması mümkündür. Bu amaçla sıklıkla kullanılan Abbe refraktometresi aşağıdaki şekilde gösterilmiştir. Polarimetri Düzlem-polarize ışığın optikçe aktif bileşikler üzerindeki etkisini ölçmek için kullanılan aygıtlardır. Bir polarimetri analizleyicisi herhangi bir polarlayıcıdan farklı değildir. Polarimetrinin tüpü boş veya optikçe aktif olmayan bir madde varsa, düzlem-polarize ışığın ve analizleyicinin ekseni cihaz sıfır dereceyi okuduğunda, tam olarak paralel olan ve gözlemci geçen ışığı maksimum algılayacaktır. Buna karşılık tüpte optikçe aktif bir madde varsa tüpten geçerken ışığın polarlanma düzlemi dönecektir. Işığın maksimum parlaklığını gözlemcinin görebilmesi için saat yelkovanı veya zıt yönünü alet eksenini çevirmek suretiyle maksimum ışık algılanabilecektir. İşte bu esnada çevirme derecesi α saat yelkovanı yönünde çevrime sonucunda elde edilmiş ise artı (+) derece olarak söylenir. Çevrilme saat yelkovanının tersinde ise çevrilme negatif (-) olarak söylenir. Düzlem polarize ışığı saat yelkovanı yönünde çeviren maddelere dekstrotatori ve saat yelkovanının yönünün tersi yönünde çeviren maddelere de levorotatori denir. Nicelik hesaplamasında aşağıdaki özgül çevirme açısı kullanılır. [α] = c.l [α] = + 3,120 [α] = özgül çevirme açısı, α = gözlenen çevirme açısı, c = g / mL cinsinden derişim l = desimetre cinsinden tüpün uzunluğu (1 dm = 10 cm), [α] = Sodyum D çizgisinin 589.6 nm ışık kaynağında ve 250C’de numunenin bir g/mL’si için özgül çevirme açısı Şekil 22: Polarimetrinin şematik görünüşü ve dönme açılarının gözlemlenmesi. Alev-Emisyon Spektrofotometrisi Birçok metal elementin atomlarına sıcak bir alevdeki gibi yeterli düzeyde enerji verildiğinde (yaklaştığında) elemente karakteristik olan dalga boylarında bu enerji yayılmaktadır (emisyon). Alev etkisiyle elektronlar tarafından belirli miktarda termal enerji soğurulmaktadır. Elektronlar bu yüksek enerji (uyarılmış)düzeyinde kararlı olmadıklarından, uyarılmış düzeyden temel düzeylerine geri dönerken, fazla enerjiyi belirli dalga boylarına karşılık gelen fotonlar olarak serbestleştirmektedirler. Bu geçiş olayları aşağıdaki şekilde gösterilmiştir. A+ + e - A + hν 0 A* A0 (Isı Uyarım) A* (Uyarılmış) A0 + hν (Ölçülen Işıma) Enerji eğer ışık olarak harcanıyorsa, bu ışık bir ya da daha fazla enerji düzeyine sahip olabilir ve dolayısıyla değişik dalga boylarında olabilir. Bu çizgi spektrumları her element için karakteristiktir. Örneğin sodyum, birincil olarak 589 nm’de enerji yayar (sarı ışıma). Bir elementin ölçümünde kullanılacak olan dalga boyunun seçimi, yeterli duyarlılığı verebilecek şiddette bir çizginin belirlenmesinin yanı sıra, seçilmiş ya da ona yakın dalga boylarında interferans yapabilecek çizgilerin bulunmaması gibi faktörlere bağlıdır. Bu teknik eskiden kullanılmakta idiysede, şimdilerde büyük ölçüde elektrokimyasal teknikler ve Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresi daha sık kullanılmaktadır. Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresi Atomik Absorbsiyon Spektrofotometresi (AA) periyodlar cetvelindeki birçok pozitif iyonun tayininde ve özellikle eser elementlerin tayininde hem tıpta hem sanayide yaygın olarak kullanılır. AA spektrofotometrisinde, element alevde çok fazla uyarılmamakta ve yalnızca kimyasal bağları çözülerek uyarılmamış, temel haline dönüştürülmektedir. (nötral atom). Böylece, nötral atom, kendi çizgi spektrumuna karşılık gelen radyasyonu soğurma açısından uygun olan düşük-enerji düzeyinde bulunmaktadır. Analiz edilecek