laktik asit bakterileri ve bakteriyofajlarının çeşitli kaynaklardan

advertisement
TÜRKİYE CUMHURİYETİ
ANKARA ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
LAKTİK ASİT BAKTERİLERİ VE
BAKTERİYOFAJLARININ ÇEŞİTLİ KAYNAKLARDAN
İZOLASYONU VE KARAKTERİZASYONU
Ayşen GÜMÜŞTAŞ
FARMASÖTİK MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Ahmet AKIN
2015- ANKARA
TÜRKİYE CUMHURİYETİ
ANKARA ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
LAKTİK ASİT BAKTERİLERİ VE
BAKTERİYOFAJLARININ ÇEŞİTLİ KAYNAKLARDAN
İZOLASYONU VE KARAKTERİZASYONU
Ayşen GÜMÜŞTAŞ
FARMASÖTİK MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Ahmet AKIN
2015- ANKARA
Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü
Farmasötik Mikrobiyoloji Yüksek Lisans Programı
çerçevesinde
yürütülmüş olan bu çalışma aşağıdaki jüri tarafından
Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir.
Tez Savunma Tarihi: 09/01/2015
Prof. Dr. Ahmet AKIN
Ankara Üniversitesi
Jüri B~k ı
Prof. Dr. Sulhiye YILDIZ
Ankara Üniversitesi
Prof. Dr. Meral SAOIROOLU
Hacettepe Üniversitesi
iii
İÇİNDEKİLER
Kabul ve Onay
ii
İçindekiler
iii
Önsöz
v
Simgeler ve Kısaltmalar
vi
Şekiller
Çizelgeler
1. GİRİŞ
viii
x
1
1.1. Laktik Asit Bakterilerinin Genel Özellikleri
2
1.1.1. Laktik Asit Bakterilerinin Önemi
5
1.2. Bakteriyofajlar
8
1.2.1. Bakteriyofajların Keşfi
9
1.2.2. Bakteriyofajların Yapısı
10
1.2.3. Bakteriyofajların Konakçı Enfeksiyonu
12
1.2.4. Bakteriyofajların Yaşam Şekilleri
15
1.3. Laktik Asit Bakteri Fajları
19
1.3.1. Laktik Asit Bakterilerinin Fajlara Karşı Direnç Mekanizmaları
20
2. GEREÇ VE YÖNTEM
2.1.
Gereç
22
22
2.1.1. Araştırmada Kullanılan Laktik Asit Bakteri ve Bakteriyofaj Kaynakları
22
2.1.2. Bakteri Kaynakları
23
2.1.3. Kullanılan Besiyerleri
26
2.1.4. Kullanılan Kimyasallar ve Çözeltiler
30
2.1.5. Kullanılan Cihazlar
32
2.2.
Yöntem
32
2.2.1. Laktik Asit Bakterilerinin Farklı Kaynaklardan İzolasyonu
32
2.2.2. Laktik Asit Bakterilerinin Tiplendirilmesi
33
2.2.3. Laktik Asit Bakterilerinin Patojen Bakterilere Karşı Antagonistik Aktiviteleri 35
2.2.4. Bakteriyofajların Farklı Kaynaklardan İzolasyonu
37
iv
2.2.5. Laktik Asit Bakterilerine Karşı Bakteriyofaj Varlığının Belirlenmesi
39
2.2.6. Bakteriyofajların Saflaştırılması
39
2.2.7. Çift Tabaka Agar Yöntemi ile Bakteriyofaj Titresinin Belirlenmesi
41
2.2.8. Bakteriyofaj Zenginleştirme
42
2.2.9. Geçirimli Elektron Mikroskobu (Transmission Electron Microscope)
44
3. BULGULAR
3.1. Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu
46
46
3.2. Laktik Asit Bakterilerinin Patojen Bakterilere Karşı Antagonist Aktiviteleri 49
3.3. Bakteriyofaj İzolasyonu ve Karakterizasyonu
49
4. TARTIŞMA
63
5. SONUÇ VE ÖNERİLER
68
ÖZET
70
SUMMARY
71
KAYNAKLAR
72
ÖZGEÇMİŞ
75
v
ÖNSÖZ
Tez konumun seçiminden, tezimin son aşamalarına kadar bana sabır, itina ve hoşgörü
ile yardımcı olan değerli danışman hocalarım Prof. Dr. Ahmet AKIN ve Dr. Nina
CHANISHVILI’ ye,
Yüksek lisans eğitimim boyunca bilimsel birikimlerini paylaşan, desteklerini hiç
esirgemeyen sevgili bölüm hocalarım Prof. Dr. Sulhiye YILDIZ, Prof. Dr. Nurten
ALTANLAR, Yard. Doç. Dr. Müjde ERYILMAZ’ a,
Her zaman yanımda olan, beni cesaretlendiren, çalışmalarım boyunca desteğini hep
hissettiğim canım arkadaşım Merve Eylül KIYMACI’ ya,
Tez çalışmalarım boyunca benden yardımlarını hiç esirgemeyen, her konuda destek
olan, bana hiç yabancılık çektirmeyen sevgili arkadaşlarım Irakli JANASHIA, Elene
KAKABADZE, Khatuna MAKALATIA, Nata BAKURADZE’ ye ve tüm Eliava
Bakteriyofaj, Mikrobiyoloji ve Viroloji Enstitüsü çalışanlarına,
Desteklerini hep hissettiğim sevgili hocalarım Prof. Dr. Sibel A. ÖZKAN, Prof. Dr.
Bengi USLU, Prof. Dr. Bezhan CHANKVETADZE’ ye,
Tüm eğitim hayatım boyunca benden maddi ve manevi desteğini hiç esirgemeyen, her
çıkmazda yanımda olup destekleriyle beni cesaretlendiren canım kardeşim, annem ve
babama, yüksek lisans eğitimimde ve tezimin tüm aşamalarında bana olan desteğiyle
cesaretlendiren, hep yanımda olan sevgili eşim Mehmet GÜMÜŞTAŞ’a
En içten teşekkürlerimi sunarım.
vi
SİMGELER VE KISALTMALAR
Å
Bir santimetrenin yüz milyonda biridir.
AS
Atık su
ATP
Adenozin trifosfat
o
Celsius
Ca
Kalsiyum
ÇS
Çiğ süt
dv
Devir
dk.
Dakika
DNA
Deoksiribo Nükleik Asit
FAO
Food and Agriculture Organisation (Gıda ve tarım örgütü)
h
Hacim
IBMV
Institute of Bacteriophages, Microbiology and Virology (Bakteriyofaj,
Mikrobiyoloji ve Viroloji Enstitüsü)
KH2PO4
Potasyum hidrojen ortofosfat
M
Molar
Ma
Matsoni
MC
Mitomisin C
Mg
Magnezyum
µL
Mikrolitre
mL
Mililitre
µm
Mikrometre (milimetrenin binde biri)
mm
Milimetre
mM
Milimolar
Na2HPO4
Disodyum hidrojen ortofosfat
NAD
Nikotinamid Adenin Dinükleotit
nm
Bir milimetrenin milyarda biridir.
PAS
Peynir altı suyu
C
vii
RNA
Ribo Nükleik Asit
rpm
Revolutions Per Minute (dakikadaki devir sayısı)
sa.
Saat
TEM
Transmission Electron Microscope (Geçirimli elektron mikroskobu)
UV
Ultraviyole
WHO
World Health Organization (Dünya sağlık örgütü)
viii
ŞEKİLLER
Şekil 1.1. Laktik asit fermantasyonu.
Şekil 1.2. Kuyruklu fajın yapısı. 1, baş; 2, nükleik asit; 3, kapsomer; 4, boyun; 5,
kuyruk kını; 6, kuyruk iplikçikleri; 7, kuyruk dikeni; 8, taban plakası; 9,
kuyruk.
Şekil 1.3. Bakteriyofajın konakçıya adsorbsiyonu.
Şekil 1.4. Fajın hücreye penetrasyonu.
Şekil 1.5. Fajın bakteri içinde üreme ve gelişme dönemi.
Şekil 1.6. Fajın bakteri hücresini lizise uğratması.
Şekil 1.7. Faj replikasyonunun tek basamaklı büyüme eğrisi
Şekil 1.8. Bakteriyofa yaşam şekilleri. A, litik yaşam döngüsü; B, lizojenik yaşam
döngüsü.
Şekil 2.1. Gram boyama.
Şekil 2.2. Paralel çizgi metodu. a, çizgi şeklinde inokule edilen test bakterisi (laktik
asit bakterisi); b, test bakterisine dikey çizgi şeklinde inoküle edilen patojen
ya da diğer laktik asit bakterileri; c, inkübasyondan sonra gözlemlenen
sonuçlar.
Şekil 2.3. Kuyu-difüzyon yöntemi. A, Laktik asit bakterilerinin petri kabı içine
inokülasyonu; B, agar üzerine kuyuların açılması; C, kuyuların içerisine
indikatör bakterilerin ilavesi; D, oluşan inhibisyon zonlarının ölçümü.
Şekil 2.4. Çift tabaka agar yöntemi.
Şekil 2.5. Faj zenginleştirme.
Şekil 3.1. Bile Esculin Testi sonucunda pozitif sonuç veren bir petri görünümü.
Şekil 3.2. Lactobacillus 59 suşu üzerinde SR3 fajının plak morfolojisinin görünümü.
Şekil 3.3. Çift tabaka agar yöntemi sonuçlarının görünümü. A, Lactobacillus 59
üzerine ekilen MR3 fajı (faj seyreltmesi 10-5); B, Lactobacillus 59 üzerine
ekilen SR3 (faj seyreltmesi 10-10) fajı.
Şekil 3.4. Spot test sonucunu gösteren bir petri kabı.
Şekil 3.5. MC test sonuçlarını gösteren fotoğraflar; her üç resim için sağ tarafta
bulunanlar test tüpleri, soldakiler ise kontrol gruplarıdır. a, Lactobacillus 59;
b, Lactobacillus 53S; c, Lactobacillus 58B.
ix
Şekil 3.6. Spot test sonuçlarının görünümü. A, Lactobacillus 53S ve 58B’ ye karşı
Lactobacillus SR3 fajı; Lactobacillus 53S ve 58B’ ye karşı Lactobacillus
MR3 fajı; B, Lactobacillus Kd3’ e karşı Lactobacillus MC 59 fajı.
Şekil 3.7. SR3 fajına dirençli mutant Lactobacillus 53S' suşu.
Şekil 3.8. TEM görüntüleri. (1), 53S' suşunun 32000x’ lik büyütmede görünümü; (2)
53S' suşunun 30000x’ lik büyütmede görünümü.
x
ÇİZELGELER
Çizelge 1.1.
Bazı peynir ve yoğurt türlerinde kullanılan starter kültürler.
Çizelge 2.1.
Kullanılan Lactobacillus sp. bakterilerin kodları ve alındıkları ya da
izole edildikleri kaynaklar.
Çizelge 2.2.
Kullanılan Streptococcus sp. bakterilerin kodları ve alındıkları ya da
izole edildikleri kaynaklar.
Çizelge 2.3.
Kullanılan Enterococcus sp. bakterilerin kodları ve alındıkları ya da
izole edildikleri kaynaklar.
Çizelge 2.4.
Çalışmada kullanılan cihazlar, marka ve firma bilgileri
Çizelge 3.1.
Laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve karakterizasyonu.
Çizelge 3.2.
Kullanılan faj kaynaklarına verilen kodlar ve izolasyonda kullanılan
potansiyel konakçı bakteriler- Lactobacillus sp.
Çizelge 3.3.
Kullanılan faj kaynaklarına verilen kodlar ve izolasyonda kullanılan
potansiyel konakçı bakteriler-Streptococcus sp., Enterococcus sp.
Çizelge 3.4.
Konakçı olarak Lactobacillus sp. suşlarının kullanıldığı spot test
sonuçları.
Çizelge 3.5.
Konakçı olarak Streptococcus sp. ve Enterococcus sp suşlarının
kullanıldığı spot test sonuçları
Çizelge 3.6.
İzole edilen fajların plak morfolojisi.
Çizelge 3.7.
Çift tabaka agar yöntemi için denenmiş olan optimizasyon koşulları.
Çizelge 3.8.
Çift tabaka agar yönteminin sonuçları.
Çizelge 3.9.
Mitomisin C testi sonuçları.
Çizelge 3.10. Spot test sonuçları.
1
1. GİRİŞ
Gıdalar besin içerikleri bakımından mikroorganizmaların gelişmeleri için uygun
ortamlardır. Bu nedenle gıdaların bazıları kolay bozulabilen, mikrobiyal faaliyet
açısından riskli gıdalar grubunda yer almaktadır. Gıda güvenliğini arttırmak ve raf
ömrünü uzatmak amacıyla doğal mikroflora ve antimikrobiyal metabolitlerinin
gıdalara ilavesi “biyokoruma” olarak adlandırılmaktadır. Biyokoruma yöntemi ile
antagonistik mikroorganizmaların ve metabolitlerinin kullanımıyla patojen ve
bozulma etmeni mikroorganizmaların inaktivasyonu sağlanmaktadır. Bu amaçla
kullanılan mikroorganizmalar arasında laktik asit bakterileri önemli bir yer tutmaktadır
(Schnürer ve Magnusson, 2005; Gürsel ve ark., 2004).
Laktik asit bakterileri, fermantasyon neticesinde laktik asit üreten bakteriler olarak
tanımlanırlar. Bu yetenekleri sayesinde de çok uzun yıllardır gıda güvenliğini ve
dayanıklılığını geliştirmek için kullanılmaktadırlar. Laktik asit bakterilerinin süt
ürünlerinin fermantasyonundaki rolü ise 19. yüzyılın sonlarında keşfedilmiştir.
Keşiflerinden bu yana laktik asit bakterileri starter kültür olarak süt ürünlerine ilave
edilmekte ve böylece üründe asit üretiminin kontrolü yanında yapısal ve aromatik
özelliklerin kazandırılmasını sağlamaktadırlar (Lacroix, 2011).
Starter kültürlerin aktivasyonunu olumsuz yönde etkileyen çok sayıda etmen vardır.
Bunların içinde en önemli ve çözümü en güç olanı bakteriyofaj (faj)
kontaminasyonlarıdır. Faj kontaminasyonu; üretimde kullanılan hammadde, alet ve
ekipman yüzeyleri, fabrika havası gibi dış çevre koşullarından kaynaklanabildiği gibi,
doğrudan starter kültür suşlarından da kaynaklanabilmektedir. Fermantasyon sırasında
2
karşılaşılan bu sorun starter kültürlerin fajlar tarafından enfekte edilmesi ve dolayısıyla
fermantasyonun gerçekleşememesi ile sonuçlanmaktadır. Fermente süt endüstrisinde
faj kontaminasyonlarının % 15-20 oranına varan ürün kayıplarına neden olduğu
bilinmektedir (Sanders, 1988).
1.1. Laktik Asit Bakterilerinin Genel Özellikleri
19. Yüzyılın sonlarında ‘laktik asit bakterileri’ sütü ekşiten organizmalar olarak
adlandırılmaktaydı. İlerleyen dönemlerde sütü ekşiten organizmalar ve diğer laktik asit
üreten bakteriler arasındaki benzerlik gözlemlenmiş ve 1919 yılında Orla-Jensen
tarafından laktik asit bakterilerinin temel sınıflandırılmasına ilişkin ilk monograf
düzenlenmiştir. Orla-Jensen tarafından kullanılan bu kriterler (hücre morfolojisi,
glukoz fermantasyonu şekli, üreme sıcaklık aralıkları ve şeker kullanım biçimleri)
laktik asit bakterilerinin sınıflandırılması için günümüzde de kullanılmaya devam
etmektedir (Lahtinen ve ark., 2012). Laktik asit bakterilerinin taksonomik olarak
bilinen 20 cinsi bulunmaktadır. En çok bilinen türler arasında Aerococcus,
Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus,
Leuconostoc,
Melisococcus,
Oenococcus,
Lactobacillus,
Pediococcus,
Lactococcus,
Streptococcus,
Tetragenococcus, Vagococcus ve Weisella yer almaktadır (Salminen ve ark., 2004).
Laktik asit bakterileri geleneksel olarak gıda ve yem fermantasyonunda görev alırlar.
Bazı cinsleri sağlık için oldukça yararlı probiyotik özellik gösterir ve genellikle faydalı
mikroorganizmalar olarak bilinirler. Bununla birlikte Streptococcus, Lactococcus,
Enterococcus, Carnobacterium gibi bazı cinslerin suşları insan ya da hayvanlar için
patojen özellik gösterirler (Giraffa ve ark., 2010).
3
Laktik asit bakterileri morfolojik, metabolik ve fizyolojik özelliklerine göre
gruplandırıldıklarında Gram-pozitif, karbonhidrat fermantasyonu neticesinde son ürün
olarak laktik asit oluşturan, çubuk (Lactobacillus, Carnobacterium, Bifidobacterium)
ya da kok (Lactococcus, Vagococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus,
Tetragenococcus, Streptococcus, Enterococcus) şeklinde, spor oluşturmayan, birkaç
üye dışında hareketsiz, fakültatif anaerob ve katalaz negatif bakteri grubu içinde yer
alırlar. Süt ve süt ürünleri başta olmak üzere doğada (bitki ve bitki atıkları, et ve et
ürünleri, insan ve hayvan barsak sistemi) yaygın olarak bulunmaktadırlar. Endüstriyel
açıdan önem arz eden, patojen olmayan altı cins bulunmaktadır. Bu cinsler ve
kullanıldıkları ürünler;
 Lactococcus
süt ürünleri,
 Lactobacillus
sebzeler, tahıl, süt ve et ürünleri,
 Leuconostoc
sebzeler ve süt ürünleri,
 Pediococcus
sebzeler ve et ürünleri,
 Oenococcus
şarap,
 Streptococcus
süt ürünleri
şeklinde sıralanabilir (Salminen ve ark., 2004; Lahtinen ve ark., 2012).
Laktik asit bakterileri karbonhidrat metabolizmaları göz önüne alındığında
homofermantatif ve heterofermantatif olarak iki gruba ayrılırlar. Homolaktik
fermantasyon ya da homofermantatif yol temel olarak glikolize dayanmaktadır ve
sadece laktik asit üretilir. Heterofermantatif ya da heterolaktik fermantasyonda laktik
asite ek olarak CO2 ve etanol ya da asetat üretilir. Teorik olarak homolaktik
fermantasyonda her glikoz kullanımında 2 mol laktik asit ve her 1 mol glikoz tüketimi
için net 2 ATP açığa çıkarken, heterolaktik fermantasyonda laktik asit, etanol ve
CO2’nin her birinden 1 mol ve her bir mol glikoz tüketimi için 1 mol ATP açığa çıkar.
