2. DERS_Hucre inceleme Tek.pptx

advertisement
Doç. Dr. Metin Aytekin
metin.aytekin@gmail.com
www.metinaytekin.com
Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi
Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı
• Antonie van Leeuwenhoek
(1632-1723)
ž  Hücre
(cellula) terimi
1650’li yıllarda Robert
Hooke tarafından
mantar kesitinden
tanımlanmıştır.
ž  Hücrenin yapısını ve
fonksiyonlarını
inceleyen bilim dalının
adı sitoloji’dir.
ž  Hücre yaşamın en basit
yapıtaşıdır.
Robert Hooke’un mikroskopunun
kendi çizimi
ž Robert
Hooke canlı bitki dokularındada
kesitler alıp incelemiş, hücre çeperinin iç
kısmının sıvı ile dolu olduğunu
gözlemlemiş ancak önemini
kavrayamamıştır.
ž R. Hooke’un ortaya attığı hücre teorisi
basit de olsa çok önemlidir. Kendisinden
sonra gelen bilim insanlarının katkısı ile
daha ayrıntılı bilgiler ortaya çıkarılmıştır:
1831-Robert Brown-İngiliz
Botanikçi: nükleusun keşfi
1839-Purkinje-Alman
Fizyolog-çeperin iç kısmını
oluşturan sıvıya protoplazma
adını verir.
(Jan Evangelista Purkyně)
1852’de Remak &
1880’de Fleming:
hücre bölünmesini
(amitoz & mitoz)
incelemişlerdir.
1862-Kolliker-İsviçreli Biyolognükleusun etrafını çeviren
protoplazma kısmına
sitoplazma adını vermiştir.
1887 - Boveri- sentrozom
1897 - Benda- mitokondri
1898 - Golgi- Golgi Kompleksi
1899 - Garnier-Endoplazmik retikulum (E.R.)
1905 - Farmer & Moore- mayoz bölünme
1944 – Avery & McCarty, Griffts – Genetik etkileşim DNA
tarafından olur
ž  1953-
Watson & Crick:
ž  DNA’nın çift sarmal yapısı
ž 
Canlıların en küçük yapısal birimi olan hücre,
tüm biyokimyasal ve fizyolojik faaliyetlerin
gerçekleştiği yerdir. Hücreler, kendi kendilerine
çoğalabilirler, dışarıdan uyarılar alabilir ve bu
uyarılara cevap verebilirler. Tüm karmaşık
faaliyetler hücrede gerçekleşir.
ž 
Hücre, canlıların
- yapısal birimidir
- fonksiyonel birimidir
- büyüme (çoğalma) ve
- kalıtsal birimidir.
1.  Hücreyi bir bütün olarak inceleyen teknikler
2.  Hücreyi alt bileşenlerine ayırarak inceleyen
teknikler
Hücreleri tüm bir bütün olarak inceleyen teknikler
üç başlık halinde toplanmaktadır;
1.  Tespit (fiksasyonla) ederek inceleme
2.  Canlı (vital) inceleme
3.  Hücre kültürleri
Tespit (fiksasyonla) ederek inceleme
Işık mikroskobu:
Işık mikroskoplarında ışık kaynağı olarak
görünür dalga boyundaki ışınlar
kullanılmaktadır. Görünür ışığın dalga boyu
400nm-700nm arasındadır. Işık mikroskobunda
genellikle 500nm dalga boyu kullanılmaktadır.
Mekanik kısım; mikroskop ayağı, mikroskop
gövdesi, mikro ve makro ayar düzeyi, ve tabla
kısmından oluşur.
Optik kısım; mekanik kısım üzerine monte edilmiş,
görüntünün alınıp incelenmesini sağlayan kısımdır.
Oküler, tüp (mono, di, trinoküler), objektif,
kondansatör ve ışık kaynağından oluşur.
Işık kaynağından
gelen ışınlar
kondansatör
sayesinde, obje
tablası üzerinde
bulunan cisme ışık
konisi şeklinde gelir.
Cisimden yine bir ışık
konisi şeklinde yayılan
ışınlar objektife
toplanarak oküler
yardımı ile göze ulaşır.
Bir mikroskobun en önemli özelliği ayırma gücüdür
(resonans, resolution). Bir obje ne kadar büyütülürse
büyüsün bu büyütmeler hücrelerin ayrıntılı bir şekilde
incelenmesini sağlamaz. Bu nedenle ayırma gücü
önemlidir. Ayırma gücü: Yana yana duran iki nesneyi
net olarak seçebilme yeteneğidir. Işınların oluşturduğu
koninin tepe açısı θ ile gösterildiğinde ayırma gücü şu
formülle hesaplanır.
d= 0.61 λ
n Sinθ
d= ayırma gücü, λ= kullanılan ışığın dalga boyu,
θ= tepe açısı, n= objektif ile cisim arasında bulunan ortamın kırma indisi.
