9. DNA Dizi Analizi

DNA DİZİ ANALİZİ

DNA dizi analizi ya da "Sequencing" DNA'nin nükleotid
dizilerinin saptanması anlamına gelmektedir.

İlk yöntemler, proteinlerdeki aminoasit dizilerinin
saptanmasındakilere dayanıyordu.İlk dizi analizi,
1960'larin başında 75-80 nükleotid kapsayan küçük
tRNA'lar ile başlamıştır. Maya alanine tRNA molekülünün
1964'de dizi analizinin yapılması ile moleküler biyolojide
önemli bir adim atılmıştır. Ancak bunlar zor ve zaman
alıcı olduğu için farklı yöntemler geliştirilmiştir.

Prokaryotik organizmaların (bakteri), faj, virus ve
plasmidlerin DNA'larında bulunan Nükleotid dizilerinin
belirlenmesinde iki temel teknik geliştirilmiştir. Bunlar;
-Maxam-Gilbert kimyasal degradasyon yöntemi ile
-Sanger'in dideoksi enzimatik yöntemidir.

Sanger Metodu, Frederick Sanger (1975) tarafından
geliştirilmiş ve dideoksinukleotid olarak
adlandırılmıştır(enzimik metod). Bu metotla, Sanger,
küçük DNA fajlarından olan øX174 fajının 5386 baz
çiftinden (bp) oluşan genomunun nukleotid sıralarını
saptamıştır (sequencing).

Baz sıralarını saptamada diğer bir metod da A.M.Maxam
ve W.Gilbert'e (1977) aittir (kimyasal metod). Bu
araştırıcılar da SV40 virusunun baz sekanslarını
belirlemişlerdir (5226 bp). Greg Sutcliffe (1979), Gilbert'in
laboratuvarında aynı tekniği uygulayarak pBR322
plasmidinin baz sıralarını tespit etmiştir (4362 bp).

bu gün, DNA baz sıralarının saptanması, geliştirilen yeni
aletler yardımıyla otomatik olarak kolay, doğru ve kısa bir
süre için de (bir günde binlerce baz) yapılabilmektedir
(automatic DNA sequencing).



Sanger ve Maxam-Gilbert yönteminde üç ana
aşama bulunur. Bunlar;
dizi analizi yapilacak DNA'nin hazirlanmasi,
reaksiyonlar ve
yüksek voltaj jel elektroforezi

Her iki yöntemde de dizisi saptanacak DNA’ya
dört ayrı reaksiyon uygulanmaktadır(her baz için
bir tane)

Bu dört reaksiyonun ürünleri, bir nükleotit
uzunluğu kadar farklı, bir dizi DNA parçalarıdır.

Dört reaksiyonun ürünleri bir jelde dört ayrı
kuyucukta ayrıştırılmaktadır

Jel hattındaki her bir bant belirli bir baza karşılık
gelmektedir ve jeldeki bantlardan DNA
parçacığının dizisi okunabilmektedir.
SANGER METODU





Sanger metodunun prensibi tek zincirli DNA kalıbının
tamamlayıcı zincirinin DNA polimeraz enzimi ile 5’ den 3’
ne doğru sentezlenmesi işlemine dayanır.
Dizisi saptanacak olan DNA zinciri yeni sentezlenecek
DNA zinciri için kalıp olarak kullanılır
Sentez reaksiyonu DNA polimeraz I ile kataliz edilir
Kimyasal değişikliğe uğratılmış(modifiye)
dideoksinükleotit trifosfatlar kullanılarak bir dizi DNA
parçacıkları elde edilir
Dideoksinükleotit trifosfatlarda 3’- OH gurubu bulunmaz.
Bu durumda, molekül yeni sentezlenen DNA’ ya katılır
ancak 3’-OH grubu taşımadığı için kendisine nükleotit
ilave edemez ve zincir sentezi sonlanarak bir DNA
parçacığı elde edilir