materyal için spesifik dalga boyunda bir ışık üretmek amacıyla katotu aynı materyalden yapılmış, oyuk-katot lambası kullanılmaktadır. Bu şekilde, eğer katot sodyumdan yapılmışsa, lambadan çoğunlukla 589 nm’de sodyum ışığı yayılmaktadır. Lambadan çıkan ışık aleve girdiğinde, bir kısmı alevdeki temel-hal atomları tarafından soğurulmakta ve lambadan çıkan ışının şiddetinde net bir azalma oluşmaktadır. Bu karekteristik dalga boyundaki radyal enerjinin ışın şiddetindeki azalma, alevde uyarılmış atom sayısı ile yani tayin edilen analitin konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. Lambert-Beer kanuna uygun olarak ölçülen absorbsiyondan konsantrasyon hesap edilebilir. a) b) Şekil 25: a) Atomik absorbsiyon cihaz diyagramı b) Alev-Atomizör Bu işlem absorpsiyon spektrofotometrisine analogdur. Işık kaynağı olarak spesifik oyukkatot lambası kullanılmakta ve küvetteki örnek yerine alevde ısıtılan örnek geçmektedir. Alevin ışık yolu küvetin ışık yoluna analogdur. Önceden tanımlandığı gibi, alevdeki örneğe sadece küçük bir fraksiyonu emisyon enerjisine katkıda bulunmaktadır ve bunun sadece bir fraksiyonu detektöre iletilmektedir. Böylece, atomların çoğunluğu temel halde olup katot lambasından gelen ışığı soğurma kapasitesine sahiptirler. Genelde, AA yöntemleri alevemisyon yöntemlerine göre 100 kat daha duyarlıdırlar. Buna ek olarak, oyuk-katot lambasında üretilen ışık dalga boyunun emsalsiz özgünlüğüne bağlı olarak, bu yöntemler ölçülen elementler için yüksek özgünlük gösterirler. FLORESANS – FOSFORESANS SPEKTROSKOPİSİ ve KEMİLÜMİNESANS - 1667 R. Boyle ” Cool Light ” - 1877 Radziszewsky kimyasal maddelerle lüminesans oluşturmayı ilk başaran. - 1928 Albrecht Lüminol’ü H2O2 ile okside ederek, lüminesans oluşturmuştur. - II. Dünya Savaşında Japon askerler harita okumada Crustaceans ekstratı kullandı. - 1947 Ateş böceğinin lüminesansı “lüsiferaz” enzim katalizi ile. - 1952 Strehler - Totter “ ATP ” tayini - 1976 Schoeder “ Biyotin ” tayini. Neden Kemilüminesans ? FloresansPolarimetrik YAYIM ELISA * * 10-6 μg 10-9 nanog. RIA Kemilüminesans * * 10-12 pikog. 10-14 Fentog. Şekil 26 : Çeşitli tekniklerin tayin duyarlılık sınırları Işık enerjisinin küçük bir bölümünün bir molekül tarafından soğurulması bir elektronun temel durumdan mümkün olabilecek uyarılmış titreşimli düzeylere geçmesine neden olur. Uyarılmış düzeye geçen bir molekülün başlangıç durumuna dönmesi için bir çok alternatif söz konusudur. Bu geçişlere ilişkin olaylar sonucunda floresans ve fosforesans olayları oluşabilir. Temel halde iki elektron bir orbitalle karşıt spinli olarak yerleşmiştir. Bu duruma temel singlet hal (S) denir. Bu elektronlar ışın enerjisi ile uyarıldığında daha üst enerji seviyelerinde uyarılmış singlet halde yine zıt spinli bulunabileceği gibi, uyarılmış triplet hal (T) dediğimiz benzer spinde bulunma ihtimalide söz konusudur. Bu spin değişiklikleri aşağıda gösterilmiştir. Uyarılmış hal singlet Temel hal singlet Uyarılmış hal triplet Şekil 27: Uyarılmış moleküllerde singlet ve triplet konumu Bu farklı iki haldeki uyarılmış molekülün yayın biçimi de farklıdır. Ayrıca singlet-singlet geçişleri singlet-triplet (yada karşıtı) geçişlerinden çok daha kolaydır. Bu nedenle singlet-singlet geçişi kısa ömürlüdür ve floresans ışıması ile sonuçlanır. Buna karşılık triplet-singlet geçişleri daha uzun sürelidir ve fosforesans ışıması ile sonuçlanır. Bir moleküldeki uyarmalar ve bu uyarmaların hangi yollarla sonlandığı Jablonski diyagramı ile çizgilendirilmiştir. 