Objektifin cisme yaklaştırılması tepe açısının
büyümesine, dolayısıyla ayırma gücünün
azalmasına, diğer bir deyimle görüntünün
büyümesine neden olur.
Kırma indisi hava için=1, immersiyon yağı
için=1.5 olarak kabul edilir dolayısıyla
görüntünün netliği 1.5 kat artar fakat ayırma
gücü de 1.5 kat azalır.
Normal ışık mikroskopları ile birbirine 0.2
µm’den daha yakın olan ya da boyu 0.2
µm’den küçük olan cisimler ayırt
edilemezler.
Günümüz ışık mikroskopları hücreleri
ancak 1000 kez büyütme kapasitesine
sahiptir. Işık mikroskobu ile hücrelerin
belirli bölgeleri ayırt edilebilir, hücrelerin
detaylı yapısı incelenemez.
Floresan maddeler belirli dalga boyundaki ışığı
absorbe ederler ve uyarıldıkları zamanda daha uzun
dalga boyunda absorbe ettikleri ışığı tekrar yayarlar.
Bu özellikten yararlanılarak çeşitli floresan boyalarla
boyanmış cisimleri incelemek için floresan
mikroskoplar geliştirilmiştir.
Floresan mikroskopta 0.1 µm’ye kadar olan cisimler
incelenebilmektedir.
Floresan mikroskopta ışık mikroskobu ile aynı yapıda
olup, ışık kaynağı ve bazı optik parçaları ışık
mikroskobundan farklıdır.
•  Işın kaynağı olarak UV (mor ötesi) ışınlar kullanılır.
•  UV dalga boyunda ışın veren civa buharlı ampüller
kullanılır.
•  Mikroskobun optik kısımları UV’yi absorbe etmeyen
quartz’dan yapılmıştır.
•  Floresan mikroskoplarda kullanılan ışığın dalga boyunu
seçmeye yarayan özel filtreler olan 2 filtre bulunur. Bu
filtrelerden 1.’si kaynaktan gelen ışığı tutar ve sadece
cismin boyandığı floresan boyanın absorbe edebileceği
ışınları geçirebilir. 2. filtre ise cisimden yansıyan
ışınların çevreye yayılmasını engeller ve cisimden
gelen daha yüksek dalga boyundaki ışınları geçirir.
Floresan mikroskoplar, moleküllerin hücre
içindeki dağılımlarını tespit etmek için
kullanılırlar.
Spesifik gen bölgeleri, RNA transkriptlerinin ve
hedef proteinin yerini saptamak için kullanılır.
RNA ve Gen bölgelerini saptamak için
floresanla işaretlenmiş problar, proteinleri
saptamak için işaretlenmiş antikorlar kullanılır.
Normal ışık mikroskoplarına ışığı polarize
edici iki levha veya prizma yerleştirilmesiyle
elde oluşturulmuş bir mikroskoptur.
Bu levhalardan biri polarlayıcı olup, ışın
kaynağından gelen ışığı polarize ederek
cisme yollar.
Diğer levha ise çözümleyici olup, objektif
veya okülerin hemen üzerine konur.
Çözümleyici kendi etrafında 360 derece
çevrildiğinde mikroskop alanı her 180
derecede bir bir karanlık bir aydınlık olarak
görünür.
Polarizasyon mikroskobu, mikroskobun
ayırma gücünü artırmaz sadece kontrastı
artırarak belirli cisimlerin daha iyi
görünmesini sağlar.
X-ışınları Mikroskobu
•  1nm’den daha küçük atom ve moleküllerin yapılarının
incelenmesi için kullanılan bir mikroskoptur.
•  Bu mikroskobun mekanizması, küçük moleküllere Xışınlarının yol değiştirmesi prensibine dayanır.
•  Bu sistemde elde edilen cismin görüntüsü değil, o
cismin yapısal özelliğini gösteren çeşitli konsantrik
noktalar veya çizgilerdir.
X-ışınları Mikroskobu
•  Elektronik mercekler sayesinde, bir
kaynaktan çıkan X ışınları cismin üzerine
düşürülür.
•  Cisimden çıkan X ışınları bir fotoğraf
plağına veya floresan bir ekran üzerine
düşürülür. Sonuçta X ışınları kırınım
mikrografları elde edilir.
•  B u m i g r o g r a f l a r d a o r t a y a ç ı k a n
konsantrik noktalar veya çizgiler
değerlendirilerek o molekülün yapısı
ortaya çıkar.
Elektron Mikroskobu
•  Elektronlar kullanılarak ayırma
gücünün azaltılabileceği, yine
elektronların hızları artırılarak
dalga boylarının kısaltılabileceği
prensibine dayalı olarak
geliştirilmiştir.
•  Elektronların dalga boyları 0.004
nm’ye kadar indirilebilmektedir.
•  Işık mikroskobu ile hücrelerin
detaylı olarak incelenmesi
mümkün değildir.