DNA POLYMERASE I
dATP
dGTP
dCTP
dTTP
ddATP
3'
ddCTP
ddTTP
P
P
P
5'
O CH 2 O BASE
H
H H
H
H H
DIDEOXYNUCLEOTIDE (ddNTP)
ddGTP
REACTION
MIXTURES
C T G A C T T C G A C A A
GEL
ELECTROPHORESIS
LARGER
FRAGMENTS
ddG
AUTORADIOGRAPHY
TO DETECT
RADIOACTIVE BANDS
ddG
ddG
ddGTP

C T G A C T T C G A C A A
RADIOACTIVELY LABELED
3' T G T T
PRIMER
ddTTP

5'
ddATP

deneyde 4 reaksiyon karışımı
hazırlanır
Herbir reaksiyon karışımı kalıp
DNA zinciri(tekzincirli), bir primer,
DNA polimeraz, radyoaktif
trifosfatların dördü(4 nükleotit) ve
az miktarda dört tip
dideoksiribonükleozit
trifosfatlardan sadece birini içerir
Zincir sonlanması için dört
reaksiyon tüpünde farklı bir
dideoksinükleozit trifosfat bulunur
DNA polimeraz, arada
sırada,uzayan DNA zincirinin
yapısına nükleotitlerin yanı sıra
dideoksinükleotitleri de sokar.bu
nükleotit anoloğu 3’ hidroksil grubu
içermediği için bir sonraki nükleotit
ile 3’ bagı oluşturamaz ve bu
nedenle DNA sentezi sonlanır
Reaksiyonların herbirinde çok az
miktarda modifiye nükleozit
kullanıldığı için yeni zincir sentezi
rastgele sonlanarak, bir dizi DNA
parçacığı meydana gelir
ddCTP

SINGLE-STRANDED DNA
OF UNKNOWN SEQUENCE
PRODUCTS IN ddGTP REACTION
C
T
G
A
C
T
T
SMALLER
FRAGMENTS
C
G
READ SEQUENCE OF ORIGINAL
SINGLE-STRANDED DNA
(COMPLEMENT OF PRIMERGENERATED SEQUENCE LADDER)

Her bir tüpte uzunlukları birbirinden birer
nükleotit farklı olan, değişik uzunluklardaki DNA
molekülleri birikir.

Sentez sonrası, dört reaksiyondan elde edilen
radyoaktif DNA parçacıkları elektroforez jelinde
yan yana dört ayrı kuyucukta yürütülür

DNA bantları otoradyografi ile görüntülenir ve jel
aşağıdan yukarıya doğru okunarak nükleotit
dizisi saptanır
TGCAATCG…
TTCGTGAAG…
Maxam-Gilbert yöntemi






Dizisi saptanacak DNA parçacığının komplementer
zincirleri ayrılıp zincirlerden biri kullanılır.
Dizisi saptanacak zincir 5’- ucundan, polinükleotit kinaz
enzimi kullanılarak radyoaktif P32 ile işaretlenir. Bu
işaret, elektroforez sonrası belirli bir DNA parçacığının
tanınmasını sağlamaktadır
İşaretlenen DNA parçası dört örnek olarak bölünür
Dört ayrı tüpteki DNA örneğine, zinciri belirli
nükleotitlerden kıran dört ayrı kimyasal reaksiyon
uygulanır
Her tüpte farklı pozisyonlardaki hedef nükleotitlerden
kırılmış moleküller elde edilir
Sonuçta, kırıldığı noktaya göre hepsi 5’ ucundan işaretli
ancak boyları farklı bir dizi parçacık elde edilir.