Her iki fermantasyon çeşidinde de glikoliz aşaması ortaktır (Şekil 1.1). Fermantasyon
çeşidi laktik asit bakterileri için önemli bir taksonomik kriterdir. Genel olarak
4
Lactobacillus, Leuconostoc, Oenococcus, Weissellas cinsleri heterofermantatif, diğer
laktik asit bakterileri ve laktokoklar ise homofermantatiftir (Salminen ve ark., 2004).
Glikoz
2 ATP
Glikoliz
2 NADH2
Pirüvat
Pirüvat
NADH + H
NADH + H
NAD+
NAD+
Laktik asit
Laktik asit
Şekil 1.1. Laktik asit fermantasyonu.
5
1.1.1. Laktik Asit Bakterilerinin Önemi
Laktik asit bakterilerinin birçok suşu gıda ve yem sanayiinde kullanılan
mikroorganizmaların önemli bir grubunu oluşturmaktadır. En önemli karakteristik
özelliklerinden biri olan fermantasyon yetenekleri sayesinde gıdaların korunması, tat
ve koku gibi yapısal özelliklerin geliştirilmesi için kullanılırlar. Çeşitli suşları süt
ürünleri (yoğurt, peynir), fermente et ürünleri (salam, sosis), fermente sebzeler (zeytin,
turşu), ekmek gibi gıdalarda bulunmaktadır. Ayrıca, günümüzde laktik asit bakterileri
endüstride kimyasalların, farmasötiklerin ve diğer faydalı ürünlerin sentezlenmesinde
çok önemli bir rol oynamaktadır (Florou-Paneri ve ark., 2013).
Gıda ve Yem
Sanayi
İlaç
Kimya
Laktik Asit
Bakterileri
Fonksiyonel Girdiler
 Probiyotikler
 Starter kültürler
 Antimikrobiyal ajanlar
 Biyokoruyucular
 İlaç sektörü
 Düşük kalorili tatlandırıcılar
 Eksopolisakkaritler
 Vitaminler
Fermantasyon, en eski gıda muhafaza yöntemlerinden biridir. Binlerce yıl öncesinde
peynir, yoğurt, şarap, ekmek, turşu gibi gıdaların muhafazası için kullanılmış olsa da
fermantasyondan mikroorganizmaların sorumlu olduğu ancak 1861’ de Louis Pasteur’
ün pastörizasyonu keşfinden sonra anlaşılmıştır (Ross ve ark., 2002). Laktik asit
6
bakterileri fermantasyonla karbonhidratı β-galaktosidaz enziminin etkisiyle glukoz ve
galaktoza parçalar, daha sonra glukoz laktik asite çevrilir. Bu sayede pH 5’in altına
düşer ve ürüne istenilen tat ve aroma kazandırılmış olur. Ayrıca gıda kaynaklı
patojenler ve patojen olmayan kontaminantların büyük bir kısmı bu asitlere ve
dolayısıyla pH düşüşüne karşı hassastır (Aşkar ve ark., 1999).
Laktik asit bakterileri fermantasyonda izledikleri metabolik yollardaki farklılıktan
dolayı homofermantatif ve heterofermantatif olmak üzere iki gruba ayrılırlar.
Homofermantatif laktik asit bakterileri Embden-Meyerhof-Parnas früktoz-1,6 difosfat
metabolik yolunu izlerlerler ve 6 karbonlu glukoz molekülünü, 3 karbonlu piruvata ve
daha sonra da laktik asite dönüştürürler.
C6H12O6
2(CH3-CHOH-COOH)
Heterofermantatif ya da heterolaktik fermantasyonda ise fosfoketolaz glikolitik yolu
kullanırlar. Fermantasyon sonunda laktik asitin yanı sıra etil alkol, asetik asit ve CO2,
ayrıca iz miktarda asetaldehit, diasetil, formik asit, propiyonik asit gibi ürünler
oluşabilir (Lahtinen ve ark., 2012; Üçüncü, 2005).
C6H12O6
CH3 -CHOH-COOH + CH3-CH2OH + CO2
ve / veya
C6H12O6
CH3-CHOH-COOH + CH3-COOH + CO2
Laktik asit bakterileri fermantasyon özelliklerinden dolayı süt endüstrisinde starter
kültür
olarak
kullanılmaktadır.
Starter
kültürler,
sütte
bulunan
zararlı
mikroorganizmaların gelişimini sınırlamak, ürüne özgü standart tat, aroma ve yapının
kazandırılması için süte katılan yararlı mikroorganizmalardır. Aynı zamanda ürüne
bulaşan patojen bakterilere karşı inhibisyon özellik gösterebilirler (Bacus ve Brown,
1981). Starter kültürlerin yanı sıra, starter kültür olarak kullanılmayan bakteriler olan
Non-Starter laktik asit bakterileri starter kültürler ile birlikte fermantasyonda aroma
gelişiminde rol oynamaktadır. Birlikte laktozu fermente ederek, süt proteinlerini
peptitlere ve serbest amino asitlere dönüştürürler, sitratı; ester, lipit ve uçucu
7
metabolitlere parçalayarak aroma maddelerinin oluşumunu sağlarlar. Peynirden,
sosisten ve yoğurttan non-starter laktik asit bakterilerinin Lactobacilli, Enterococci,
Pediococci ve Leuconostoc türleri izole edilebilmektedir. Lactobacillus casei suşları
izolasyonda en çok elde edilen suşlardır (Fitzsimons ve ark., 1999). Bazı peynir ve
yoğurt türlerinde kullanılan starter kültürler Çizelge 1.1’ de özetlenmiştir.
Çizelge 1.1. Bazı peynir ve yoğurt türlerinde kullanılan starter kültürler.
No
1
Ürün
Kamember
Mikroorganizma
Lactococcus spp., Penicillium camemberti
S.
thermophilus
+
Lactobacillus
delbrueckii
ssp.
bulgaricusactococcus, Lactobacillus lactis ssp. lactis +
2
Kaşkaval
Streptococcus thermophilus + Lactobacillus casei ssp.
casei
Lactococcus lactis subsp. lactis; Lactococcus lactis subsp.
Cottage peyniri, cremoris; Lactococcus lactis subsp. lactis + Lactococcus
3
krem peyniri
lactis subsp. cremoris + Cit(+)Lactococcus lactis subsp.
lactis var. diacetylactis
4
Matsoni
Lactobacillis lactis subsp. cremoris,
5
Yoğurt
Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus
Laktik asit bakterileri tarafından üretilen organik asitler, karbondioksit, diasetil,
biyosürfaktan maddeler, H2O2, bakteriyosin ve benzeri protein yapısındaki
metabolitlerin birçoğu antimikrobiyel etki göstermektedir (Mishra ve Lambert, 1996).
Laktik asit bakterilerinin en önemli özelliklerinden biri de probiyotik olarak
kullanılabilmeleridir. Probiyotik, Yunanca’ da ‘yaşam için’ anlamına gelen bir
8
kelimedir (Gomes ve Malcata, 1999). Probiyotikler, Birleşik Sağlık ve Beslenme
Uzman Danışma Kurulu (FAO/WHO)’ nun yapmış olduğu tanıma göre “Uygun
miktarlarda alındıklarında konak canlının sağlığı üzerinde olumlu etkiler sağlayan
canlı mikroorganizmalar” olarak ifade edilmiştir. Fuller (1989) ise probiyotikler için
“tüketici sağlığına bireylerin intestinal mikrobiyal dengesini koruyarak veya
geliştirerek yararlı olan canlı mikrobiyal gıda katkılarıdır” tanımını kullanmıştır.
Probiyotiklerin;

İntestinal mukoza yüzeyindeki reseptörlere bağlanabilme,

Patojenlerin reseptörlere tutunmasını önleme,

İmmün
modülasyonu
(bağırsaklar
bağışıklık
sisteminin
en
önemli
unsurlarından biridir),

Hasar görmüş mukozanın iyileştirilmesi
gibi insan sağlığı için oldukça önemli özellikleri vardır. Probiyotik olarak kullanılan
laktik asit bakterileri genellikle Lactobacillus ve Bifidobacterium cinslerine ait
türlerdir (Gürsoy ve Kınık, 2006).
1.2. Bakteriyofajlar
Bakteriyofajlar (faj) bakterileri enfekte ederek onların kaynaklarını kullanan
viruslardır. Tıpkı diğer viruslar gibi yaşamlarını sürdürebilmek için bir konakçıya
ihtiyaçları vardır. Bakteriyofaj kelimesi antik Yunanca’ da bakteri ve yemek
fiillerinden türemiş olup ‘bakteri yiyen’ anlamına gelmektedir. Fajlar yeryüzünde her
yerde mevcuttur; okyanuslar, toprak, denizler, içme suları, yediğimiz yiyeceklerde
bulunmaktadırlar. Yeryüzündeki yaklaşık 1032’ lik üye ile fajlar dünyanın en kalabalık
yaşam formunu oluşturmaktadır (Wommack ve Colwell, 2000; Kutter ve
Sulakvelidze, 2005).
9
1.2.1. Bakteriyofajların Keşfi
Fajların keşfi yüzyıllar öncesine dayanmaktadır. İlk olarak 1896 yılında İngiliz
bakteriyolog Ernest Hanbury Hankin Hindistan’ ın Yamuna ve Ganj nehir sularının
birçok bakteri türüne özellikle de Vibrio cholerae’ ya karşı antiseptik aktivitesi
olduğunu rapor etmiştir. Bu etkinin filtreden geçirildiğinde devam ettiğini, ancak
kaynayınca yok olduğunu görmüştür. Edindiği bilgilere dayanarak antiseptik
aktivitenin nedeninin buharlaşabilen kimyasal bir madde olduğu sonucuna varmıştır.
Emmerich ve Löw ise 1901 yılında bir maddenin bakteri kültürlerinde lizislere neden
olduğunu rapor etmiştir (Kutter ve Sulakvelidze, 2005). 1915 yılında İngiliz
bakteriyolog Frederick Twort katı besiyerinde bakteri kültürlerinde erimelere neden
olan küçük bir ajan keşfetmiştir. Elde ettiği bulguları yayınlamış, ancak 1. Dünya
Savaşının başlamasıyla çalışmalara ara verilmiştir. 1917 yılında Felix d'Herelle Fransa
Pasteur Enstitüsü’ nde bakterileri öldüren bir ajan keşfetmiştir. D'Herelle yaptığı
çalışmalarda atıksulardan aldığı bakteriden arındırılmış filtratlar eklemiş ve dizanteri
bakteri kültürlerinin yok olduğunu gözlemlemiştir. D’Herelle bu olaya neden olan
şeyin ultraviruslar olduğunu öne sürmüş ve bunları ‘bakteriyofaj’ olarak
adlandırmıştır. Fajlarla ilgili ilk ciddi çalışma da d’Herelle tarafından aynı yıl
yapılmıştır. D’Herelle fajları dizanteriye yakalanan bir çocuğu iyileştirmek için
kullanmış ve faj uygulamasından sonra çocuğun iyileştiğini görmüştür. 1923 yılında
ise D’Herelle’ ın yakın çalışma arkadaşlarından biri olan George Eliava tarafından
bakteriyofaj çalışmaları ve faj tedavisinin geliştirilmesi için Tiflis, Gürcistan’ da
Eliava Enstitüsü açılmıştır. Böylece enstitüde çalışan birçok bilim insanı faj
çalışmaları için çeşitli yöntemler geliştirmiş ve bu yöntemleri tedaviye yönelik
amaçlar için kullanmışlardır (Kurtboke, 2012).
Halen Eliava Bakteriyofaj, Mikrobiyoloji ve Viroloji Enstitüsü faaliyetlerine devam
etmekte ve özellikle açık, iltihaplı, irinli yaralar için faj tedavisi başarıyla
uygulanmaktadır. Gürcistan’ ın yanı sıra Rusya, Polonya gibi ülkeler de bakteriyofaj
tedavisini kullanmaktadır.
10
1.2.2. Bakteriyofajların Yapısı
Fajların yapısı protein ve nükleik asitten oluşmaktadır. Bütün faj partikülleri (virion)
nükleik asit genomlarını (DNA ya da RNA) protein ya da lipoprotein bir kılıf (kapsit)
içinde taşır. Fajların kuru ağırlığının yaklaşık %60’ı protein, %40’ı nükleik asittir.
Enerji üretmek için mekanizmaları, protein sentezlemek için ribozomları yoktur. Bu
nedenle diğer tüm viruslar gibi parazittirler, ancak bir konakçı hücreyi enfekte ederek
çoğalabilirler. Bakterilere göre oldukça küçük varlıklardır. Büyüklükleri milimikron
(nanometre: nm) ya da Angström (Å) (angström= 0.1 nm) ile ölçülebilir ve ancak
elektron mikroskobunda görülebilirler.
Fajlar, içinde genetik malzemenin yer aldığı bir baş (kapsit), bir kuyruk ve yapışkan
kuyruk liflerinden oluşmuşlardır. Nükleik asit moleküllerinin yumak şeklinde bir yapı
oluşturduğu protein bir kılıf ile kaplı olan kısım baş kısmını oluşturmaktadır. Birbirine
benzer alt birimlerden oluşan prizma şeklindeki bu protein kılıf ‘kapsit’ adını
almaktadır. Kapsit genellikle bir altıgen gibi şekillenmiştir. Nükleik asit ve kapsidin
oluşturduğu kompleks ‘nükleokapsid’ olarak adlandırılır. Kapsid birden fazla
polipeptitten oluşan yapısal ünitelerden oluşur ve bu ünitelerin her biri ‘kapsomer’
adını alır. Kapsomerler ise ‘protomer’ adı verilen yapısal alt ünitelerin (polipeptit
zincirleri) simetrik şekilde diziliminden oluşurlar.
Fajlarda baş kısmını kuyruk kısmına bağlayan kısa bir boyun kısmı bulunur. Kuyruk
protein yapıdan oluşur ve uzunluğu genellikle 50-100 nm arasındadır. Kuyruk yapısı
bakteriyofaj tiplerine göre farklılıklar gösterir. Bazı faj türlerinde hiç kuyruk
bulunmazken, bazılarında çok kısa ve basit yapılar şeklinde, bazılarında ise oldukça
kompleks görünümde olabilirler. Örneğin, RNA fajlarında ve bazı DNA fajlarında
kuyruk bulunmaz, sadece kapsidden oluşurlar. Kuyruk kısmı fajlarda yapışma veya
adsorbsiyon organeli olarak görev yapar. Kuyruk içinde öz yapı adı verilen bir yapı
bulunur. Bu yapı nükleik asidin bakteriye aktarılması sırasında iletim yolu olarak
görev yapmaktadır. Öz yapısını saran protein yapı ise kuyruk kını adını alır. Kuyruk
11
kını enfeksiyon esnasında kasılabilir ve bu sayede genetik materyal öz yapısından
geçerek konakçıya aktarılır.
Kuyruğun ucunda altıgen bir taban plakası yer alır. Kuyruk dikenleri ve iplikçikleri bu
levhaya bağlıdır. Taban plakası faj-bakteri özgüllüğünü taşıyan, fajın konakçıya
tutunmasında ve adsorbsiyonunda önemli rolleri olan kısımdır. Kuyruk iplikçikleri ve
dikenleri de kuyrukta olduğu gibi faja göre farklılık gösterir. Bazı fajlarda hem
iplikçik, hem diken bulunurken, bazılarında her ikisi de bulunmayabilir ya da yalnız
biri bulunabilir. Kuyruk iplikçiklerinin uç yapıları da yine fajlara göre farklılık
gösterir. Bazı fajlarda topuz şeklinde uç yapısı görülebilir. Kuyruk iplikçiklerinde
bulunan lizozim enzimi konakçı hücre duvarını eritir ve böylece genetik materyal
direkt olarak sitoplazma içine enjekte edilir (Ergüllü, 1982; Kutter ve Sulakvelidze,
2005; Ustaçelebi ve Us, 2008). Şekil 1.2’ de tipik bir fajın yapısı verilmiştir.
2
1
4
3
5
2
9
6
7
8
Şekil 1.2. Kuyruklu fajın yapısı. 1, baş; 2, nükleik asit; 3, kapsomer; 4, boyun; 5,
kuyruk kını; 6, kuyruk iplikçikleri; 7, kuyruk dikeni; 8, taban plakası; 9, kuyruk.
12
Diğer tüm canlılar gibi fajların da antijenik özellikleri yapılarında bulunan proteinlere
bağlıdır. Fajların baş, boyun ve kuyruk iplikçileri protein yapıdadır. Bu yapıları
oluşturan proteinler antijenik özellikler bakımından birbirlerinden farklıdırlar. Baş
proteinlerine karşı elde edilen antiserumlar fajın konakçıya adsorbsiyonunu
engellemezken,
kuyruklara
karşı
hazırlanan
antikorların
fajın
konakçıya
andsorbsiyonunu engellediği bilinmektedir (Kılıç, 2008).
1.2.3. Bakteriyofajların Konakçı Enfeksiyonu
Fajlar tüm viruslar gibi zorunlu parazitlerdir. Çoğalmak için replike olabilecekleri bir
hücreye girmek zorundadırlar. Bu olaya ‘enfeksiyon’, enfekte olmuş hücreye ise
‘konakçı’ denir. Her fajın içinde çoğalabileceği spesifik bir bakteri konağı bulunur.
Fajların konakçılarında enfeksiyon oluşturmaları 4 aşamada gerçekleşir (Şekil 1.3);
1. Adsorbsiyon: Kuyruklu fajlar tarafından meydana gelen enfeksiyon, kuyruk
lifleri gibi ‘özellişmiş adsorbsiyon yapılarının’ hedef bakterinin molekül ya da
kapsül yüzeyine bağlanmasıyla başlar (Şekil 1.3). Kuyruksuz fajlarda ise bu
olay
özgül
reseptörlere
kapsomerlerinin
tutunmasıyla
gerçekleşir.