4 S S 5 T 1 2 3 hν hν hν T hν 6 (Temel Hal) S Şekil 28: 1)Soğurma 2)Fluoresans 3)Dış dönüşüm 4)Titreşim geçişi 5)İç dönüşüm 6)Fosforesans geçişler Floresans-Fosforesansı Etkileyen Faktörler Biyomolekülün yapısal sertliği; Molekülsel dönüşümlerin sınırlandığı moleküler daha yüksek floresans özelliği gösterir. Sıcaklık; çarpışma sıklığını arttırır, iç dönüşüm yüksektir, floresansı azaltır. Vizkozite; Düşük viskozitede çarpışma sıklığı artar. Çözücü polaritesi; Polar çözgenlerde floresans, fosforesanstan daha yüksektir. pH; Uyarılma ile asid-baz disosiyasyon sabitleri çok farklanır. Florometrik Ölçüm Düzeneği Şekil 29: Florometre Ölçüm düzeneği Genellikle 250-600 nm ışık veren kaynaklar kullanılır. Ölçüm düzeneği spektrofotometreye benzemekle beraber ışık numuneye düştükten sonra geldiği doğrultudan 300-900 de ve belli dalga boyunda ışıma ile oluşan ışık değerlendirilir. Enzim amplifiye lüminesans yönteminde ışıma enzim aktivitesi ile ilişkili olarak dakikalarca sürebilir. Buna karşılık kemilüminesans yönteminde akridinium ester ışıması çok kısa bir an sürer (1 sn) ve flash patlamasına benzer bir ışıma olarak tanımlanır. Kısa sürede yüksek ölçüm verimliliği sağlar. Floresans-Fosforesans Enzimatik Ölçümü ile Biyomolekül Tayini En çok bilinen biyolojik lüminesans olayı ateş böceğinin oluşturduğu lüminesanstır. Bilinen bu enzimatik kataliz sonucu oluşan yöntem sayesinde biyolojik sıvılarda ATP tayini mümkün olmuştur. Bunun yanında çeşitli lüminesans özelliği olan kimyasal supstratlarla biyolojik önemi olan birçok enzimin duyarlı tayini de mümkün olabilmektedir. Enzim Antijen – Antikor üçlüsü kullanılarak, bunlardan herhangi birinin tayininin florometrik olarak yapılması da mümkündür. Tanımlanan reaksiyonlara ilişkin işlemler ve metotlar aşağıdaki şekillerde özetlenmiştir. 370C’de İnkübasyon Yıkama Substrat İlavesi ALP ile Reaksiyon (370C’ İnkubasyon) 5- Işıma, Okuma 1234- Şekil 30: Enzimatik lüminesans yöntemi ile serumda PSA tayini. Şekil 31: Dioksetan fosfat lüminesans maddesi ile ALP tayini. Şekil 32: ATP tayininde kullanılabilecek ateşböceği lüminesans modeli. Akridinyum Esterleri ile Lüminesans Oluşumu ve Avantajları Biyolojik sistemlerde, enzimler, antijenler, antikorlarla çalışmak bunların saf preparatlarının temininden gelen güçlüklerden dolayı kimyasal maddelerle lüminesans oluşturup bunların biyolojik tayinlerde kullanılması son yıllarda kabul gören yöntemlerdir. Bu yöntemler içerisinde akridinyum esterleri ile lüminesans oluşumu bazı otoanalizörlerin prensibini oluşturmakta hormon, antijen, antikor ve birçok biyolojik belirteç’in tayininde sıklıkla kullanılmaktadır. Akridinyum esterleri ile lüminesans oluşumu çok kısa sürede olmakta, çok az sayıda foton flash ölçümüyle tayin edilebilmekte, fentongram (10 -14) düzeyinde molekül tayinini mümkün kılmaktadır. Bu değer zahmetli RIA yöntemi ile kıyaslandığında çok büyük avantajlar sağlamaktadır. Yöntem katalizatör gerektirmeyen basit, kimyasal ve ışık oluşumu hızlı olan bir yöntemdir. Düşük background saçılma yanında sayım verimliliği yüksek bir yöntemdir. Ayrıca reaktifleri stabildir (birkaç yıla kadar) protein, polipeptit ve organik moleküllerle kolayca konjüge olup, traser oluşturabilmesi bakımından da avantajları vardır. Kemilüminesans yönteminde sıklıkla kullanılan akridinyum esterinin pH ve H2O2 katalizine dayanan ışıma reaksiyonu aşağıdaki gibidir. Şekil 33: pH ve H2O2 konsantrasyonuna bağımlı akridinium esterlerinin ışıması. Şekil 34: Bazı floresans veren moleküllerin yapıları