DNA nın kırıldığı dört farlı reaksiyonda,
guaninden(G>A), adeninden(A>G), yalnız
sitozinden ve timinden(C+T) kırılma olur
Bu reaksiyonlarda, purinlerin kırılmasında
dimetilsülfat kimyasalı kullanılır
Bu reaktif, adenine göre guanini daha etkin
olarak metiller ve ısı uygulandığında zincir
metillenmiş bölgeden kırılır. Bu durumda daha
çok guaninden zincir kırılması gerçekleşir(G>A)
Asit ortamda ise bunun tersine adeninden kırılan
zincirler daha fazladır(A>G)



Primidinlerin kırılma reaksiyonunda hidrazin
kullanılır
Hidrazin DNA’ yı hem sitozin hemde timinden
kırar. Ancak yüksek tuz derişiminde(2M NaCl)
yalnız sitozin reaksiyona girer.
Böylece iki reaksiyondan biri sitozini(C )diğeri
sitozin ve timini (C+T) belirlemektedir



Dört reaksiyon setinden elde edilen parçacıklara
elektroforez uygulanarak jel üzerinde yan yana
yürümeleri sağlanır
Reaksiyonların herbiri hedef bazdan kırılmış
ancak farklı uzunlukta parçacıklar içermektedir
Uygulanan elektriksel alanın etkisiyle farklı
uzunluktaki parçacıklar jelde en kısası önde
gitmek üzere yol alır


DNA parçacıklarının 5’ ucu radyoaktif işaretli
olduğu için, elektroforez sonrası jelin üzerine
rontgen filmi konularak otoradyografi yapılır
Görüntülenen bantlar dört hat boyunca aşağıdan
yukarıya doğru okunur
GCGG…
OTOMATİK DNA DİZİ ANALİZİ

Genomların dizi analizi için,otomatik DNA dizi
analizi aletleri ve radyoaktif izotop yerine
floresan boyalar kullanılır. Bu sistemde 4 farklı
renkte boya kullanılır ve sonuçta, dizinin
okunmasını sağlayan dört farklı renkteki piklerin
oluşturduğu bir model ortaya çıkar
DNA dizi analizi
 Genlerin organizasyonu, doğası
 Mutasyonların sayısı, yeri ve çeşidi
 Prokaryotik ve ökaryotik genlerde yer alan kontrol
bölgelerinin organizasyonu
 Proteinlerin aminoasit dizileri
İle ilgili bilgi verir.
Ayrıca nükleotit dizlerinin bilgisayar analizleri, klonlanmış
parçanın bir genin tamamı mı yoksa bir kısmını mı
içerdiğinin anlaşılmasını sağlar. Bu ekzon/intron birleşme
noktalarının araştırılması ile ve çeşitli verilere göre daha
önceden ortaya çıkarılmış genlerin DNA dizileri ve
proteinlerin aminoasit dizileri ile karşılaştırılarak yapılır.

DNA dizi analizi, genlerin organizasyonu(intron ve
ekzonların sayısını ve intron-ekzon sınırlarını)
belirlemek, genin ürünü olan proteinin yapısı ve görevi
hakkında bilgi edinmek ve diğer organizmalardan elde
edilen benzer proteinler arasındaki evrimsel ilişkiyi
ortaya çıkarmak amacıyla da kullanılır

DNA dizi analizi ile virüslerin tüm genomları, E.coli ve
maya gibi birçok organizmanın genomları
aydınlatılmıştır. İnsan haploit genomunda bulunan 3
milyar bazın dizi analizi için Amerika Birleşik Devletleri
Enerji Departmanı ve Ulusal Sağlık Enstitüsü birlikte
çalışmaktadır.
DİĞER DNA DIZI ANALIZI YÖNTEMLERİ







Radyoaktivitenin zararlari, pahaliligi gibi dezavantajlarini
ortadan kaldirmak amaciyla, nonradyoaktif yöntemler
gelistirilmistir. Bunlar:
a. Gümüs boyama teknigi: Gümüs boyamanin, DNA dizi
analizinde kullanilmasi basit,hizli ve ucuz bir teknik
olarak göze çarpmaktadir.
b. Biotinlenmis primer kullanilmasi
c. Otomatik cihaz yardimiyla flöresans isaretleme ile
DNA dizi analizi gerçeklestirilir
d. Magnetik parçaciklar kullanarak DNA dizi analizi.
e. DNA baglayan proteinlerle.
f. Digoxigeninle DNA dizi analizi.