Enfeksiyonun en önemli aşaması adsorbsiyondur. Çünkü fajın konakçı
bakteriye özgüllüğünün belirlendiği aşamadır. Gram-negatif bakterilerde
bağlanma;
proteinler,
oligosakkaritler,
lipopolisakkaritler
gibi
özgül
reseptörlerle sağlanır. Gram-pozitif bakterilerde ise murein tabakasının
kompleks yapısından dolayı çok farklı bağlanma bölgeleri (teikoik asit gibi)
vardır. Çoğu faj kuyruğun yüzeye penetrasyonu için yüksek konsantrasyonda
bulunan spesifik bir moleküle ihtiyaç duyar.
13
Konak kromozomu
Şekil 1.3. Bakteriyofajın konakçıya adsorbsiyonu.
Birçok faj bağlanma için Ca2+, Mg2+ gibi spesifik kofaktörlere ihtiyaç duyar.
Bu maddeler, bakteri ve faj parçacıklarının negatif elektrik yüklerini nötralize
ederek adsorbsiyonu kolaylaştırmaktadır. Adsorbsiyon, fajla bakterinin
birbirine temasından ortalama 5 dakika sonra tamamlanmış olur.
2. Penetrasyon: Fajın hücreye adsorbsiyonundan sonra genetik materyalini
bakteriye aktardığı aşamadır. Genetik metaryelin aktarımını sağlayan
mekanizma her faj için spesifiktir. Ancak, genel olarak fajların genetik
malzemelerini hücrenin içine enjekte etmek için kuyruk lifleri kasılır, böylece
kuyruğun bakteri hücre duvarına penetrasyonun sağlanır (Şekil 1.4).
Penetrasyon için faj kuyruğu enzimatik bir mekanizmaya sahiptir. Temastan
sonra hücre duvarında küçük bir delik oluşur. Kuyruk gerilir ve faj genetik
materyali direkt olarak bu delikten hücre içine salınır. Aynı zamanda
konakçıda uygun bir pozisyon bulana kadar genetik materyalin kapsitten dışarı
çıkmasını engelleyen bir mekanizma da hücre içine salınır. Salınımdan sonra
konakçının hücre duvarında kalan faj kılıfı ‘hayalet faj’, hücre içine giren fajın
nükleik asidi ise ‘vejetatif faj’ olarak isimlendirilir.
Şekil 1.4. Fajın hücreye penetrasyonu.
14
3. Biyosentez: Fajların bakteri içinde üreme ve gelişme dönemidir (Şekil 1.5).
Faj genetik materyali bakteri hücresine girdikten sonra bakteri ribozomları
protein sentezine başlar. Konakçının kendi protein ve nükleik asit sentezi de
bozularak viral ürünlerin sentezine yönelir. Oluşan yeni ürünler yeni
virionların oluşmasına yardımcı olacaklardır.
Şekil 1.5. Fajın bakteri içinde üreme ve gelişme dönemidir.
4. Lizis: Hücre içerisinde olgun fajların meydana geldiği ve hücre erimesi ile
dışarı salınması safhalarıdır (Şekil 1.6). Salınma işlemi, hücre duvarındaki
peptidoglikanı parçalayan endolizin enzimi sayesinde gerçekleşir.
Şekil 1.6. Fajın bakteri hücresini lizise uğratması.
Kuyruklu fajların tamamı lizis için 2 bileşen kullanır;

Lisin: Peptidoglikan tabakayı oluşturan bağları kırmak için kullanılan
bir enzimdir.

Holin: İç membranda porlar açarak lisin enziminin peptidoglikan
tabakaya ulaşmasını sağlayarak lizisi hızlandıran bir proteindir (Kutter
ve Sulakvelidze, 2005; Ustaçelebi ve Us, 2008).
15
100
10
Penetrasyon
Virus sayısı (pfu)
1000
1
Latent dönem
Adsorbsiyon
Zaman
Biyosentez
Olgun virusların
hücreden salınımı
Şekil 1.7. Faj replikasyonunun tek basamaklı büyüme eğrisi
1.2.4. Bakteriyofajların Yaşam Şekilleri
Fajlarda litik ve lizojenik yaşam döngüleri olmak üzere başlıca iki yaşam şekli
görülmektedir (Şekil 1.8). Litik yaşam döngüsünü izleyen fajlar virulan (litik) fajlar,
lizojenik yaşam döngüsünü izleyen fajlar ise ılımlı (lizojenik) fajlar olarak
adlandırılırlar. Virulan ve ılımlı fajların her ikisi de enfeksiyonu gerçekleştirebilmek
için bakterinin dış yüzeyinde bulunan spesifik reseptörlere ihtiyaç duyarlar.
Enfeksiyon bakteriyel adsorbsiyon, faj genomunun replikasyonu, viral bileşenlerin
sentezi ve olgun faj partiküllerinin hücre lizisi ile ortama salınımıyla gerçekleşir
(Abedon, 2008; Lacroix, 2011).
Litik yaşam döngüsü, virulan fajın konakçı hücresinin yüzeyine adsorbsiyonu ile
başlar. Faj, taban plakasında bulunan proteinden oluşmuş kuyruk iplikçiklerini
konakçı hücre yüzeyinde bulunan reseptör bölgelerini tanımak için kullanır. Kendisine
spesifik bu reseptörleri tanıyan faj konakçıya tutunur ve genomunu doğrudan konakçı
bakterinin sitoplazmasına enjekte eder. Bu aşamadan sonra konakçı metabolizmasını
16
ele geçirir ve böylece bakteri metabolizması durur. Daha fazla faj yapmak için
moleküler mekanizmayı başlatır ve böylece yeni faj DNA sentezi gerçekleşir. Daha
sonra DNA’ yı çevreleyen, kapsid, kuyruk ve kuyruk iplikçikleri gibi kısımlar
meydana gelerek faj oluşumu tamamlanır. Konakçı hücre içerindeki faj yoğunluğu
artar ve sonunda hücrenin lizisi ile yeni oluşan fajlar serbest kalır.
Lizojenik döngü, faj çoğalması için alternatif bir yoldur. Fajın konakçı hücreye
adsorbsiyonundan ve onun DNA’sına penetrasyonundan sonra, yeni sentezlenmiş faj
partiküllerinin oluşumu bastırılmaktadır. Bu aşamalar tüm fajlar için ortaktır ancak
lizojenik yaşam döngüsünde faj DNA’sı bakteri kromozomuna rekombinasyon yolu
ile girmektedir. Bu olay ‘lizojeni’, konakçı DNA’ sına bağlanan faj genetik materyali
de ‘profaj’ olarak adlandırılır. Böylece konakçı hücrede fajın sebep olduğu lizis
meydana gelmez. Faj DNA’sı, lizojenik hücrelerin karakterini oluşturmak üzere,
bakteriyel DNA ile eşzamanlı olarak replike olmaktadır. Kromozomunda bu şekilde
faj taşıyan bakteri ‘lizojenik bakteri’ olarak adlandırılır. Koşullar uygun olduğu sürece
konak hücrede faj varlığını sürdürür. Ancak ortam şartları konak için uygunsuz hale
gelirse, örneğin besin kaynaklarının tükenmesi durumunda, profajlar etkinleşirler.
Konak hücrede çoğalmaya başlayan profajlar uygun sayıya ulaştıklarında hücreyi
lizise uğratır ve serbest kalırlar. Lizojenik döngü uygun koşullar altında konak
hücrenin çoğalmasına izin verdiği için hücrenin yavrularında da faj varlığını devam
ettirir (Lacroix, 2011).
Bazen profajlar inaktif oldukları dönemde bakteri genomuna yeni işlevler
kazandırarak konak bakteriye fayda sağlarlar, bu olguya ‘lizojenik dönüşüm’
(lysogenic conversion) denir. Lizojenik dönüşümün etkisi kolera hastalığında
rahatlıkla görülebilir. Kolera, Gram negatif, virgül şeklinde bir bakteri olan Vibrio
cholerae’ nın neden olduğu, bağırsak enfeksiyonuna bağlı olarak, akut ve şiddetli ishal
ile seyreden, kaybedilen su ve elektrolit kaybının yerine konulmasıyla tedavi edilen
bir hastalıktır. Vibrio cholerae her zaman hastalığa neden olmaz. Ancak, CTX fajı ile
enfekte olduğunda faj toksijenisitesini bakteriye aktarır. Faj, bakteri üzerinde bir piliyi
17
tanır ve hücre içine girmek için kullanır. Hücre içine girdikten sonra bakteri
kromozomuna entegre olur ve lizogen kolera toksinini eksprese eder (sentezler).
(Waldor ve Mekalanos, 1996).
Lizojenik bakterilerin bazı fiziksel ya da kimyasal ajanlarla muamele edilmesiyle
profaj dışarı çıkarılarak virulan faja dönüşmektedir. Bu olaya ‘faj indüksiyonu’ adı
verilir. Faj indüksiyonu için kullanılan yöntemler:
 Mitomisin C antibiyotiği uygulaması,
 UV ile muamele,
 Azot gazı uygulaması,
 İnkübasyon sıcaklığındaki değişim olarak sıralanabilir (Lacroix, 2011; Kılıç,
2008).
18
Faj
DNA’ sı
A
Faj
Bakteri kromozomu
Litik yaşam
döngüsü
Faj
DNA’ sı
B
Faj
Bakteri kromozomu
Profaj
Lizojenik
yaşam döngüsü
Profaj taşıyan
yavru hücreler
Çoğalan bakteri hücreleri ile profaj yeni
hücrelere taşınır
Şekil 1.8. Bakteriyofaj yaşam şekilleri. A, litik yaşam döngüsü; B, lizojenik yaşam
döngüsü.
19
1.3. Laktik Asit Bakteri Fajları
Süt teknolojisinde, süt ürünlerinde standart bir kalite ve arzu edilen tat, aromanın
sağlanabilmesi için starter kültürler kullanılmaktadır. Ancak starter kültür
kullanımının yaygınlaşmasından sonra ortaya bakteriyofaj sorunu çıkmıştır. Steril
olmayan işletme koşulları ya da steril olmayan ortamlardan elde edilen çiğ sütlerin
kullanılması gibi nedenlerle starter kültürler fajlarla kontamine olmaktadır. Sütte çok
düşük miktarda faj olsa bile, ortamda bulunan starter kültürde faja duyarlı hücrelerin
olması durumunda faj popülasyonu çok hızlı şekilde artabilir. Enfeksiyonu takiben
hücrelerde meydana gelen lizisle süt fermantasyonu yavaşlayacak veya tamamen
duracak, bu da düşük kalitede ürünlerin üretimine neden olacaktır. Bu durum süt
endüstrisinde çok büyük ekonomik kayıplara neden olmaktadır (Garneau ve Moineau,
2011).
Starter kültürlerde yaşanan bakteriyofaj sorununa ilk olarak 1935 yılında Whitehead
ve Cox yaptıkları çalışmada dikkat çekmişlerdir. Whitehead 1953’ te yaptığı başka bir
çalışmada da peynir üretiminde starter kültür olarak kullanılan Streptococcus
cremoris’ in asit üretme aktivitesindeki bozulmanın sebebinin bakteriyofajlar
olduğunu öne sürmüştür. O zamandan beri bilimsel camia süt teknolojisinde faj
kontaminasyonunun kontrol altına alınabilmesi için stratejiler geliştirmeye
odaklanmıştır. Bu stratejiler, suş seçimleri, fajdan etkilenmeyen mutantların kullanımı,
antifaj direnç mekanizmaları gibi temellere dayanmaktadır. Lactococcus lactis ve
Streptococcus thermophilus suşları faj enfeksiyonundan en çok etkilenen suşlardır. Bu
nedenle faj biyolojisiyle ilgili ilk çalışmalar da bu suşlara dayanmaktadır. Süt
endüstrisinde çok sorun yaratmadıkları için Lactobacillus türlerini enfekte eden
fajlarla ilgili yapılmış çok az çalışma vardır. Ancak, laktobasillerin probiyotik olarak
rollerinin artmasıyla laktobasil fajlarıyla ilgili yapılan araştırmalar hız kazanmıştır.
Hatta Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp.
lactis ve Lactobacillus helveticus gibi süt endüstrisinde fermantasyonda kullanılan
büyük bir grup suşun faj kontaminasyonundan etkilendiği rapor edilmiştir (Mozzi ve
ark., 2010).
20
Laktik asit bakteri fajları çiğ süt, yoğurt, peynir, atık su, salya, vajina gibi çok farklı
kaynaklardan, lizojen fajlar ise konakçı hücreden izole edilebilir. İzole edilen fajların
çoğu, aynı türe ait bir ya da birkaç starter suş ile sınırlı konakçı aralığına sahiptir.
Birçok lizojen için uygun konkçıyı bulmak ya da litik çoğalma için koşulları sağlamak
kolay değildir ve TEM’de görüntülenmeleri oldukça zordur (Mozzi ve ark., 2010).
1.3.1. Laktik Asit Bakterilerinin Fajlara Karşı Direnç Mekanizmaları
Laktik asit bakterileri hem litik, hem de ılımlı fajlar tarafından enfekte
edilebilmektedir. Ancak laktik asit bakterilerinin da farklı fajlara karşı bir savunma
mekanizması geliştirdikleri bilinmektedir. (Kılıç, 2008). Laktik asit bakterileri
tarafından geliştirilen faj direnç mekanizmaları faj enfeksiyonun çeşitli aşamalarıyla
ilişkilendirilmektedir (Sanders, 1988). Tanımlanmış dört faj direnç mekanizması
vardır:
1. Adsorbsiyon: Faja dirençli suşlar mutasyona uğramış hücre duvarı yapısına
sahiptir. Faj hücre duvarındaki reseptörleri tanır. Ancak, hücre yüzeyine
adsorbe olamaz ve bu nedenle suşu enfekte edemez.
2. Restriksiyon-Modifikasyon
Sistemleri:
Restriksiyon-modifikasyon
sistemleri restriksiyon enzimi ile modifikasyon enziminin birleşiminden
oluşur. Laktik asit bakterilerinin çoğunda bu sistem bulunmaktadır.
Restriksiyon enzimi yabancı faj DNA’ sını hücre içine girer girmez hidrolize
eder ve DNA parçalanır. Modifikasyon enzimi ise faj DNA’larının bu savunma
mekanizmasından kurtulabilmelerini sağlamaktadır.
21
3. Sonuçsuz Enfeksiyon: Sonuçsuz enfeksiyon durumunda enfeksiyonun tüm
aşamaları etkilenmektedir. Dirençli suş faj DNA’sını hücre içine almakta
ancak
yeni
faj
oluşumunu
sağlayan
tüm
aşamalar
bu
sistemden
etkilenmektedir. Laktik asit bakterilerinde bu mekanizma halen tam olarak
anlaşılamamıştır.
4. Lizojenik Bağışıklık: Bu durum, bakteri kromozomu lizojenik bir faj DNA’
sı taşıdığında gözlemlenmektedir. Profaj, diğer fajların gelişimini engelleyen
ve suşu dirençli hale getiren moleküller kodlar (Salminen, 2004; Allison ve
Klaenhammer, 1998).
Tez kapsamında fermantasyonda oldukça büyük öneme sahip olan laktik asit
bakterilerinin ve bu bakterilere karşı etkili fajlarının çeşitli çevresel kaynaklardan ve
süt ürünlerinden izolasyonu yapılarak izole edilen laktik asit bakteri fajlarının fajkonakçı etkisine bakılıp hangi bakterilere karşı etkili olduklarının, etkili fajların
konakçı üzerinde oluşturdukları koloni morfolojilerinin ve hangi yaşam döngüsüne
sahip olduğunun anlaşılabilmesi amaçlanmıştır. Böylelikle laktik asit bakteri fajlarının
özelliklerinin anlaşılması ve endüstride çok büyük ekonomik kayıplara neden olan bu
sorunun çözümü için yol gösterir nitelikte olması beklenmektedir.
22
2. GEREÇ VE YÖNTEM
2.1. Gereç
2.1.1. Araştırmada Kullanılan Laktik Asit Bakteri ve Bakteriyofaj Kaynakları
Çalışmada bakteri ve bakteriyofaj izolasyon kaynağı olarak; Gürcistan’ ın çeşitli
bölgelerinden temin edilen 3 ev yapımı matsoni (Gürcistan’ da üretilen yoğurt benzeri
fermente bir süt ürünü), 4 çiğ süt örneği, Varşova (Polonya)’ dan temin edilen 1 adet
lor peyniri, 1 adet İtalyan tipi süzme peynir, Budapeşte (Macaristan)’den temin edilen
1 adet kaşkaval peyniri, 1 adet Kamember peyniri ve Tiflis (Gürcistan)’dan temin
edilen 1 adet tuzlu sert köy peyniri (immeruli) olmak üzere 5 çeşit peynir örneği, Tiflis
(Gürcistan)’ te bulunan bir süt fabrikasından alınan atık su örneği ve Kura nehri (Tiflis,
Gürcistan)’ nin 3 farklı bölgesinden alınan atık su örnekleri olmak üzere toplamda 16
farklı örnek kullanılmıştır. Peynir, matsoni ve çiğ süt örnekleri alındıkları paketler
içerisinde +4 oC’ de saklanarak, Kura nehri ve süt fabrikasından alınan atık su örnekleri
ise steril örnek toplama kapları içerisinde laboratuvara getirilmiştir. Tüm örnekler
kullanımlarına kadar +4’ oC’ de muhafaza edilmişlerdir.
23
2.1.2. Bakteri Kaynakları
Bu çalışmada çeşitli kaynaklardan izole edilen ve Eliava Bakteriyofaj, Mikrobiyoloji
ve Viroloji Enstitüsü (IBMV) kültür kolleksiyonundan temin edilen 59 laktik asit
bakterisi kullanılmıştır. Bunlardan 31’ i Lactobacillus, 14’ ü Streptococcus, 14’ ü
Enterococcus cinslerine ait laktik asit bakterileridir. Bu suşlardan 4’ ü Eliava IBMV
kültür koleksiyonundan: K4, 31, B7 2-4, I3; 37 izolat George Eliava Enstitüsü
Araştırma&Geliştirme bölümünden: 7BX, Tg 1-3, Tg 1-4, Al 2-3, 34, 50B, 51B, 52,
53S, 53R, 55B, 58B, 59, Kd3, Bj 2-3, Kr, Go3, B1, 43B, 47B, 48B, 2S, 2B, 4S, 5AS,
6AX, 6B, 7B, 1AS, 6AB, 8, 8AB, 9, 9A, 9AS, 47S, 49S temin edilmiştir. 18 suş
çeşitli ev yapımı matsoni, çiğ süt ve peynir örneklerinden izole edilmiştir: ZI, 100C,
100S, 100B, 101S, 101B, 102S, 102M, 102B, 103S, 103B, 104S, 104M, 104B, Ma1S,
Ma1M, M1S, M1M. Çizelge 2.1 - 2.3’ te kullanılan bakteriler ve izolasyon kaynakları
verilmiştir.
