GENETİK MARKÖRLER ve ANALİZ METODLARI Markör ü Çalışılan organizmadaki ilgilenilen diğer özelliklerin genetiği hakkında bilgi ü DNA nın aktif bölgelerinden veya herhangi bir genetik kodlama fonksiyonuna sahip olmayan DNA dizilerinden geliştirilebilirler. Genetik Markör ü Kalıtım şekilleri, morfolojik, biyokimyasal ve DNA düzeyinde izlenebilen karakterlere denir. Moleküler DNA markörleri tekniklerinin bitki ıslahına entegrasyonu n n n n n Arzulanan genlerin çeşitler veya türler arasındaki hareketini hızlandırmış Akraba yabani türlerden yeni genlerin aktarılmasına izin vermiş Kantitatif karakterlerin analizini mümkün kılmış Klonlama çalışmalarını kolaylaştırmış Birbiriyle çaprazlanmayan bitkiler arasındaki genetik ilişkileri açığa çıkarmıştır. Genetik markörlerin kullanım alanları n n n n Genetik haritaların hazırlanması Genetik parmak izi analizi Doğrudan gen etiketlenmesi Genlerin klonlanması Genetik markörlerle ilgili önemli kriterler n n n n n n n Polimorfizm Lokus sayısı Haritalar arasında transfer edilebilme Güvenilirlik Eş baskınlık Çevreden ve diğer lokuslardan etkilenme fenotipi etkileme n n n n Bütün dokularda gözlenebilme Allel sayısı Otomasyona uygunluk Genomdaki dağılım Genetik Markör tipi ve analiz metodları n n Morfolojik markörler Moleküler markörler 1. Protein markör 2. DNA markör Morphological Marker • Phenotypic markers • Naked eye marker hulled naked Black white Molecular markers Resolution power " Sequencing (SNPs) " Microsatellites (SSRs) " Multi-locus fingerprints (RFLP) " AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) " RAPD (random amplified polymorphic DNA) " allozymes (protein-electrophoresis) Proteins Markers Alloenzim: Birbirinden ayırt edilebilen allelleri bulunan enzimleri ifade etmektedir. Izoenzim: Farklı genler tarafından üretilen ancak birbirine çok benzeyen enzimleri ifade etmektedir. DNA Markörleri 1 ccacgcgtcc gtgaggactt gcaagcgccg cggatggtgg gctctgtggc tgggaacatg 61 ctgctgcgag ccgcttggag gcgggcgtcg ttggcggcta cctccttggc cctgggaagg 121 tcctcggtgc ccacccgggg actgcgcctg cgcgtgtaga tcatggcccc cattcgcctg 181 ttcactcaga ggcagaggca gtgctgcgac ctctctacat ggacgtacag gccaccactc 241 ctctggatcc cagagtgctt gatgccatgc tcccatacct tgtcaactac tatgggaacc 301 ctcattctcg gactcatgca tatggctggg agagcgaggc agccatggaa cgtgctcgcc 361 agcaagtagc atctctgatt ggagctgatc ctcgggagat cattttcact agtggagcta 421 ctgagtccaa caacatagca attaaggtag gaggagggat ggggatgttg tgtggccgac 481 agttgtgagg ggttgtggga agatggaagc cagaagcaaa aaagagggaa cctgacacta 541 tttctggctt cttgggttta gcgattagtg cccctctctc atttgaactc aactacccat 601 gtctccctag ttctttctct gcctttaaaa aaaaatgtgt ggaggacagc tttgtggag Gene A DNA M1 M2 MFG Gene B MFG AACCTGAAAAGTTACCCTTTAAAGGCTTAAGGAA AAAGGGTTTAACCAAGGAATTCCATCGGGAATTCCG DNA markörleri farklı genotiplere ait DNA nükleik asit diziliş farklılığını çeşitli şekillerde ortaya koyan markörlerdir. DNA Marker 1. DNA melez markörleri 2. PCR temeline dayalı markörler DNA melez markörleri RFLP Çeşitli şekillerde etiketlenmiş bir DNA parçasının araştırılan bir DNA örneğindeki benzer veya aynı dizilişteki DNA ya melezlenebilmesini baz almaktadır. Dokulardan izole edilen genomik DNA nın nükleik asit dizilişlerini tanıyan DNA kesim enzimlerince spesifik olarak kesilmesi ve prob DNA melezlendiği DNA etrafındaki farklı kesim yapılarının saptanması esasına dayanır. DNA/DNA Hybridization Denaturation Elevated temperature Restriction Fragment Length Polymorphism Known DNA sequence RFLP techniques RFLP Polymorphisms interpretation 1 2 3 4 5 6 MFG 1 2 3 4 5 6 Advantages and disadvantages • Avantaj – Türler arasında transferler mümkündür – Ko-dominant – Güvenilir • Dezavantajları – Zaman iş gücü gerekli – Pahalı – radioactive probes kullanımı Polymerase Chain Reaction DNA polimeraz enziminin kullanılmasıyla suni şartlartda DNA üretilmesini ifade etmektedir. Çoğaltılan DNA agaroz jel elektroforezinde yürütülür. PCR Based markers " Sequencing (SNPs) " Microsatellites (SSR) " AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) " RAPD (random amplified polymorphic DNA) RAPD Markers DNA lar kullanılarak genom üzerinde rasgele bölgelerin DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir. n n n n n Reaksiyon şartlarının spesifik olmaması rasgele çoğaltıma izin verir. Bir