24
Çizelge 2.1. Kullanılan Lactobacillus sp. bakterilerin kodları ve alındıkları ya da izole
edildikleri kaynaklar.
No
Bakteri Kodu
Alındığı Yer
Kaynak
1
K4
Tiflis (Gürcistan)
IBMV Kültür kolleksiyonu
2
31
Teleti (Gürcistan)
IBMV Kültür kolleksiyonu
3
B7 2-4
Tiflis (Gürcistan)
IBMV Kültür kolleksiyonu
4
I3
Tiflis (Gürcistan)
IBMV Kültür kolleksiyonu
5
ZI
Senaki (Gürcistan)
Süt
6
7BX
Tiflis (Gürcistan)
Süt
7
Tg 1-3
Teguti (Ermenistan)
Yoğurt
8
Tg 1-4
Teguti (Ermenistan)
Yoğurt
9
Al 2-3
Alaverdi (Ermenistan)
Yoğurt
10
100C
Budapeşte (Macaristan)
Kaşkaval peyniri
11
100S
Budapeşte (Macaristan)
Kaşkaval peyniri
12
100B
Budapeşte (Macaristan)
Kaşkaval peyniri
13
102S
Varşova (Polonya)
Lor peyniri
14
102M
Varşova (Polonya)
Lor peyniri
15
102B
Varşova (Polonya)
Lor peyniri
16
34
Tiflis (Gürcistan)
Matsoni
17
50B
Tiflis (Gürcistan)
Matsoni
18
51B
Mtskneti (Gürcistan)
Matsoni
19
52
Axalsopeli (Gürcistan)
Matsoni
20
53S
Axalsopeli (Gürcistan)
Matsoni
21
53R
Axalsopeli (Gürcistan)
Matsoni
22
55B
Axalsopeli (Gürcistan)
Matsoni
23
58B
Mtskneti (Gürcistan)
Matsoni
24
59
Mtskneti (Gürcistan)
Matsoni
25
Kd3
Kurdgelauri (Gürcistan)
Matsoni
26
Bj 2-3
Borjomi (Gürcistan)
Matsoni
27
Kr
Kaspi bölgesi (Qetvi Xevi)
Matsoni
28
Go3
Gori (Xidistavi)
Matsoni
29
B1
Batum (Axalsheni)
Matsoni
30
Ma1S
Tiflis (Gürcistan)
Matsoni
31
Ma1M
Tiflis (Gürcistan)
Matsoni
25
Çizelge 2.2. Kullanılan Streptococcus sp. bakterilerin kodları ve alındıkları ya da izole
edildikleri kaynaklar.
No
Bakteri Kodu
Alındığı Yer
Kaynak
1
43B
Senaki (Gürcistan)
Matsoni
2
47B
Axalsopeli (Gürcistan)
Matsoni
3
48B
Tiflis (Gürcistan)
Matsoni
4
2S
Senaki (Gürcistan)
Süt
5
2B
Senaki (Gürcistan)
Süt
6
4S
Senaki (Gürcistan)
Süt
7
5AS
Senaki (Gürcistan)
Süt
8
6AX
Asureti (Gürcistan)
Süt
9
6B
Asureti (Gürcistan)
Süt
10
7B
Tiflis (Gürcistan)
Süt
11
M1 S
Tiflis (Gürcistan)
Süt
12
M1 M
Tiflis (Gürcistan)
Süt
13
101S
Budapeşte (Macaristan)
Kamember peyniri
14
101B
Budapeşte (Macaristan)
Kamember peyniri
Çizelge 2.3. Kullanılan Enterococcus sp. bakterilerin kodları ve alındıkları ya da izole
edildikleri kaynaklar.
No
Bakteri Kodu
Alındığı Yer
Kaynak
1
103S
Varşova (Polonya)
Süzme peynir
2
103B
Varşova (Polonya)
Süzme peynir
3
104S
Tiflis (Gürcistan)
İmmeruli peyniri
4
104M
Tiflis (Gürcistan)
İmmeruli peyniri
5
104B
Tiflis (Gürcistan)
İmmeruli peyniri
6
1AS
Senaki (Gürcistan)
Süt
7
6AB
Asureti (Gürcistan)
Süt
8
8
Senaki (Gürcistan)
Süt
9
8AB
Senaki (Gürcistan)
Süt
10
9
Gori (Gürcistan)
Süt
11
9A
Gori (Gürcistan)
Süt
12
9AS
Gori (Gürcistan)
Süt
13
47S
Axalsapeli (Gürcistan)
Matsoni
14
49S
Tiflis (Gürcistan)
Matsoni
26
2.1.3. Kullanılan Besiyerleri
Tamponlanmış Yağsız Süt
İçerik
Kaymağı alınmış süt tozu
g/L
100,00
Disodyum hidrojen ortofosfat (Na2HPO4)
5,00
Potasyum hidrojen ortofosfat (KH2PO4)
2,50
Son pH (25 oC de): 6,7±0,1
Ticari olarak elde edilen besiyerinin (HiMedia Lab., Mumbai, Hindistan) 100 g’ ı 1000
mL distile suya eklenip çözülmüş ve otoklavda 121 oC’ de 15 dk. sterilize edilerek
hazırlanmıştır. Hazırlanan bu besiyeri kazeinin koagülasyonu ve proteolizine bağlı
olarak laktik asit bakterilerinin aktifleştirilmesi için kullanılmıştır.
M17 (Terzaghi ve Sandine, 1975) Agar
İçerik
g/L
Hayvan dokularının peptik dijesti
5,00
Soya fasülyesi küspesi papaik dijesti
5,00
Maya özütü
2,50
Sığır eti özütü
5,00
Askorbik asit
0,50
Disodyum--gliserofosfat
19,00
Magnezyum sülfat
0,25
Laktoz
5,00
Agar
10,00
Son pH (25 oC’de): 7,1±0,1
27
Ticari olarak elde edilen besiyerinin (HiMedia Lab., Mumbai, Hindistan) 33,25 g’ ı
1000 mL distile suya eklenmiş, tamamının çözülmesi için kaynayana kadar ısıtılarak
hazırlanmıştır. Çözüldükten sonra otoklavda 121 oC’ de 15 dk. sterilize edilmiştir. 45
C’ ye kadar soğutulup petri kaplarına dökülmüştür. Hazırlanan bu besiyeri laktik
o
Streptokokların izolasyonu için kullanılmıştır.
M17 (Terzaghi ve Sandine, 1975) Sıvı Besiyeri
İçerik
g/L
Hayvan dokularının peptik dijesti
2,50
Kazein hidrolizat
2,50
Soya fasülyesi küspesi papaik dijesti
5,00
Maya özütü
2,50
Sığır eti özütü
5,00
Laktoz
5,00
Askorbik asit
0,50
Disodyum--gliserofosfat
19,00
Magnezyum sülfat
0,25
Son pH (25 oC’de): 7,1±0,1
Ticari olarak elde edilen besiyerinin (HiMedia Lab., Mumbai, Hindistan) 42,25 g’ ı
1000 mL distile suya eklenmiş, tamamının çözülmesi için kaynayana kadar ısıtılarak
hazırlanmıştır. Çözüldükten sonra otoklavda 121 oC’ de 15 dk. sterilize edilmiştir.
Hazırlanan bu besiyeri laktik Streptokokların aktifleştirilmesi için kullanılmıştır.
Lactobacillus MRS (De Man ve ark., 1960) Agar
İçerik
g/L
Proteoz pepton
10,00
Sığır eti özütü
10,00
Maya özütü
5,00
28
Dekstroz
20,00
Polisorbat 80
1,00
Amonyum sitrat
2,00
Sodyum asetat
5,00
Magnezyum sülfat
0,10
Mangan sülfat
0,05
Dipotasyum fosfat
2,00
Agar
12,00
Son pH (25 oC’ de): 6,5±0,2
Ticari olarak elde edilen besiyerinin (HiMedia Lab., Mumbai, Hindistan) 67,15 g’ ı
1000 mL distile suya eklenmiş, tamamının çözülmesi için kaynayana kadar ısıtılarak
hazırlanmıştır. Çözüldükten sonra otoklavda 121 oC’ de 15 dk. sterilize edilmiştir. 45
C’ ye kadar soğutulup petri kaplarına dökülmüştür. Hazırlanan bu besiyeri tüm
o
Lactobacillus cinslerinin üremesi için kullanılmıştır.
Lactobacillus MRS (De Man ve ark., 1960) Sıvı Besiyeri
İçerik
g/L
Proteoz pepton
10,00
Sığır eti özütü
10,00
Maya özütü
5,00
Dekstroz
20,00
Polisorbat 80
1,00
Amonyum sitrat
2,00
Sodyum asetat
5,00
Magnezyum sülfat
0,10
Mangan sülfat
0,05
Dipotasyum fosfat
2,00
Son pH (25 oC’ de): 6,5±0,2
29
Ticari olarak elde edilen besiyerinin (HiMedia Lab., Mumbai, Hindistan) 55,15 g’ ı
1000 mL distile suya eklenmiş, tamamının çözülmesi için kaynayana kadar ısıtılarak
hazırlanmıştır. Çözüldükten sonra otoklavda 121 oC’ de 15 dk. sterilize edilmiştir.
Hazırlanan bu besiyeri tüm Lactobacillus cinslerinin aktifleştirilmesi için
kullanılmıştır.
Bile Esculin Azide Agar (BEAA)
İçerik
g/L
Kazein hidrolizat
17,00
Hayvan dokularının peptik dijesti
3,00
Maya özütü
5,00
Oxgall
10,00
Sodyum klorür
5,00
Eskulin
1,00
Ferrik amonyum sitrat
0,50
Sodyum azid
0,25
Sodyum sitrat
1,00
Agar
13,50
Son pH (25 oC’ de): 7,1±0,2
Ticari olarak elde edilen besiyerinin (HiMedia Lab., Mumbai, Hindistan) 56,25 g’ ı
1000 mL distile suya eklenmiş, tamamının çözülmesi için kaynayana kadar ısıtılarak
hazırlanmıştır. Çözüldükten sonra otoklavda 121 oC’ de 15 dk. sterilize edilmiştir. 45
C2 ye kadar soğutulup petri kaplarına dökülmüştür. Hazırlanan bu besiyeri
o
Enterokokların belirlenmesi için kullanılmıştır.
Bakteriyofaj izolasyonu için;
Derişik M17 sıvı besiyeri (HiMedia Lab., Mumbai, Hindistan) (x10),
Derişik MRS sıvı besiyeri (HiMedia Lab., Mumbai, Hindistan) (x10) kullanılmıştır.
30
2.1.4. Kullanılan Kimyasallar ve Çözeltiler
Fizyolojik tuzlu su çözeltisi (Serum fizyolojik)
Sodyum klorür (NaCl)
8,50 g
Distile su
1000 mL
8,50 g NaCl 1000 mL distile suda çözülerek hazırlanmış ve otoklavda 121 oC’ de 15
dk. sterilize edilmiştir.
0,1 M Magnezyum sülfat (MgSO4) çözeltisi
Susuz MgSO4
12,00 g
Distile su
100 mL
100 mL distile suya 12,00 g susuz MgSO4 eklenerek çözülmüş ve otoklavda 121 oC’
de 15 dk. sterilize edilmiştir.
Mitomisin C (MC) stok çözeltisi
MC
2 mg
Steril 0,1 M MgSO4
4 mL
4 mL steril 0,1 M’ lik MgSO4 çözeltisine 2 mg MC eklenerek hazırlanmıştır.
1 M Kalsiyum klorür (CaCl2) çözeltisi
Susuz CaCl2
11,1 g
Distile su
100 mL
11,1 g susuz CaCl2 100 mL distile suda çözülerek hazırlanmış ve otoklavda 121 oC de’
15 dk. sterilize edilmiştir.
31
Kristal viyole çözeltisi
Kristal viyole
1g
Asit – Fenik kristali (fenol kristali)
2g
Etil alkol (% 96)
10 mL
Distile su
100 mL
Kristal viyole ve fenol kristali porselen havanda ezilip üzerine yavaşça etil alkol
eklenerek hazırlanmıştır.
Lugol çözeltisi
İyot
1g
Potasyum iyodür (KI)
2g
Distile su
300 mL
İyot ile KI havanda iyice ezilip üzerine yavaş yavaş distile su ilave edilmiş ve iyice
karıştırılarak hazırlanmıştır.
Safranin çözeltisi
Safranin
0,5 g
Etil alkol (%95)
10 mL
Distile su
100 mL
Safranin etil alkol içinde çözündürüldükten sonra distile su ile karıştırılarak
hazırlanmıştır.
Anaerobik koşulların sağlanması için;
Anaerogas Pack 3,5 L (HiMedia Lab. Pvt. Ltd., Mumbai, Hindistan) kullanılmıştır.
32
2.1.5. Kullanılan Cihazlar
Tez kapsamında kullanılan cihazlar Çizelge 2.4’ te belirtilmiştir.
Çizelge 2.4. Çalışmada kullanılan cihazlar, marka ve firma bilgileri.
Cihaz
Marka-Model
Firma
Su banyosu
Precision
LabMechanics, Winchester, Virjinya
Mini Vorteks
VWR VM-3000
VWR International, ABD
Santrifüj
Thermo IEC MultiRF
Thermo Scientific, ABD
İnkübatör
VWR Signature
VWR International, ABD
Hasas terazi
VWR
VWR International, ABD
Işık mikroskobu
VWR
VWR International, ABD
Elektron mikroskobu
100CX II TEM 100kV
JOEL Ltd., Akishima, Tokyo,Japonya
2.2. Yöntem
2.2.1. Laktik Asit Bakterilerinin Farklı Kaynaklardan İzolasyonu
Laktik asit bakterilerinin izolasyonu için peynir örnekleri steril kabinde steril
mikropipet ucu yardımıyla bir miktar alınarak, matsoni ve çiğ süt örnekleri ise direkt
mikropipet ile tamponlanmış yağsız süt içerisine aktarılmış ve 37 oC’ de bir gece
inkübasyona bırakılmıştır. Ertesi gün üreme gözlenen tüplerden MRS ve M17 sıvı
besiyerine inokule edilmiş, 37 oC’ de bir gece inkübasyona bırakılmıştır. Daha sonra
M17 sıvı besiyerinden alınan örnekler M17 agara, MRS sıvı besiyerinden alınan
örnekler MRS agara ekilmiş, 37 oC’ de anaerobik koşullar altında bir gece inkübasyona
bırakılmıştır. MRS besiyeri Lactobacillus cinslerinin, M17 besiyeri Streptococcus ve
Enterococcus cinslerinin izolasyonu için kullanılmıştır. Bakterilerin saflaştırılması
için birçok kez bakterilerden M17 ve MRS agara tek koloni ekimi yapılmıştır. Daha
33
sonra MRS ve M17 agardan alınan kolonilere Gram boyama yapılmış ve
mikroskoptaki görünümleri incelenerek MRS agarda üreyen bakterilerin basil, M17
agarda üreyen bakterilerin kok oldukları teyit edilmiştir.
2.2.2. Laktik Asit Bakterilerinin Tiplendirilmesi
İzole edilen laktik asit bakterilerinin tiplendirilmesi için fizyolojik ve biyokimyasal
testler uygulanmıştır.
Morfolojik testler;
Koloni morfolojilerinin incelenmesi için 24 saatlik taze kültürler kullanılmıştır. Katı
besi ortamında farklı tipteki kolonilerden ayrılmış tek tip koloniler kullanılarak
inceleme yapılmıştır. Petride oluşan kolonilerin şekil, renk, büyüklük, kenar yapısı
gibi morfolojik özellikleri çıplak gözle incelenmiştir.
Gram boyama:
Gram boyama suşların hücre şekilleri ve hücre duvar yapılarını incelemek için
kullanılmıştır. 24 saatlik kültürlerden hazırlanan preparatlar Gram boyama metodu
(Şekil 2.1) kullanılarak boyanmıştır. Metoda göre, sıvı ve katı kültür ortamından öze
ile alınıp lam üzerine yayılan bakteri kültürünün havada kuruması sağlanmış ve 3 defa
alevden geçirilerek fiziksel tesbit yapılmıştır. Lam (preparat) üzerine Kristal viyole
damlatılıp 1-2 dakika boyanmıştır. Daha sonra boya dökülmüş ve lugol çözeltisi
damlatılıp 1-2 dakika daha beklenmiştir. % 95' lik Etil Alkol ve su ile boya
akmayıncaya kadar yıkama yapılmış ve sonra lam üzerine (preparat) safranin
dökülerek 15-20 saniye beklenmiştir. Boya dökülüp lam yıkanarak kurulanmıştur.
34
Kristal viyole
Lugol çözeltisi
Etil alkol
Safranin
Gram(+)
Gram(-)
Şekil 2.1. Gram boyama
Daha sonra bir damla immersiyon yağı damlatılarak mikroskopla incelenmiştir. Mavimor renkli bakteriler Gram pozitif, pembe-kırmızı renkli bakteriler ise Gram negatif
olarak değerlendirilmiştir.
Biyokimyasal testler;
Bile Eskulin testi:
Kok oldukları tespit edilen bakteriler Bile Esculin Azide Agar (ayırt edici besiyeri)’ a
ekilmiş ve 35 oC’ de 24 saat anaerobik koşullar altında inkübe edilmiştir. Çevresinde
siyah-kahverengi haleler gözlenen koloniler Enterokok olarak değerlendirilmiştir.
Bile Esculin Azide Agar içerisindeki safra Gram-pozitif streptokokların gelişimini,
sodyum azid ise Gram-negatif bakteri gelişimini inhibe eder. Besin kaynağı olarak
esculin ve pepton, renk indikatörü olarak ferrik sitrat içerir. Eskulin alkole bağlanan
bir karbonhidrattır. Enterokoklar esculini hidroliz edebilirler ve yan ürün olarak
eskulatine dönüştürürler. Eskulatin ferrik sitratla reaksiyona girerek siyah renk
oluşturur.
35
2.2.3. Laktik Asit Bakterilerinin Patojen Bakterilere Karşı Antagonistik
Aktiviteleri
Birçok laktik asit bakterisi patojenlere karşı antagonistik aktivite gösterir. Süt
endüstrisinde kullanılan starter kültürlerin antagonistik aktivite yoluyla birbirine karşı
rekabet etmemesi ve birbirlerinin gelişimini baskılamaması önemlidir.
Tez kapsamında kullanılan bazı laktik asit bakterilerinin patojen bakterilere karşı
antagonistik aktiviteleri test edilmiştir. Bu amaçla 2 yöntem kullanılmıştır. Bunlardan
ilki katı besiyerinde paralel çizgi metodu (Moore T. ve ark., 2013) yöntemi, ikincisi
ise agar difüzyon yöntemi (Lertcanawanichakul ve Sawangnop, 2008) dir.
Paralel-çizgi metoduna göre, test edilecek laktik asit bakterilerinin ve patojen
bakterilerin bir gecelik taze kültürleri hazırlanmıştır. Test edilecek laktik asit
bakterileri için uygun katı besiyeri petri kaplarına 18-25 ml dökülüp dondurulmuştur.
Hazırlanan taze kültürlerin her biri bir besiyeri yüzeyine çizgi şeklinde ekilmiştir.
Daha sonra patojen bakteri kültürleri laktik asit bakterilerine dikey çizgiler şeklinde
besiyeri yüzeyine ekilmiş ve 37 oC’ de 24 saat anaerobik koşullar altında inkübasyona
bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda sonuçlar patojen bakterilerinin üremesini inhibe
eden bölgeler ölçülerek değerlendirme yapılmıştır. Şekil 2.2’ de yöntem özetlenmiştir.
36
Test bakterisi
Patojen bakteridiğer laktik asit
bakterileri
Şekil 2.2. Paralel çizgi metodu. a, çizgi şeklinde inokule edilen test bakterisi (laktik
asit bakterisi); b, test bakterisine dikey çizgi şeklinde inoküle edilen patojenler ya da
diğer laktik asit bakterileri; c, inkübasyondan sonra gözlemlenen sonuçlar.
Agar-difüzyon yöntemine göre, laktik asit bakterileri (test bakterileri) ve patojenlerin
ya da diğer laktik asit bakterilerinin (indikatör bakteri) taze kültürleri hazırlanmıştır.
İndikatör bakteriler hücre parçalarının uzaklaştırılması için 5000 rpm’ de 20 dk.
santrifüj edilmiş ve süpernatant toplanmıştır. Kullanılan bakteriye uygun agardan 2025 mL petri kutularına dökülmüş ve kullanılan bakteriye uygun yumuşak agarın
(%0,7) sıcaklığı su banyosunda 48 oC’ de sabitlenmiştir. Sıcaklığı sabitlenen 3 mL
yumuşak agar ve 100 µL test bakterisi karıştırılmış, daha önce dökülüp dondurulmuş
olan uygun agar üzerine dökülmüştür. Dökülen karışım hızlıca petri kabına yayılmış
ve steril kabinde kurumaya bırakılmıştır. Kuruduktan sonra petri üzerinde 6 mm
çapında kuyular açılmış ve her kuyu içerisine 100 µL indikatör bakteri koyulmuştur.
Petriler 37 oC’ de 24-48 saat anaerobik koşullar altında inkübasyona bırakılmıştır.
İnkübasyondan sonra kuyucuklar etrafında oluşan inhibisyon zonlarının çapları
ölçülmüştür. Şekil 2.3’ te yöntem özetlenmiştir. Her iki yöntem için de ölçülen
değerler10-20 mm arasında ise pozitif, <10 mm ise negatif olarak değerlendirilmiştir
(Fauzi ve ark., 2013; Kıvanç ve ark., 2011).
37
Test bakterisinin
inokülasyonu
İndikatör
bakteri
İnhibisyon
zonu
Şekil 2.3. Agar-difüzyon yöntemi. A, laktik asit bakterilerinin petri kabı içine
inokülasyonu; B, agar üzerine kuyuların açılması; C, kuyuların içerisine indikatör
bakterilerin ilavesi; D, oluşan inhibisyon zonlarının ölçümü.
2.2.4. Bakteriyofajların Farklı Kaynaklardan İzolasyonu
Laktik asit bakterilerinin birçoğu bakteriyofaj taşır. Bu durum, süt endüstrisinde süt
ürünlerinin üretiminde kullanılan starter kültürlerde ani lizislere neden olarak büyük
ürün kayıplarına sebebiyet vermektedir. Bu nedenden dolayı bakteriyofaj taşımayan
starter kültürlerin endüstride kullanılması önemlidir.
Bakteriyofaj taşıyan laktik asit bakterileri suşlarının tespiti için Tiflis, Gürcistan’ ın
yerel market ve pazarlarından toplanan çiğ süt ve matsoni (Gürcistan’ ın geleneksel
süt ürünü) örnekleri ile Kura nehri ve peynir fabrikalarından (Tiflis, Gürcistan)
toplanan atık su örnekleri kullanılmıştır. Toplanan örnekler kullanımlarına kadar +4
C’ de muhafaza edilmiştir.
o
38
Atık su örnekleri için önce bakteriyel besiyeri ile zenginleştirme yapılmıştır. Bu
amaçla, test bakterileri: derişik besiyeri (x10): nehir ya da işletmelerden alınan atık su
örneği; 1:1:10 (h/h/h) oranında steril santrifüj tüpüne aktarılmış ve 37 oC de 24 saat
inkübe edilmiştir. İnkübasyondan sonra 6000 rpm 15 dk. santrifüj edilip süpernatantı
(santrifüjden sonra çökeleğin üstünde kalan sıvı kısım) alınarak 0,45 m’ lik membran
filtreden (Acrodisc 13 mm şırınga filtre, New York, ABD) geçirilmiştir. Elde edilen
süzüntü faj kaynağı olarak kullanılmıştır.
Benzer şekilde çiğ süt ve matsoni örnekleri de öncelikle partiküllerinin
uzaklaştırılması amacıyla 6000 rpm (dv/dk)’ de 15 dk. santrifüj edilmiş, süpernatantı
alınarak 0,45 m lik membran filtreden (Acrodisc 13 mm şırınga filtre, New York,
ABD) geçirilmiştir. Elde edilen filtrat: derişik sıvı besiyeri (x10) (konakçı bakterinin
ürediği uygun besi ortamı seçilmiştir): konakçı bakteri olarak test edilecek olan bir
gecelik taze kültür; 10: 1: 1 oranında steril santrifüj tüpüne aktarılmış ve 37 oC de 24
saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyondan sonra, oluşan hücre artıklarını
uzaklaştırılması amacıyla 6000 rpm’ de 15 dk. santrifüj edilmiş ve süpernatant 0,45
m membran filtreden geçirilerek süzüntünün bakterilerden arındırılması sağlanmıştır.
Elde edilen süzüntü faj kaynağı olarak kullanılmış ve kullanımına kadar +4 oC’ de
muhafaza edilmiştir (Clokie ve Kropinski, 2009).
Lizojenik bakteriyofaj izolasyonu için çeşitli kaynaklardan izole edilen suşlara
Mitomisin C testi uygulanmıştır. Bu amaçla kullanılacak sıvı besiyerine son
konsantrasyonu 0.1 g/mL (h/h) olacak şekilde Mitomisin C ilave edilmiştir.
Mitomisin C içeren sıvı besiyeri her tüpte 5 er mL olacak şekilde steril tüplere
aktarılmıştır. Bu tüpler içerisine test edilecek olan bakterilerin bir gecelik taze
kültürlerinden 200 l eklenmiştir. Kontrol için ise Mitomisin C içermeyen sıvı besiyeri
kullanılmıştır. Tüpler 37 oC de inkübasyona bırakılmış ve 24 saat sonra sonuçlar
değerlendirilmiştir. Üreme görülmeyen tüpler 0.45 L’ lik membran filtreden
39
geçirilmiş ve bakteriyofaj içeriğini test etmek için spot test uygulanmıştır. Filtratlar faj
kaynağı olarak kullanılmış ve kullanımına kadar +4 oC de muhafaza edilmiştir (Clokie
ve Kropinski, 2009).
2.2.5. Laktik Asit Bakterilerine Karşı Bakteriyofaj Varlığının Belirlenmesi
İzolasyondan sonra faj varlığının belirlenmesi için spot test (Clokie ve Kropinski,
2009) uygulanmıştır. Bu prosedüre göre, öncelikle izolasyonda konakçı olarak
kullanılan bakterilerin taze kültürleri hazırlanmıştır. 20-25 mL MRS ya da M17 agar
içeren petri kapları, kullanılacak bakteri adedi kadar bölmelere ayrılmıştır. Daha sonra
petri kabının üst kısmına bir öze dolusu taze kültür koyulmuş, damlanın inmesi
beklenmiştir. Petri kaplarına çizgi şeklinde bakteri ekimi anlatıldığı şekilde tüm
bakteriler için uygulandıktan sonra, petri kapları steril kabinde kurumaya bırakılmıştır.
Kuruduktan sonra bakteriyofaj kaynaklarından mikropipet yardımıyla 5’ er L
alınarak çizgiler üzerine damlatılmış ve tekrar steril kabinde kurumaya bırakılmıştır.
Kuruyan petri kapları 37 oC’ de anaerobik koşullar altında 24-48 saat inkübasyona
bırakılmıştır. İnkübasyondan sonra faj damlatılan noktalarda meydana gelen lizisler
(bakteri ölümleri) faj varlığını göstermiştir.
2.2.6. Bakteriyofajların Saflaştırılması
Bakteriyofaj varlığının belirlenmesinden sonra pozitif sonuç veren petrilerden lizisli
bölgeler öze yardımıyla kesilerek ya da mikropipet yardımıyla alınmış ve 1-2 mL sıvı
40
besiyeri içerisine koyulmuştur. Bir saat 37 oC’ de inkübasyondan sonra (bu işlemin
amacı lizisli bölgeden elde edilen fajın besiyerine aktarılmasıdır) bir saat buzdolabında
bekletilmiş ve 0,45 m’ lik membran filtreden geçirilmiştir. Filtrat kullanımına kadar
+4 oC’ de muhafaza edilmiştir.
Farklı morfolojiye sahip fajların ayrımının yapılabilmesi için Çift Tabaka Agar
yöntemi kullanılmış ve bu prosedür aynı morfolojiye sahip faj plakları görülene kadar
tekrar edilmiştir. Bu amaçla, elde edilen filtrattan sıvı besiyeri kullanılarak 10-1’ den
10-10’ a kadar seri seyreltmeler hazırlanmış ve her bir seyreltmeden 1 mL alınıp steril
tüplere aktarılmıştır. Üzerine konakçı bakterinin bir gecelik taze kültüründen 200 L
eklenerek hafifçe karıştırılmış ve 5 dk. faj-konakçı adsorbsiyonu için bekletilmiştir.
Daha sonra üzerine sıcaklığı su banyosunda 48 oC’ de sabitlenmiş 3 mL yumuşak agar
(% 0,7) ilave edilerek hızlıca karıştırılmıştır. Bu karışım daha önceden 15-20 mL agar
(% 1,8) dökülüp dondurulmuş olan petri kaplarına dökülerek homojen bir şekilde
yayılmış ve donması için bekletilmiştir. Petri kapları 37 oC’ de anaerobik koşullar
altında 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır.
İnkübasyondan sonra plak morfolojisi incelenmiştir. Bu amaçla, petrilerde plakların
(lizisli bölgeler) tek düştüğü bölgeden tek bir plak öze yardımıyla kesilerek ya da
mikropipet yardımıyla alınıp 2-2,5 mL sıvı besiyeri içeren tüpe aktarılıp
karıştırılmıştır. Bu tüp 37 oC’ de 1 saat inkübe edilmiş ve inkübasyondan sonra 1 saat
buzdolabında bekletilmiştir. Daha sonra 0,45 m’ lik membran filtreden geçirilmiş ve
saf faj kaynağı olarak kullanılmıştır. Bu prosedür petride aynı morfolojiye sahip faj
plakları görülene kadar tekrar edilmiştir (Clokie ve Kropinski, 2009).
41
2.2.7. Çift Tabaka Agar Yöntemi ile Bakteriyofaj Titresinin Belirlenmesi
Faj titresinin belirlenmesi için çift tabaka agar yöntemi (Spencer ve Spencer, 2001)
kullanılmıştır (Şekil 2.4). Bu amaçla, öncelikle faj stoğundan 10-1 den 10-10’ a kadar
seri seyreltmeler hazırlanmıştır. Hazırlanan her bir seyreltmeden 1 mL alınarak steril
tüplere aktarılmış ve üzerine 100 L bir gecelik taze kültürden ilave edilip
karıştırılmıştır. Karışım 5 dk. oda sıcaklığında bekletilmiştir. Üzerine su banyosunda
sıcaklığı 48 oC’ de sabitlenmiş yumuşak agar (% 0,7) ilave edilip karıştırılmış ve daha
önceden 15-20 mL agar (%1,8) koyulup dondurulmuş olan petri kaplarına hızlıca
dökülerek yayılmıştır. Steril kabinde yumuşak agarın tamamen donması için bekletilip
37
C’ de anaerobik koşullar altında 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır.
o
İnkübasyondan sonra lizis (plak) görülen petriler sayılarak faj titresi belirlenmiştir.
Yumuşak agar
İnkübasyon
Şekil 2.4. Çift tabaka agar yöntemi.
42
Titre belirlemek için;
Faj Titresi = Plak sayısı x Seyreltme faktörü x Seyreltme oranı pfu/mL
(burada kullanılan ‘pfu’ plak oluşturma birimini ifade eder) formülü kullanılmıştır.
Örneğin; 10-5’ lik seyreltme kullanılmış petride 50 plak oluşmuşsa faj titresi 50 x 105
x 10 = 5 x 107 pfu/mL olarak belirlenmiştir.
Çif tabaka agar yöntemi sadece canlı bakteriyofajlar hakkında bilgi sahibi olmamızı
sağlayan bir yöntemdir. Çünkü ancak bakteriyofaj konakçı bakteriyi enfekte ettiğinde
lizis görebiliriz.
2.2.8. Bakteriyofaj Zenginleştirme
Faj zenginleştirme, yani faj konsantrasyonunu arttırmak için iki yöntem kullanılmıştır;
1. Yöntem:
Faj titresinin ilk faj stoğundan belirlenmesinden sonra faj plaklarının miktarını
hesaplamak mümkündür. Teorik olarak petride 105 faj plağı vardır ve plak net olarak
isimlendirilir. Her plakta 105 faj partikülü olduğu düşünülür. Yani, teorik olarak eğer
bu petriyi 1 mL sıvı besiyeri ile yıkarsak, 1010 pfu/mL faj elde etmiş oluruz. Petrileri
yıkamadan önce kapağı altta kalacak şekilde ters çevrilip kapağa 1-2 damla kloroform
damlatılmış ve bu pozisyonda 0,5 - 1 saat oda sıcaklığında ya da buzdolabında
bekletilmiştir. Kloroform bakteri hücrelerinin patlamasını ve fajların dışarı çıkmasını
sağlar. Daha sonra petriler kapakları üste gelecek pozisyona getirilmiş ve uygun steril
sıvı besiyeri (her plak için 1-2 mL) ile yıkanmıştır. Bu pozisyonda 1 saat buzdolabında
43
bekletilmiş ve sonra üst katmanı toplanmıştır. Toplanan kısım steril santrifüj tüplerine
aktarılıp 5000 rpm’ de 15-20 dk. santrifüj edilmiştir (Şekil 2.5) (Adams, 1959).
Alternatif olarak sadece üst katmanın üzerinde kalan sıvı besiyeri toplanıp pipet
yardımıyla santrifüj tüpüne alınarak aynı şekilde santrifüj edilebilir (Davis ve
Sinsheimer, 1963). Her iki yöntemde de süpernatant steril bir tüpe aktarılır ve
membran filtreden (por çapı: 0,45 µm) geçirilir. Kullanımına kadar +4 oC’ de saklanır.
kloroform
+4 oC
Sıvı besiyeri
5000 rpm 15-20 dk.
Membran filtre
Şekil 2.5. Faj zenginleştirme.
44
2. Yöntem:
Spencer ve Spencer (2001)’ ın metoduna göre, bir gecelik taze kültürden 100 L
alınarak steril bir tüpe aktarılmış ve üzerine 3 mL sıcaklığı su banyosunda sabitlenmiş
48 oC yumuşak agar (% 0,7, kullanılan bakteriye uygun) eklenmiş, hızlıca karıştırılarak
daha önceden 15-20 mL agar (%1,8) dökülüp dondurulmuş petri kabına dökülmüştür.
Petri kabına homojen bir şekilde yayıldıktan sonra steril kabinde donmaya
bırakılmıştır. Tamamen donduktan sonra petri kabı yaklaşık 20-30 bölmeye
ayrılmıştır. Saflaştırılmış faj kaynağından 5 L mikropipet yardımıyla alınarak ayrılan
bölmelere damlatılmış ve steril kabinde kurumaya bırakılmıştır. Tamamen kuruduktan
sonra 37 oC de anaerobik koşullar altında 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır.
İnkübasyondan sonra oluşan lizisli bölgeler öze yardımıyla kesilerek alınmış ve 5 mL
sıvı besiyeri içeren santrifüj tüpüne aktarılmıştır. 1 saat 37 oC’ de inkübasyondan sonra
1 saat buzdolabında bekletilmiş ve 5000 rpm’ de 15-20 dk. santrifüj edilmiştir. daha
sonra santrifüj tüpünden süpernatant kısmı alınarak steril bir tüpe aktarılmış, 0,45 m’
lik membran filtreden geçirilerek +4 oC’ de kullanımına kadar saklanmıştır.
2.2.9. Geçirimli Elektron Mikroskobu (Transmission Electron Microscope)
Geçirimli
elektron
mikroskobunun
sıralanmıştır;
1. Örneğin saflaştırılması
2. Sabitleme
3. Gözlemleme
4. Fotoğraflamadır.
(TEM)
görüntüleme
aşamaları
aşağıda
45
İlk olarak faj ya da bakteri örnekleri, bakteriler için bölüm 2.2.1 ve fajlar için bölüm
2.2.6’ da bahsedildiği şekilde, saflaştırılmıştır. Saflaştırılan örneklerin süspansiyonları
hazırlanmıştır: bakteri için, 4-5 saf bakteri kolonisi 500 µL serum fizyolojik içeren
tüplere aktarılmış; faj örneği ise uygun besiyeri içinde zenginleştirilmiştir (bölüm
2.2.8). Hazırlanan örnek süspansiyonundan 1 damla karbon kaplı gride damlatılmıştır.