başlatıcı kullanılır. Kullanılan başlatıcının DNA üzerinde birbirine iki yakın bölgeye yapışabildiği genom bölgelerinin amplifikasyonu yapılır. DNA agaroz jel elektroforezinde bazı parçaların bazı genotipde üretilip bazılarında üretilmediği gözlenir. Bu işlem açılan bir populasyonda olursa ebeveynlere ait üretim motiflerine bakarak döllerin genotip analizi gerçekleştirilir. RAPD Avantaj: ü Çok hızlı sonuç ü Ucuz az iş gücü ü Az miktar ve düşük kalitede DNA ihtiyaç Dezavantaj: ü Güveniliriliği sınırlı ü Farklı lab da farklı sonuç vermesi ü Dominant özellikteki markör. Sorgum yerli çeşitlerinin RAPD Polymorphisms Sequences of 10mer RAPD primers RAPD gel configuration Name Sequence OP A08 OP A15 OP A 17 M OP A19 OP D02 5’ –GTGACGTAGG- 3’ 5’ –TTCCGAACCC- 3’ 5’ –GACCGCTTGT- 3’ 5’ –CAAACGTCGG- 3’ 5’ –GGACCCAACC- 3’ AFLP Markers ü RAPD tekniğinin dezavantajlarını gidermek için geliştirilmiştir. ü Genomik DNA önce birisi altı diğeri 4 taban tanıyan iki kesim enzimi tarafından kesilir. ü Kesilen parçaların ucuna nükleotid dizilişi sentetik olan DNA’ lar eklenir. ü Eklenen sentetik DNA nın nükleotid dizilişini de taşıyan başlatıcı DNA lar kullanımıyla nispeten spesifik DNA çoğaltımı yapılır. ü Ilk aşamada her iki uçdan DNA kesim enzimlerinin tanıdığı diziden sonraki ilk nükleotide göre seçici çoğaltimın yapıldığı ön üretim yapılır. ü Asıl üretimde ön üretimde elde edilen parçaların kullanımıyla kesim enzimi tanıma yerinden sonraki ikici ve üçüncü nükleotidler için seçim yapılır. ü Üretilen parçacıklar bir baz uzunluğu farklarını dahi ayırt edebilen poliakrilamid jel elektroforezinde AFLP Markers ü Polimorfizm oranı çok yüksektir. ü RFLP den daha hızlıdır ü Parmak izi analizine uygundur. ü Dominant markör verir.. ü Farklı genetik haritalar arasında transferi güçtür. SSR (Basit Dizi Tekrarları) SSR veya mikrosatellitler ökaryotik genomlar boyunca dağılmış bulunan ve ardışık olarak tekrarlanmakta olan 2-6 nükleotid gruplarından oluşmaktadır. Sequence ACTGTCGACACACACACACACGCTAGCT TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA Primer (AC)7 ACTGTCGACACACACACACACACGCTAGCT TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA (AC)8 ACTGTCGACACACACACACACACACACGCTAGCT TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA (AC)10 ACTGTCGACACACACACACACACACACACACGCTAGCT TGACAGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGATCGA (AC)12 SSR polymorphisms P1 AATCCGGACTAGCTTCTTCTTCTTCTTCTTTAGCGAATTAGG P2 AAGGTTATTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTAGGCTAGGCG P1 Gel configuration P2 SSR primerlerinin üretiminde genel olarak 3 farklı yaklaşım tercih edilmektedir. ü G e n o m i k D N A k ü t ü p h a n e l e r i n i n S S R oligonükleotidleriyle hibridizasyonu yoluyla gözlenmesi ü DNA veri bankalarından SSR ların araştırılması ü Akraba bitki türlerinde geliştirilmiş olan SSR spesifik primerlerinin kullanımıdır. Avantaj: SSR ü Yüksek oranda polimorfik ü Eş baskın markör ü PCR kolaylığı ü SSR lar bitki genomunda oldukça bol olup uniform dağılıma sahiptir. Dezavantaj: ü Yeni markörlerin geliştirilmesinin güçlüğü Genetic marker characteristics Characteristics Morphological markers Protein markers RFLP markers RAPD markers SSR markers Number of loci Limited Limited Almost unlimited Unlimited High Inheritance Dominant Codominant Codominant Dominant Codominant Positive features Visible Easy to detect Utilized before Quick assays the latest with many technologies markers were available Well distributed within the genome, many polymorphism Negative features Possibly negative linkage to other characters Possibly tissue specific Radioactivity requirements, rather expensive Long development of the markers, expensive High basic investment Co-dominant marker Gel configuration P1 P2 O1 O2 Polymorphism -Parent 1 : one band -Parent 2 : a smaller band -Offspring 1 : heterozygote = both bands -Offspring 2 : homozygote parent 1 Dominant marker Polymorphism Gel configuration Parent 1 : one band P1 P2 O1 O2 -Parent 2 : no band -Offspring 1 : homozygote parent 1 -Offspring 2 : ???? Desirable properties ü ü ü ü ü ü ü Polymorphic Co-dominant inheritance Occurs throughout the genome Reproducible Easy, fast and cheap to detect Selectivity neutral High resolution with large number of samples