Örneğin kuruması için 1 dk. beklenmiş ve üzerine bir damla boya (% 1 uranil asetat)
eklenmiştir. 1 dk. daha beklendikten sonra sıvı, bir filtre kağıdı yardımıyla kurutulmuş
ve grid örnek haznesine yerleştirilmiştir. Daha sonra örnek TEM altında incelenmiştir.
46
3. BULGULAR
3.1. Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu
Çalışmada laktik asit bakterilerinin izolasyonu için 2 ev yapımı matsoni örneği Tiflis,
Gürcistan’ dan, 1 çiğ süt örneği Tiflis, Gürcistan’ dan, 5 peynir örneği; 1’ i Tiflis,
Gürcistan’ da bir pazardan, 2’ si Budapeşte, Macaristan’ da bir marketten ve 2’ si
Varşova, Polonya’ da bir marketten temin edilen toplam 8 örnek kullanılmıştır.
Örneklerden izole edilen bakteriler laktik Streptokoklar ve Laktobasillerin ayrımı için
sırasıyla M17, MRS besiyerine ekilmiş daha sonra 37 oC’ de anaerobik koşullar altında
24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. M17 besiyerinde gelişim gösteren bakteriler kok,
MRS besiyerinde gelişim gösteren bakteriler basil olarak değerlendirilmiştir. Saf
kültür elde etmek için, bakteriler uygun katı besiyerine ekilmiş ve farklı tipteki
kolonilerin her birinden tek bir koloni alınıp uygun katı besiyerine tek koloni ekimi
yapılmıştır. Katı besiyerinde tek tip koloniler görülünceye kadar bu işlem
sürdürülmüştür. Daha sonra Gram boyama yapılıp hücre şekilleri mikroskop altında
incelenmiştir.
Bakterilerin hücre duvar yapılarını incelemek için, Gram boyama yapılmıştır. Gram
boyama yapılan hücreler mikroskop (100 x) altında incelenmiş ve mor-mavi renkli
bakteriler Gram-pozitif, kırmızı-pembe renkli bakteriler Gram-negatif olarak
değerlendirilmiştir.
47
Koloni morfolojilerinin tespiti için kok olarak değerlendirilen bakteriler M17 agara,
basil olarak değerlendirilen bakteriler MRS agara ekilmiş ve çıplak gözle koloni
morfolojileri incelenmiştir.
Enterokok ların ayrımı için Bile Eskulin Testi yapılmıştır. Bile Esculin Agarda siyah
röfle veren koloniler Enterokok olarak değerlendirilmiştir. Şekil 3.1’ de yapılan test
sonucunda pozitif sonuç veren bir petri görünümü gösterilmiştir.
Şekil 3.1. Bile Esculin Testi sonucunda pozitif sonuç veren bir petri görünümü.
Elde edilen sonuçlara göre 18 bakteri morfolojik ve biyokimyasal açıdan karakterize
edilmiştir. Sonuçlar Çizelge 3.1’ de özetlenmiştir
48
Çizelge 3.1. Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu.
No
Bakteri
Kodu
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
100C
100S
100B
101S
101B
102S
102M
102B
103S
103B
104S
104M
104B
ZI
Ma1S
Ma1M
M1S
M1M
Mikroskobik
Hücre
Morfolojisi
Çubuk
Çubuk
Çubuk
Kok
Kok
Çubuk
Çubuk
Çubuk
Kok
Kok
Kok
Kok
Kok
Çubuk
Çubuk
Çubuk
Kok
Kok
Koloni Morfolojisi
Renk
Çap ~mm
Parlaklık
Şekil
Kenar yapısı
Krem rengi
Krem rengi
Krem rengi
Renksiz
Krem rengi
Renksiz
Krem rengi
Krem rengi
Krem rengi
Krem rengi
Krem rengi
Krem rengi
Krem rengi
Krem rengi
Krem rengi
Krem rengi
Renksiz
Renksiz
1-2
1
2-3
1
1-2
1
1
1
1
1-2
1
1-2
2-3
2-3
1
1-2
1
1-2
Mat
Mat
Mat
Şeffaf
Mat
Şeffaf
Mat
Mat
Mat
Mat
Mat
Mat
Mat
Mat
Mat
Mat
Şeffaf
Şeffaf
Düzensiz
Yuvarlak
Düzensiz
Yuvarlak
Yuvarlak
Yuvarlak
Yuvarlak
Yuvarlak
Yuvarlak
Yuvarlak
Yuvarlak
Düzensiz
Düzensiz
Düzensiz
Yuvarlak
Yuvarlak
Yuvarlak
Yuvarlak
Girintili
Düzgün
Girintili
Düzgün
Düzgün
Düzgün
Düzgün
Düzgün
Düzgün
Düzgün
Düzgün
Girintili
Girintili
Girintili
Düzgün
Düzgün
Düzgün
Düzgün
* -, test sonucunda siyah röfle vermeyen koloniler; +, test sonucunda siyah röfle veren koloniler.
Hücre
Duvarı
Yapısı
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
Gram-pozitif
*Bile Esculin
Testi
+
+
+
+
+
-
49
Bu sonuçlara göre; 6 çubuk ve 7 kok bakteri peynir örneklerinden, 3 çubuk bakteri
matsoniden, 2 kok baktrei çiğ sütten izole edilmiştir.
3.2. Laktik Asit Bakterilerinin Patojen Bakterilere Karşı Antagonist Aktiviteleri
Tez kapsamında kullanılan Lactobacillus 58B, 53S, 59, Kd3, 102M ve Streptococcus
6AX, 5AS, 101S, 48B suşlarının, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus
ve Enterococcus sp. gibi bazı patojen bakterilere karşı antagonistik aktiviteleri test
edilmiştir. Bu amaçla, paralel çizgi ve kuyu difüzyon yöntemi olmak üzere iki yöntem
kullanılmıştır. Ancak, her iki yöntemde de kullanılan bakterilere karşı herhangi bir
antagonistik aktivite gözlemlenmemiştir.
3.3. Bakteriyofaj İzolasyonu ve Karakterizasyonu
Tez kapsamında, 2 matsoni örneği (Tiflis, Gürcistan), 1 peynir altı suyu örneği
(Senaki, Gürcistan), 4 çiğ süt örneği (Tiflis, Gürcistan), 1 matsoni fabrikasından alınan
atık su örneği (Tiflis, Gürcistan), Kura nehrinden alınan 2 çevresel atık su örneği
(Tiflis, Gürcistan) ve Gürcistan, Senaki’ den alınan 1 çevresel atık su örneği
bakteriyofaj izolasyon kaynağı olarak kullanılmıştır. Matsoni örnekleri alınış
zamanlarına göre matsoni 1 ve matsoni 2 olarak, çiğ süt örnekleri yine alınış
zamanlarına göre çiğ süt 1, çiğ süt 2, çiğ süt 3 ve çiğ süt 4 olarak, matsoni fabrikasından
alınan atık su örneği atık su 4, Kura nehrinden alınan örnekler alınış zamanına göre
50
atık su 1 ve atık su 3; Senaki’ den alınan atık su örneği atık su 2 olarak
isimlendirilmiştir.
Fajların izolasyonunun zenginleştirme aşamasında potansiyel konakçı olarak 26 farklı
Lactobacillus suşu: K4, 31, Tg1-3, Al 2-3, B7 2-4, 53S, 52σ, 51B, 53R, 50B, 100S,
Tg 1-4, 102B, 100C, 34, Kd3, Bj 2-3, Kr, 59, Go, B1, I3, 100B, 55B, 102S, 102M; 12
farklı Streptococcus suşu: 6AX, 43B, 47B, 2S, 48B, 2B, 7B, 4S, 6B, 5AS, 101B, 101S;
8 farklı Enterococcus suşu: 8, 9, 49S, 9Aσ, 6AB, 1AS, 9AS, 47S kullanılmıştır. Sonuç
olarak: Lactobacillus suşlarına karşı 19 potansiyel faj karışımı (1R, 2R, 3R, PR1,
WR1, PR2, WR2, PR3, WR3, MR1, SR1, RMR1, MR2, SR2, RMR2, MR3, SR3,
RMR3, PlR), Streptococcus suşlarına karşı 14 potansiyel faj karışımı (1C, 2C, 3C,
PC1, WC1, PC2, WC2, MC1, SC1, RMC1, MC2, SC2, RMC2, PlC) ve Enterococcus
suşlarına karşı 2 potansiyel faj karışımı (13E, WE) elde edilmiştir. Çizelge 3.2 ve 3.3’
te kullanılan faj kaynaklarına verilen kodlar ve test edilen konakçı bakteriler
özetlenmiştir.
51
31
Tg 1-3
Al 2-3
B7 2-4
53S
52σ
51B
53R
50B
100S
Tg 1-4
102B
100C
34
Kd3
Bj 2-3
Kr
59
Go3
B1
I3
100B
55B
102S
102M
AS 1
Ma 1
ÇS 1
PAS
AS 2
PAS
AS 2
PAS
AS 2
Ma 2
ÇS 2
ÇS 3
Ma 2
ÇS 2
ÇS 3
Ma 2
ÇS 2
ÇS 3
AS 3
K4
Çizelge 3.2. Kullanılan faj kaynaklarına verilen kodlar ve izolasyonda kullanılan potansiyel konakçı bakteriler- Lactobacillus sp.
Potansiyel Konakçı Bakteri (Lactobacillus sp.)
Faj
Faj
Kaynağı
Kodu
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
- - - - - - - + +
+ +
- - - + + + - - - - -
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+, izolasyonda kullanılan potansiyel konakçı bakteriler; -, izolasyonda kullanılmayan bakteriler.
AS, atık su; Ma, matsoni; ÇS, çiğ süt; PAS, peynir altı suyu.
1R
2R
3R
PR1
WR1
PR2
WR2
PR3
WR3
MR1
SR1
RMR1
MR2
SR2
RMR2
MR3
SR3
RMR3
PlR
52
Çizelge 3.3. Kullanılan faj kaynaklarına verilen kodlar ve izolasyonda kullanılan potansiyel konakçı bakteriler-Streptococcus sp.,
Enterococcus sp.
Faj Kaynağı
Atık su 1
Matsoni 1
Çiğ süt 1
Peynir altı suyu
Atık su 2
Peynir altı suyu
Atık su 2
Matsoni 2
Çiğ süt 2
Çiğ süt 3
Matsoni 2
Çiğ süt 2
Çiğ süt 3
Atık su 3
6AX
+
+
+
+
+
+
+
+
+
43B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
47B
+
+
+
+
+
+
+
+
+
2S
+
+
+
-
Potansiyel Konakçı Bakteriler
Streptococcus sp.
48B
2B
7B
4S
6B
5AS
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Enterococcus sp.
6AB
1AS
9A
8
9
49S
Çiğ süt 4
+
+
+
+
+
Atık su 4
+
+
+
+
+
+, izolasyonda kullanılan potansiyel konakçı bakteriler; -, izolasyonda kullanılmayan bakteriler.
Faj Kodu
101B
+
+
+
+
+
+
101S
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1C
2C
3C
PC1
WC1
PC2
WC2
MC1
SC1
RMC1
MC2
SC2
RMC2
PlC
9AS
47S
+
+
+
13E
+
+
+
WE
53
Çalışma boyunca en az 6 faj karışımı izole edilmiştir. Örneğin; SR3 faj örneği
Lactobacillus 59 suşu üzerinde farklı plak tipleri göstermiştir:
a) ~1 mm çapında, net lizis görülen koloniler,
b) ~1 mm çapında, net olmayan lizis görülen koloniler,
c) ~2 mm çapında, bulanık bir zon içinde net lizis görülen koloniler.
Bu sonuçlar da plak morfolojilerine göre bu fajın en az 2 ya da 3 farklı suşu olduğunu
göstermektedir (Şekil 3.2).
Şekil 3.2. Lactobacillus 59 suşu üzerinde SR3 fajının plak morfolojisinin görünümü
İzole edilen fajlara faj-konakçı interaksiyonunun belirlenebilmesi için farklı laktik asit
bakteri suşları ile spot test uygulanmıştır. Çizelge 3.4 ve 3.5’ te sonuçlar özetlenmiştir.
54
Çizelge 3.4. Konakçı olarak Lactobacillus sp. suşlarının kullanıldığı spot test sonuçları.
Tg 1-3
Al 2-3
B7 2-4
53S
52σ
51B
53R
50B
100S
Tg 1-4
102B
100C
34
Kd3
Bj 2-3
Kr
59
Go
B1
I3
100B
55B
102S
102M
1R
2R
3R
PR1
WR1
PR2
WR2
PR3
WR3
MR1
SR1
RMR1
MR2
SR2
RMR2
MR3
SR3
RMR3
PlR
31
Faj
K4
Potansiyel Konakçı Bakteri (Lactobacillus sp.)
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
-
+
+
U
U
U
U
U
U
-
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
+
+
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
-
U
U
U
U
U
U
U
U
U
-
U
U
U
U
U
U
U
U
U
-
U
U
U
U
U
U
U
U
U
-
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
+
+
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
-
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
-
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
-
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
-
++, net olmayan lizis; +, net lizis; -, lizis görülmeyen; U, test uygulanmayan bakterileri ifade eder.
55
Çizelge 3.5. Konakçı olarak Streptococcus sp. ve Enterococcus sp suşlarının kullanıldığı spot test sonuçları
Phages
1C
2C
3C
PC1
WC1
PC2
WC2
MC1
SC1
RMC1
MC2
SC2
RMC2
PlC
13E
WE
6AX
++
++
U
U
U
U
U
8
-
43B
U
U
U
U
U
-
47B
U
U
U
U
U
9
-
2S
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
49S
-
Potansiyel Konakçı Bakteri
Streptococcus sp.
48B
2B
7B
4S
+
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
Enterococcus sp.
6AB
9A
-
++, net olmayan lizis; +, net lizis; -, lizis görülmeyen; U, test uygulanmayan bakterileri ifade eder.
6B
U
U
U
U
U
U
1AS
-
5AS
-
101B
U
U
U
U
U
U
U
U
9AS
-
101S
U
U
U
U
U
47S
-
56
Bu çizelgelere göre Lactobacillus Tg 1-3, 53S ve 59 suşlarına karşı etkili 4 faj,
Streptococcus 6 AX ve 2B suşlarına karşı etkili 2 faj izole edilmiştir. Bu sonuçlar
doğrultusunda fajların plak morfolojisini belirlemek için konakçı bakterileri
kullanılarak çift tabaka agar yöntemi uygulanmıştır. Çizelge 3.6’ da sonuçla
özetlenmiştir.
Çizelge 3.6. İzole edilen fajların plak morfolojisi.
Faj
Konakçı Bakteri
Plak özelliği
MR3
SR3
Lactobacillus 59
Bulanık merkezli net lizis
3
Düzensiz kenarlı net plaklar
1
Net plaklar
1
Bulanık merkezli net plaklar
2
Net plaklar
1
Bulanık merkezli net plaklar
2
Net plaklar
1
Lactobacillus 59
2C
Streptococcus 6AX
3C
Streptococcus 2B
Plak çapı (mm)
İzolasyondan sonra bu fajlar saflaştırılmış, zenginleştirilmiş ve çift tabaka agar
yöntemi kullanılarak titreleri belirlenmiştir. En iyi sonuçların alınabilmesi için çift
tabaka agar yönteminin koşulları optimize edilmiştir. Çizelge 3.7’ de optimizasyon
için denenmiş olan koşullar kısaca özetlenmiştir.
Çizelge 3.7. Çift tabaka agar yöntemi için denenmiş olan optimizasyon koşulları.
Değişkenler
Koşullar
Eklenen bakteri miktarı (L)
100
200
Eklenen faj miktarı (L)
100
1000
5
15
0,4
0,7
Eklenen CaCl2 konsantrasyonu (mM)
0
10
İnkübasyon süresi (sa.)
24
48
Bakteri-faj karıştırıldıktan sonra bekleme süresi1 (dk.)
İkinci tabakada kullanılan besiyerinin2 agar miktarı (%)
adsorpsiyon süresi, 2 yumuşak agar
1
20
72
57
Çizelgede belirtilen tüm koşullar denendikten sonra sonuçlar değerlendirildiğinde
optimize edilen koşullar;
 Ekelenen bakteri miktarı 100 µL,
 Eklene faj miktarı 100 µL,
 Kullanılan yumuşak agardaki agar miktarı % 0,7,
 Adsorbsiyon süresi 5 dk.
 Fajın hücre duvarına adsorbsiyonu için CaCl2 kullanılmamış,
 İnkübasyon süresi 48 saat olarak belirlenmiştir.
Optimize edilen koşullar kullanılarak çift tabaka agar yöntemi uygulanmıştır. PR 2 ve
WR2 fajları için titrasyon sonuçları elde edilememiştir. Diğer sonuçlar ise Çizelge 3.8’
de özetlenmiştir.
58
Çizelge 3.8. Çif tabaka agar yönteminin sonuçları.
Konakçı
Bakteri
3C
MR3
SR3
10-7
10-8
10-9
10-10
Titre (pfu/mL)
-
-
-
-
-
1 x 105
1
-
-
-
-
-
1,5 x 105
-
4
-
-
-
-
-
4 x 105
2
-
1
2
-
1
8
8 x 1010
10-1
10-2
10-3
10-4
Streptococcus
sp.
2C
Seyreltmeler
10-5
10-6
6AX
-
-
-
10
1
2B
-
2
-
-
Lactobacillus
sp.
Faj
59
-
-
1
59
-
2
-
-, lizis görülmeyen.
59
Çizelgeye göre Streptococcus 6AX konakçısı üzerine ekilen 2C fajının titresi 1x105,
diğer sonuçlar ise stabil değildir.
A
B
Şekil 3.3. Çift tabaka agar yöntemi sonuçlarının görünümü. A, Lactobacillus 59
üzerine ekilen MR3 fajı (faj seyreltmesi 10-5); B, Lactobacillus 59 üzerine ekilen SR3
(faj seyreltmesi 10-10) fajı.
Elektron mikroskop çalışması için net plaklar bir tüp içerisine toplanıp santrifüj
edilmiştir. Daha sonra spot test uygulanmıştır (Şekil 3.4). Test sonucunda görülen net
plaklar alınarak elektron mikroskop görüntüsü için hazırlanmıştır. Ancak mikroskop
görüntüsü alınamamıştır. Bunun üzerine spot test üç kez daha tekrarlanmış ve faj
titresini arttırmak için daha fazla plak toplanmıştır. Ancak sonuçta yine görüntü
alınamamıştır.
Şekil 3.4. Spot test sonucunu gösteren bir petri kabı.
60
Elektron mikroskobunda görüntü alınamaması ve titre sonuçlarının stabil olmaması
izole edilen fajların lizojenik hayat döngüsüne sahip olabileceğini düşündürmüştür. Bu
doğrultuda, 10 Lactobacillus ve 10 Streptococcus suşuna MC testi uygulanmıştır.
Çizelge 3.9 ve Şekil 3.5’ te alınan sonuçlar verilmiştir.
Lactobacillus sp.
Streptococcus sp.
Çizelge 3.9. Mitomisin C testi sonuçları.
Test Edilen Bakteriler
101B
2S
4S
101S
5AS
6AX
2B
48B
47B
43B
102M
102B
100C
Tg 1-3
Kd3
34
31
59
53R
53S
58B
Kontrol tüpleri
-
MC Testi
+
+
+
+
+
+
+, bakteri üremesi görülmeyen tüpler (pozitif test sonucu); -, bakteri üremesi görülen tüpler (negatif test
sonucu).
a
b
c
Şekil 3.5. MC test sonuçlarını gösteren fotoğraflar; her üç resim için sağ tarafta
bulunanlar test tüpleri, soldakiler ise kontrol gruplarıdır. a, Lactobacillus 59; b,
Lactobacillus 53S; c, Lactobacillus 58B.
61
Elde edilen test sonuçlarına göre; Streptococcus 101S, 5AS, 2B suşları ile
Lactobacillus 59, 53S, 58B suşları profaj taşımaktadır. Bu nedenden dolayı çoğu kez
anlaşılmaz titre sonuçları veren MR3 ve SR3 fajının konakçı bakterisini değiştirmeye
karar verilmiştir. Bu amaçla uygun konakçı bulunana kadar spot test uygulanmıştır.
MR3 fajı için Lactobacillus 58B ve 53S, SR3 fajı için Lactobacillus 58B ve 53S,
Lactobacillus MC 59 fajı için Lactobacillus Kd3 konakçıları tanımlanmıştır (Şekil
3.6).
A
B
Şekil 3.6. Spot test sonuçlarının görünümü. A, Lactobacillus 53S ve 58B’ ye karşı
Lactobacillus SR3 fajı; Lactobacillus 53S ve 58B’ ye karşı Lactobacillus MR3 fajı; B,
Lactobacillus Kd3’ e karşı Lactobacillus MC 59 fajı.
Elde edilen sonuçlar doğrultusunda, belirlenen konakçı bakteriler kullanılarak
saflaştırma ve titre belirleme işlemleri uygulanmıştır. Fakat, titre sonuçları yine
istikrarlı çıkmamıştır.
Çalışmanın amaçlarından biri de faj dirençli suşların elde edilmesidir. Bu amaçla
zenginleştirilmiş faj (1 mL) steril bir agar plağı üzerine yayılmış ve kurumaya
bırakılmıştır. Daha sonra üzerine bir gecelik taze bakteri kültürü ilave edilip yayılmış
ve tekrar kurumaya bırakılmıştır. Petri kapları 37 oC’ de anaerobik koşullar altında 48
saat inkübasyona bırakılmıştır. Sonuçlar Şekil 3.7’ de gösterilmektedir.
62
Şekil 3.7. SR3 fajına dirençli mutant Lactobacillus 53S' suşu.
Mutant suşlar 53S' ve 58B' olarak isimlendirilmiştir. Mutant Lactobacillus 53S' ve
58B' suşunın faj dirençini değerlendirebilmek için konakçı bakterilerin taze kültürleri
ilk stoktan hazırlanmış ve spot test uygulanmıştır. Çizelge 3.10’ de elde edilen sonuçlar
özetlenmiştir.
Çizelge 3.10. Spot test sonuçları.
Faj
SR3
MR3
53S
+
+
Potansiyel Konakçı Bakteri
53S'
58B
+
+
58B'
-
-, lizis görülmeyen; +, net lizis görülen.
Elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde vahşi suşların fajlara karşı duyarlı,
mutantların ise fajlara karşı dirençli olduğu görülmektedir. Mutant suşlar geçirimli
elektron mikroskobuyla (TEM) incelenmiş ancak vahşi suşlarından farklı bir morfoloji
gözlemlenmemiştir (Şekil 3.8).
(1)
(2)
Şekil 3.8. TEM görüntüleri. (1), 53S' suşunun 32000x’ lik büyütmede görünümü; (2)
53S' suşunun 30000x’ lik büyütmede görünümü.
63
4.TARTIŞMA
Laktik asit bakterilerinin gıda üretimi ve insan sağlığı üzerine yararlı etkileri çok uzun
yıllar önce anlaşılmıştır. Fermantasyondaki önemleri, sütü çok hızlı asitlendirmeleri
ve ana ürün olarak laktik asit üretmeleriyle açıklanmaktadır. Bazı suşlar asetik asit,
etanol, aroma bileşenleri, bakteriyosinler, eksopolisakkaritler ve önemli enzimler
(proteaz gibi) üretirler. Bu sayede fermente ürünlerin raf ömrü ve mikrobiyel kalitesini
önemli ölçüde arttırırlar. Buna ek olarak, ürünlere yapısal ve duyusal özelliklerini
kazandırarak istenilen tat ve aromada standart ürün eldesini sağlarlar (Mozzi ve ark.,
2010).
Fermantasyonda bu denli önemli olan laktik asit bakterilerinin en büyük düşmanları
bakteriyofajlardır. Faj enfeksiyonu, peynir ve fermente süt ürünleri sektöründe starter
aktivitesini azaltıp fermantasyon sonunda asit üretimini önemli derecede azaltarak ya
da tamamen bloke ederek ürün kalitesinin olumsuz yönde etkilenmesine neden olur.
Çiğ süt, içinde bulundurduğu serbest faj partikülleri ya da içindeki laktik asit
bakterilerinde bulunan profajlar ile fajların ana kaynağını oluşturmaktadır. Fajları yok
etmek oldukça güçtür, çünkü süt işletmelerinde çok hızlı yayılırlar. Dolayısıyla, faj
enfeksiyonu süt endüstrisinde oldukça büyük ekonomik kayıplara neden olmaktadır.
Bu konuda yapılan çalışmalar fajların kontrol altına alınabilmesi yönündedir ve
geliştirilen yöntemler endüstri açısından çok büyük önem taşımaktadır (Guglielmotti
ve ark., 2012).
Tez kapsamında laktik asit bakteri fajlarının tercih edilmesindeki en büyük etken,
bahsedilen nedenlerden dolayı yaşanan ekonomik kayıpların en aza indirilmesi veya
64
tamamen yok edilmesi adına yeni yöntemlerin geliştirilmesi için yol gösterir nitelikte
olabileceği düşüncesidir.
Bu konuda, Ishnaiwer ve Al-Razem (2013) birçok laktik asit bakteri kültür karışımı
kullanılarak yapılan kurutulmuş tuzlu bir fermente süt ürünü olan Laban jameed ile
çalışmışlardır. Laban jameed birçok doğu Akdeniz ülkesinde tüketilen, genellikle
koyun ya da inek sütü kullanılarak yapılan geleneksel bir üründür. Çalışmalarında
üründe faj kontaminasyonunu belirlemeyi amaçlamışlardır. Biri koyun sütü
kullanılarak yapılan jameed (PPUDV), diğeri ise inek sütü kullanılarak yapılan jameed
(PPURV)’ den elde ettikleri fajlar olmak üzere iki faj izole etmişlerdir. Daha sonra
spot test yöntemi ile faj-konakçı interaksiyonunu belirlemişler ve sonuçta PPUDV fajı
için Lactobacillus helveticus, PPURV fajı için ise Bacillus amyloliquefaciens suşlarını
konakçı olarak saptamışlardır.
Capra, ve ark. (2010) ise çalışmalarında faj izolasyonu için Lactobacillus paracasei ve
Lactobacillus casei suşlarını kullanmışlardır. Toplam üç faj izole etmişler ve CL1, CL2
ve iA2 olarak adlandırmışlardır. Faj-konakçı ilişkisini belirlemek için spot test
yöntemini kullanmışlardır. CL1, CL2 fajları için 16 L. paracasei suşu, iA2 fajı için 13
L. casei suşunu test etmişler, sonuçta CL1, CL2 fajları için 9 L. paracasei suşu, iA2 fajı
için 11 L. casei suşunu konakçı olarak belirlemişlerdir.
Biz de yaptığımız çalışmada peynir, yoğurt, matsoni ve çiğ süt örneklerinden izole
edilen ve IBMW kültür koleksiyonundan temin edilen 59 farklı laktik asit bakteri suşu
kullandık. Bu suşlardan 18’ i çeşitli ev yapımı matsoni, çiğ süt ve peynir örneklerinden
izole edildi, 4’ ü IBMV kültür koleksiyonundan, 37 izolat ise George Eliava Enstitüsü
Araştırma&Geliştirme bölümünden temin edildi. Faj izolasyonu için ise atık su, peynir
65
altı suyu, matsoni ve çiğ süt kullandık, ancak sadece matsoni ve çiğ sütten faj
izolasyonu yapabildik. Matsoniden izole edilen fajları MR3 ve 2C olarak, çiğ sütten
izole edilen fajları ise SR3, 3C olarak isimlendirdik. 2C ve 3C fajlarının konakçılarının
bulunabilmesi için spot test uyguladık ve sonuçta 2C fajı için Streptococcus 6AX ve
3C fajı için Streptococcus 2B konakçılarını tespit ettik.
Tayland’ da Phumkhachorn ve Rattanachaikunsopon (2012) yaptıkları bir çalışmada
ülkede geleneksel bir fermente gıda olan kem-buk-nud’ un yapımında starter kültür
olarak kullanılan Lactococcus lactis RP359’ u enfekte eden bir fajın izolasyonu ve
karakterizasyonunu belirlemeyi amaçlamışlardır. 30 kem-buk-nud örneğinden
Lactococcus lactis RP359 suşuna karşı etkili bir litik faj izole etmişler ve RP359
olarak adlandırmışlardır. Spot test için 21 farklı suş kullanmışlardır. Fajın konakçısını
belirledikten sonra çift tabaka agar yöntemini uygulamışlar ve sonuçta petride yaklaşık
1- 1,5 mm çapa sahip net plaklar gözlemlemişlerdir.
Bir başka çalışmada ise Parada ve ark. (1984) Arjantin’ de fabrikalardan topladıkları
peynir altı suyu örneklerinden Streptococcus lactis subsp. lactis C2 suşuna spesifik üç
bakteriyofaj izole etmişlerdir. İzole ettikleri tüm fajların oluşturdukları plak
boyutlarının birbirine çok yakın, benzer morfolojide olduğunu tespit etmişlerdir.
Dahi (yoğurt benzeri fermente bir ürün) suyundan izole ettikleri Lactococcus lactis
ssp. diacetylactis suşuna karşı etkili dört litik faj ile çalışan Masud ve ark. (2009)
çalışmalarında bu fajları karakterize etmeyi amaçlamışlardır. Bu amaçla konakçıları
spot testle belirlenen fajlara çif tabaka agar yöntemi uygulamışlardır. Sonuçta fajların
konakçı bakterileri üzerinde net plaklar oluşturduklarını ve bu plakların 1-3 mm
66
arasında değişen çaplara sahip olduğunu gözlemlemişlerdir. Plak boyutlarındaki
çeşitliliği farklı tipte fajlar olarak değerlendirmişlerdir.
Biz de konakçıları belirlenen fajların çift tabaka agar yöntemi kullanarak plak
morfolojilerini belirledik. 2C fajı Streptococcus 6AX konakçısı üzerinde ~1 mm
çapında net plaklar ve ~2 mm çapında bulanık merkezli net plaklar oluşturdu. 3C fajı
ise Streptococcus 2B konakçısı üzerinde ~1 mm çapında net plaklar oluşturdu. Plak
boyutlarındaki ve özelliklerindeki çeşitliliğe dayanarak elde edilen fajları farklı tipte
fajlar olarak değerlendirdik.
Polonya’ nın çeşitli bölgelerindeki süt fabrikalarından topladıkları süt örneklerinde faj
varlığını araştırmak amacıyla Szczepańska ve ark. (2007) on yedi bölgeden
topladıkları otuz üç örneği analiz etmişler ve sonuçta Lactococcus lactis suşuna karşı
etkili fajlar bulmuşlardır. Elde ettikleri fajların titresini belirlemek için çift tabaka agar
yöntemini kullanmışlar ve sonuçta 103-1012 pfu/mL arasında değişen değerler elde
etmişlerdir. Yine çift tabaka agar yöntemiyle belirledikleri plak morfolojilerini
değerlendirdiklerinde 200 faj izole etmiş ve saflaştırmışlardır.
Biz de çalışmamızda konakçılarını belirlediğimiz fajların titrelerinin belirleyebilmek
için çift tabaka agar yöntemini uyguladık ve sonuçta 2C fajı-Streptococcus 6AX
suşuna ait petrilerde titre değerini 1x10-5 pfu/mL olarak bulduk.
67
Çalışmalarında İtalya ve Arjantin’ deki fabrikalardan temin etiikleri peynir altı suyu,
yoğurt ve peynir örneklerinden elde edilen 16 starter kültür örneğini kullanan Suarez
ve ark. (2007) yaptıkları araştırmada bu starterlerden Lactobacillus delbrueckii
suşundan izole edilen ılımlı fajların karakterizasyonunu belirlemeyi amaçlamışlardır.
Bu amaçla, örneklerde lizojeni tespiti için MC testini uygulamışlardır. Sonuçta işlem
görmüş tüplerin %37’ sinde faj partiküllerini görmüş ya da bakteri hücrelerinin
ölümünü gözlemlemişlerdir. Ancak, Lactobacillus delbrueckii suşuna karşı etkili
sadece iki aktif faj izole etmişlerdir.
Biz de yaptığımız çalışmada profaj varlığının belirleyebilmek için peynir, çiğ süt ve
matsoni örneklerinden elde edilen 10 Streptococcus, 10 Lactobacillus suşunu
kullandık. Bu suşlardaki lizojeni varlığını belirlemek için MC testi yaptık ve sonuçta
Lactobacillus 59, Lactobacillus 53S, Lactobacillus 58B suşlarında profaj varlığını
tespit ettik. Daha sonra konakçı tespiti için tekrar spot test uyguladık. Testin sonucunda
Lactobacillus 58B ve 53S suşlarına karşı MR3 ve SR3 fajlarının, Lactobacillus Kd3
suşuna karşı, MC testi sonucunda Lactobacillus 59 suşundan izole edilen
Lactobacillus MC 59 fajının etkili olduğunu tespit ettik.
Laktik asit bakterileri süt endüstrisinde ürüne özgü özelliklerin kazandırılması için
starter kültür olarak kullanılan bakterilerdir. Bu baktreilerin fajlar tarafından enfekte
edilmesi ya da profaj içeren suşların kullanımı ürün kalitesini etkilemekte ve ekonomik
kayıplara neden olmaktadır. Bu nedenle laktik asit bakterileri ve laktik asit bakteri
fajları, üzerinde daha kapsamlı çalışmalar gerektiren bir alandır.
68
5. SONUÇ VE ÖNERİLER
Tez kapsamında elde edilen tüm sonuçlar değerlendirildiğinde matsoniden ve çiğ
sütten sırasıyla MR3, 2C ve SR3, 3C fajları izole edilmiştir. Elde edilen fajların
karakterizasyonu için çeşitli kaynaklardan izole edilen veya temin edilen laktik asit
bakteri izolatlarıyla olan özgüllüğü araştırılmıştır. Bu amaçla yapılan spot test
sonuçları dikkate alındığında sadece üç laktik asit bakteri izolatının fajlardan
etkilendiği görülmüştür. Spot test sonuçlarına göre, matsoniden izole edilen MR3, 2C
fajları ve sütten izole edilen SR3, 3C fajlarının peynirlerden elde edilen izolatlar
üzerine etkisinin olmadığı gözlemlenmiştir. Bunu peynir teknolojisinde kullanılan
kültürlerinin genellikle faj dirençli olmasına bağlayabiliriz. Ancak, Eliava IBMV
kültür koleksiyonundan temin edilen ve matsoniden izole edilmiş olan;

Streptococcus 6AX, Streptococcus 2B suşlarına karşı sırasıyla 2C ve 3C
fajlarının etkili olduğu tespit edilmiştir.
Konakçıları tespit edilen fajlara titre belirlemek için Çift Tabaka Agar Yöntemi
uygulandığında 2C fajı (Streptococcus 6AX suşuna ait petrilerde) için titre değeri
1x10-5 pfu/mL olarak bulunmuştur.
Laktik asit bakterilerinde lizojeninin oldukça yaygın olması (Davidson ve ark., 1990),
titre sonuçlarının stabil olmaması gibi nedenlerden dolayı fajların lizojenik yaşam
döngüsüne sahip olabileceği düşünülmüş ve daha önce konakçı olarak belirlenmiş
bakterilerle birlikte diğer bazı bakterilere MC testi uygulanmıştır. Sonuçta Eliava
IBMV kültür koleksiyonundan temin edilen, Lactobacillus 59, Lactobacillus 53S,
Lactobacillus 58B suşlarında profaj varlığı tespit edilmiştir. Konakçı tespiti için
yapılan spot test sonucunda;
69

Lactobacillus 58B ve 53S suşlarına karşı MR3 ve SR3 fajlarının,

Lactobacillus Kd3 suşuna karşı, MC testi sonucunda Lactobacillus 59
suşundan izole edilen Lactobacillus MC 59 fajının etkili olduğu tespit
edilmiştir.
Ayrıca,

Lactobacillus 53S' ve 58B' mutant suşlarının MR3 ve SR3 fajlarına karşı
dirençli,

Lactobacillus
53S
ve
58B
vahşi
suşlarının
ise
duyarlı
oldukları
gözlemlenmiştir.
Gelecekte mutant ve vahşi suşlar arasında genetik açıdan ne gibi farklar meydana
geldiğini görmek için moleküler düzeyde çalışmaların yapılması, laktik asit
bakterilerinin direnç mekanizmalarının anlaşılması açısından önemlidir. Ayrıca, izole
edilmiş olan fajların ve konakçılarının genetik yapısının incelenmesi uzun vadeli
hedefler arasındadır. Yapılacak olan çalışmaların, faj-konakçı ilişkisi hakkında
kapsamlı bilgiler edinilmesini sağlayarak anti-faj stratejilerinin geliştirilmesinde temel
oluşturacağı düşünülmektedir. Bu çalışmalar, endüstride yaşanan faj kaynaklı
sorunlara çözüm olması açısından çok büyük önem taşımaktadır.
70
ÖZET
Laktik Asit Bakterileri ve Bakteriyofajlarının Çeşitli Kaynaklardan İzolasyonu
ve Karakterizasyonu
Laktik asit bakterileri; Gram pozitif, prokaryot, heterotrof, fermantasyon neticesinde
laktik asit üreten bakteriler olarak tanımlanırlar. Süt endüstrisinde fermantasyon
özelliklerinden dolayı starter kültür olarak kullanılmaktadırlar. Starter kültürlerin en
önemli özellikleri laktozu fermente ederek laktik asit üretmeleridir. Asit, fermente süt
ürünün tat, aroma, yapısal özelliklerinin kazandırılmasından ve raf ömrünün
arttırılmasından sorumludur. Ancak, endüstride starter kültür kullanımının
yaygınlaşması bakteriyofaj (faj) sorununu da beraberinde getirmiştir. Fajlarla
kontamine olan starter kültürler ürünün düşük kalitede olmasına neden olmaktadır.
Tez kapsamında, laktik asit bakterilerinin ve laktik asit bakteri fajlarının çeşitli
çevresel kaynaklardan ve süt ürünlerinden izolasyonu, izole edilen laktik asit bakteri
fajlarının faj-konakçı etkilerinin araştırılması, belirlenen konakçılar kullanılarak
fajların koloni morfolojileri ve yaşam döngülerinin incelenmesi amaçlanmıştır.
Yapılan çalışmada, 18’ i çeşitli ev yapımı matsoni, çiğ süt ve peynir örneklerinden
izole edilen, 4’ ü Eliava Bakteriyofaj, Mikrobiyoloji ve Viroloji Enstitüsü (IBMV)
kültür koleksiyonundan, 37’ si George Eliava Enstitüsü Araştırma&Geliştirme
bölümünden temin edilen 59 farklı laktik asit bakteri suşu kullanılmıştır. Faj
izolasyonu için ise atık su, peynir altı suyu, matsoni ve çiğ süt kullanılmıştır.
Kullanılan örneklerden matsoni ve çiğ sütten sırasıyla MR3, 2C ve SR3, 3C olarak
isimlendirilen litik yaşam döngüsüne sahip fajlar izole edilmiştir. Fajların konakçı
tespiti için yapılan spot test sonucunda 2C ve 3C fajlarının konakçılarının sırasıyla
Streptococcus 6AX, Streptococcus 2B suşları olduğu tespit edilmiştir. Daha sonra
fajlar zenginleştirilmiş ve titre belirlemek için çift tabaka agar yöntemi uygulanmıştır.
Sonuçta 2C fajının titre değeri 1x10-5 pfu/mL olarak bulunmuştur. Profaj tespiti için
yapılan MC testi Lactobacillus 59, Lactobacillus 53S, Lactobacillus 58B suşlarında
profaj varlığını göstermiştir. Bunun üzerine ilgili suşlar için spot testler
tekrarlanmıştır. Sonuç olarak, MR3 ve SR3 fajlarının konakçılarının Lactobacillus 58B
ve 53S suşları, MC testi sonucunda Lactobacillus 59 suşundan izole edilen
Lactobacillus MC 59 fajının konakçısının Lactobacillus Kd3 suşu olduğu tespit
edilmiştir. Lactobacillus 53S' ve 58B' mutant suşlarının ise MR3 ve SR3 fajlarına karşı
dirençli oldukları gözlemlenmiştir.
Anahtar Sözcükler: Bakteriyofaj, çift tabaka agar yöntemi, laktik asit bakterileri, spot
test, süt ürünleri.
71
SUMMARY
Isolation of Lactic Acid Bacteria and Bacteriophages from Different Sources and
Their Characterization
Lactic acid bacteria that produce lactic acid as the end-product of carbohydrate
fermentation are characterized as Gram positive, procaryote and heterotroph. Because
of their fermentetion properties lactic acid bacteria have been used as starter cultures
in dairy industry. The production of lactic acid by fermenting lactose is the most
important feature of starter cultures. The acid is responsible for development of
characteristic body and texture of the fermented milk products, contributes to the
overall flavour of the products, and enhances preservation. However, using starter
culturs in dairy industry bring about phage problem. Phage contamination in starter
cultures cause low-quality products.
Whitin this thesis, isolation of lactic acid bacteria and their phages from different
environmental sources and dairy products, investigation of phage-host interactions
using these isolates, examination of colony morphologies and life cycles of these
phages with using their hosts were purposed.
In this research, 59 different lactic acid bacteria strains; 18 of these bacteria isolated
from different homemade matsoni, raw milk and cheese samples, 4 of them were
kindly supplied by Eliava Institute of Bacteriophage, Microbiology and Virology
(IBMV) culture collection, 37 of them kindly supplied by Research & Development
department of IBMV were used. Waste water, whey, matsoni and raw milk samples
were used for isolation of phages. Phages which named as MR3, 2C ve SR3, 3C were
isolated from matsoni and raw milk samples respectively. As a result of spot test which
have been done for phage-host range, 2C and 3C phages’ hosts were determined as
Streptococcus 6AX and Streptococcus 2B respectively. Then phages were
concentrated and double layer agar method was used for titration of phages. In
conclusion, the titer of 2C phage was found as 1x10-5 pfu/mL. The results of MC test
which was performed for determination of prophage, were demonstrated that
Lactobacillus 59, Lactobacillus 53S, Lactobacillus 58B strains carry the prophage.
After that spot test was repeated again with related strains. Consequently,
Lactobacillus phage MR3 and SR3 were active against Lactobacillus 58B and 53S
strains, Lactobacillus phage MC 59 was active against Lactobacillus Kd3 strain. The
mutant strain Lactobacillus 53S' and 58B' were observed as resistant against MR3 ve
SR3 phages.
Key Words: Bacteriophages, dairy product, double layer agar method, lactic acid
bacteria, spot test.
72
KAYNAKLAR
ABEDON, S.T. (2008). Bacteriophage Ecology: Population Growth, Evolution, and Impact of Bacterial
Viruses. New York, USA. Cambridge University Press.
ADAMS, M. H., (1959). Bacteriophages. New York: Interscience Publishers, Inc. p.:450-451
ALLISON, G. E. ve KLAENHAMMER, T. R. (1998). Phage resistance mechanisms in Lactic Acid
Bacteria. Int. Dairy J. 8: 207-226.
AŞKAR, M., ASLIM, B., BEYATLI, Y. (1999). Et ürünlerinden izole edilen Pediococcus acidilactici
suşlarının bazı metabolik ve antimikrobiyal aktivitelerinin incelenmesi. Turkish Journal of
Veterinary and Animal Sciences. 23 (3): 467-474.
BACUS, J.N. ve BROWN, W.L. (1981). Use of microbial culture; meat products. Food Technology.
35(1): 74-8.
CAPRA, M.L., MERCANTI, D.J., REINHEIMER, J.A. ve QUIBERONI, A.L. (2010). Characterisation
of Three Temperate Phages Released from The Same Lactobacillus paracasei Commercial
Strain. Society of Dairy Technology. 63: 396-405.
CLOKIE, M. R. J., KROPINSKI, A. M. (2009). Bacteriophages: Methods and Protocols, Isolation,
Characterization, and Interactions. Vol. I. New York, USA: Humana Press, Chapter 2.
DAVIDSON, B.E., POWELL, I.B., HILLIER, A.J. (1990). Temperate Bacteriophages and Lysogeny
in Lactic Acid Bacteria. FEMS Microbiology Letters. 87(1-2): 79-90.
DAVIS, J.E. ve SINSHEIMER, R.L. (1963). The Replication of Bacteriophage MS2:1. Transfer of
Parental Nucleic Acid to Progeny Phage. Journel of Moleculer Biology. 6: 203-207.
DE MAN, J., ROGOSA, M., SHARPE, M. (1960). A medium for the cultivation of Lactobacilli. J.
Appl. Bacteriol. 23: 130-135.
ERGÜLLÜ, E. (1982). Bakteriyofaj ve süt teknolojisinde yarattığı sorunlar. Gıda, 5: 239-245.
FITZSIMONS, N. A., COGAN, T. M., CONDON, S., BERESFORD, T. (1999). Phenotypic and
genotypic characterization of non-starter lactic acid bacteria in mature cheddar cheese. Applied
and Enrivonmental Microbiology. 65: 3418- 3426.
FLOROU-PANERI, P., CHRISTAKI, E., BONOS, E. (2013). Lactic Acid Bacteria - R & D for Food,
Health and Livestock Purposes: Lactic Acid Bacteria as Source of Functional Ingredients, Dr. J.
Marcelino Kongo (Ed.), ISBN: 978-953-51-0955-6, InTech, DOI: 10.5772/47766.
FULLER, R. (1989). A review. Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology. 66:
365-78.
GARNEAU, J.E., MOINEAU, S. (2011). Bacteriophages of Lactic Acid Bacteria and Their Impact on
Milk Fermentations. Microbial Cell Factories. 10(1): S20.
GIRAFFA, G., CHANISHVILI, N., WIDYASTUTI, Y. (2010). Importance of Lactobacilli in Food and
Feed Biotechnology. Research in Microbiology. 161: 480-487.
GOMES A. M. P., MALCATA F. X. (1999). Bifidobacterium spp. and Lactobacillus acidophilus:
biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics.
Trends in Food Science & Technology. 10: 139-157
GUGLIELMOTTI, D.M., MERCANTI, D.J., REINHEIMER J.A. ve QUIBERONI, A.L. (2012).
Review: Efficiency of Physical and Chemical Treatments on the Inactivation of Dairy
Bacteriophages. Frontiers in Microbiology. 2(282): 1-11
73
GÜRSEL, A., ŞENEL, E., YAMAN, Ş. (2004). Use of a Biopreservative Culture against Yeast and
Mould Growth in Set-Type Yoghurt. Gıda. 29: 283–289.
GÜRSOY, O., KINIK, Ö. (2006). Peynir Üretiminde Probiyotik Bakterilerin Kullanımı: Probiyotik
Peynir. Mühendislik Bilimleri Dergisi.12: 105-116.
ISHNAIWER, M.M., AL-RAZEM, F. (2013). Isolation and Characterization of Bacteriophages from
Laban Jameed. Food and Nutrition Sciences, 4: 56-66.
KILIÇ, S. (2008) Süt Endüstrisinde Laktik Asit Bakterileri, Ege Üniversitesi Basımevi, Bornova, İzmir,
451.
KURTBOKE, I. (2012). Bacteriophages. [www.intechopen.com].
KUTTER, E., SULAKVELIDZE, A. (2005) Bacteriophages: Biology and Applications. New York,
USA. CRC Press.
LACROIX, C. (2011). Protective cultures, antimicrobial metabolites and bacteriophages for food and
beverage biopreservation. Cambridge, UK: Woodhead Publishing Limited.
LAHTINEN, S., OUWEHAND, A.C., SALMINEN, S., WRIGHT, A.V. (2012). Lactic Acid Bacteria,
Microbiological and Functional Aspects. New York, USA CRC Press: Fourth ed.
LERTCANAWANICHAKUL, M. ve SAWANGNOP, S. (2008) A comparison of two methods used
for measuring the antagonistic activity of Bacillus Species. Walailak J Sci & Tech. 5(2): 161171.
MAHONY, J. ve SINDEREN, D.V. (2015). Novel Strategies to Prevent or Exploit Phages in
Fermentations, Insights from Phage–Host Interactions. Current Opinion in Biotechnology. 32:
8-13.
MASUD, T., LATIF, A., HAMEED, A. (2009). Characterization of Four New Lactococcus lactis
Bacteriophages Isolated from Dahi Whey. Society of Dairy Technology. 62: 107-111.
MISHRA, C., LAMBERT, J. (1996). Production of Anti-Microbial Substances by Probiotics. Asia
Pacific J. Clin. Nutr. Vol. 5. 20-24.
MOORE, T., GLOBA, L., BARBAREE, J , VODYANOY, V., SOROKULOVA, I. (2013).
Antagonistic activity of Bacillus bacteria against food-borne pathogens. J. Prob. Health. 1: 3.
MOZZI, F., RAYA R.R., VIGNOLO, G.M. (2010). Biotechnology of Lactic Acid Bacteria: Novel
Applications. Iowa, USA. John Wiley & Sons, Inc.
PARADA, J.L., LA VIA, M.I. ve SOLARI, A.J. (1984). Isolation of Streptococcus lactis
Bacteriophages and Their Interaction with the Host Cell. Applied and Envıronmental
Microbiology. 47: 1352-1354.
PHUMKHACHORN, P. ve RATTANACHAIKUNSOPON, P. (2012). Isolation and Characterization
of Lytic Phage against Lactococcus lactis RP359, kem-buk-nud Starter Culture. African Journal
of Microbiology. 6(37): 6678-6684.
ROSS, R. P., MORGAN, S., HILL, C. (2002). Preservation and Fermentation: Past, Present and Future.
International Journal of Food Microbiology. 79: 3- 16.
SALMINEN, S., WRIGHT, A. V., OUWEHAND, A. (2004). Lactic Acid Bakteria: Microbiological
and Functional Aspects. New York, Marcel Dekker, Inc: Third Ed.
SANDERS, M. E. (1988). Phage Resistance in Lactic Acid Bacteria. Biochimie. 70: 411-421.
SCHNÜRER, J., MAGNUSSON, J. (2005). Antifungal Lactic Acid Bacteria as Biopreservatives.
Trends in Food Science & Technology. 16: 70–78.
SPENCER, J. F. T., SPENCER, A. L. R. (2001). Methods in Biotechnology: Food Microbiology
Protocols. Totowa, New Jersey: Humana Press Inc., Part 3.
74
SUAREZ, V., ZAGO, M., QUIBERONI, A., CARMINATI, D., GIRAFFA, G. ve REINHEIMER, J.
(2007). Lysogeny in Lactobacillus delbrueckii Strains and Characterization of Two New
Temperate Prolate-Headed Bacteriophages. Journal of Applied Microbiology. 105: 1402–1411.
SZCZEPAŃSKA, A.K., HEJNOWICZ, M.S., KOŁAKOWSKI, P. ve BARDOWSKI, J. (2007).
Biodiversity of Lactococcus lactis Bacteriophages in Polish Dairy Environment. Acta
Biochimica Polonica. 54: 151–158.
TERZAGHI, B. E., SANDINE, W. E. (1975). Improved medium for lactic streptococci and their
bacteriophages. Appl. Microbiol. Jun; 29(6): 807-13
ÜÇÜNCÜ, M., (2005). Süt ve Mamülleri Teknolojisi. Bornova, İzmir. Meta Basım Matbaacılık
Hizmetleri.
USTAÇELEBİ, Ş., US, A.D. (2008). Genel Viroloji. Ankara. Pelikan Yayıncılık Ltd. Şti.
WHITEHEAD, H.R. (1953). Bacteriophage in cheese manufacture. Bacterial Rev. 17(2): 109-123.
WOMMACK, K.E. ve COLWELL, R.R. (2000). Virioplankton, pp. viruses in aquatic ecosystems.
Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64: 69–114.
WALDOR, M. K. ve MEKALANOS, J. J. (1996). Lysogenic conversion by a filamentous phage
encoding cholera toxin. Science. 272(5270):1910-4.
FAUZI, A. A., SHAFIEI, Z., BAHARIN, B. ve MOHD, N. (2013). Activity against Periodontal
Pathogens Isolation of Lactobacillus from Periodontally Healthy Subjects and its Antimicrobial.
Sains Malaysiana. 42(1): 19–24.
75
ÖZGEÇMİŞ
I- Bireysel Bilgiler
Adı: Ayşen
Soyadı: GÜMÜŞTAŞ
Doğum yeri ve tarihi: Afyon / 08.01.1986
Uyruğu: TC.
Medeni durumu: Evli
İletişim adresi: aysengumustas@gmail.com
II- Eğitim
2012 -
Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Mikrobiyoloji ABD
Yüksek Lisans
2004 - 2008 Süleyman Demirel Üniversitesi Mühendislik Mimarlık Fakültesi Gıda
Müh. Bölümü Lisans
2000-2004
Uşak Orhan Dengiz Anadolu Lisesi
1997-2000
Elbistan Anadolu Lisesi
Yabancı dili: İngilizce
III- Ünvanlar
Gıda Mühendisi
2008
IV- Mesleki Deneyim
Stajyer: Mikrobiyoloji Lab./Kalite Kontrol Lab. ETİ Gıda Sanayi ve Tic. A.Ş.
ESKİŞEHİR (2007)
Kalite Sorumlusu/Sorumlu Yönetici: Bahar Tavukçuluk Ltd. Şti. ANTALYA
(2009)
Sorumlu Yönetici: Aydeniz Yemek Ltd. Şti. ANKARA (2010-2012)
76
V- Bilimsel İlgi Alanları
Poster Sunumları:
Aysen Gumustas, Merve Eylul Bozkurt, Mehmet Gumustas, Ahmet Akin, Sibel A.
Ozkan, Comparative Study for the Determination of Gemifloxacin by HPLC
and Microbiological Methods from Pharmaceutical Preparations and
Biological Samples, 2nd International Conference on Analytical Chemistry,
17-21 Eylül 2014, Targoviste, Romanya.
Seminer:
Proteomik Analizler ve Mikrobiyolojide Uygulamaları. Ankara Üniversitesi
Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji ABD, 31 Ocak 2014.
Yurtdışı Deneyim:
Laktik asit bakterileri ve bakteriyofajlarının araştırma yöntemleri üzerine çalışma.
Eliava Bakteriyofaj, Mikrobiyoloji ve Viroloji Enstitüsü Ar-Ge Bölümü,
Tiflis, Gürcistan (24 Şubat 2014-31 Ağustos 2014).
VI- Diğer Bilgiler
Eğitim sertifikaları:
HACCP Gıda Güvenliği Yönetim Sistemi Eğitimi (Aralık 2006 ISPARTA)
İyi Üretim Uygulamaları ( GMP ) ( Aralık 2007 ISPARTA )
Gıda İşletmelerinde Sorumlu Müdürlük ( Aralık 2007 İZMİR )
Diğer üyelikler:
Gıda Mühendisleri Odası Üyesi (2009- )
Download