Elektron Mikroskobu
•  Bu sebeplerden dolayı elektron mikroskobu
geliştirilmiştir.
•  Elektron mikroskobunda kullanılan elektronlar
ışık dalga boyuna göre çok kısa olduğu için
elektron mikroskobu hücrelerin detaylı olarak
incelenmesini sağlamaktadır.
İki tip elektron
mikroskobu vardır.
1- Scanning (Tarama) elektron
mikroskobu (SEM)
2- Transmisyon elektron
mikroskobu (TEM)
Transmission elektron mikroskobu
(TEM)
•  Elektron kaynağı silindir şeklindeki bir kolona
yerleştirilmiştir.
•  Silindirin havası boşaltılarak bir vakum
oluşturulur.
•  Hızlandırılmış elektronlar bir elektron demeti
halinde vakumlu silindirden geçerler.
•  Silindir içerisine belirli aralıklarla yerleştirilmiş
olan metal bobinler, tıpkı cam mercekler gibi
elektron demetini odaklar.
Transmission elektron mikroskobu
(TEM)
•  İncelenecek cisimlerde elektron demetine denk
gelecek şekilde vakumlu silindir içerisine yerleştirilir.
•  Örnekten gelen elektronların bir kısmı cismin
yoğunluğuna bağlı olarak dağılırken, geride kalan
elektronların bir ekran veya fotoğraf plağı üzerine
odaklanması sağlanarak görüntü oluşturmaları
sağlanır.
•  TEM ile incelenen doku veya hücrelerin iki boyutlu
görüntüleri elde edilir ve hücrelerin ayrıntılı
incelenmesine olanak sağlar.
Scanning (Tarama) elektron mikroskobu
(SEM)
•  İncelen hücre veya dokunun üç boyutlu görüntüsü
elde edilir, fakat ayrıntılı olarak incelenmesini
sağlamaz.
•  Görüntü için elektronlar kullanılır.
•  Fakat bu elektronlar örneğin içerisinden geçmez,
örneğin yüzeyinden dağılırlar. Bu nedenle bu
incelemede, fiksasyon işleminden sonra örnek çok
ince bir şekilde ağır bir metalle kaplanır.
•  Sonuçta inceleme sırasında ağır metalden yansıyan
elektronlar cismin dış yapısının üç boyutlu yapısını
gösterir.
Canlı (vital) İnceleme
Faz-Kontrast Mikroskop
Işık mikroskobuna
bazı optik parçalar
ilave edilerek hücrenin
çeşitli kısımlarından
geçen ışık şiddetleri
arasındaki fark
artırılabilir. Bu şekilde
oluşturulan
mikroskoplara
faz-kontrast
mikroskop denir.
Faz-Kontrast Mikroskop
Bu mikroskoplar,
mikroskobun ayırma
gücünü artırmaz,
sadece hücrenin çeşitli
kısımları arasındaki
kontrastı artırır.
Bu yöntemin avantajı,
canlı hücrelerin iç
yapılarının hücreye
zarar vermeden ve
herhangi bir boyama
işlemi yapılmadan
incelenmesini
sağlamasıdır.
İnterferans Mikroskobu
Bu mikroskobun prensibi de faz-kontrast mikroskobu ile
aynıdır.
Sadece bu mikroskopta kondansatör önüne çift kırma
özelliğine sahip kalsit veya quartz levhalar yerleştirilir.
Bu levhalardan ışın iki ışık demeti halinde çıkar.
Bu ışınlardan biri incelenen cisimden diğeri cismin
etrafından geçer.
Bu iki ışın birbirine düşürüldüğünde cisimden geçen ışın
biraz geciktirilmiş olduğundan ışınlar arasında faz farkı olur.
Sonuçta bu preparatlarda kabartma şeklinde görüntü oluşur.
Karanlık Alan Mikroskobu
Işık mikroskobuna özel bir kondansatörün takılması ile
oluşturulmuştur.
Bu kondansatör tüm ışınların cisme yandan gelmesini ve
yansıyarak göze ulaşmasını sağlar.
Cismi aydınlatıcı ışınlar yan taftan yöneldiği için karanlık
bir alanda ışığın dağılmış olduğu farklı fazlar arasındaki
sınır parlak görülür.
Karanlık alan
Işık mikroskobu
Faz kontrast
ž 
ž 
ž 
ž 
ž 
ž 
ž 
ž 
ž 
ž 
ž 
The Cell: A Molecular Approach, (5th Ed), Cooper &
Hausman, Sinauer, 2009.
Molecular Biology of the Cell (5th Ed), Alberts et al., Garland,
2007.
Molecular Cell Biology , (6th Ed), Lodish et al.,Freeman, 2007.
Tıbbi Biyoloji ve Genetik, H. Kasap (Ed), Nobel Yayınevi, 2010.
Moleküler Hücre Biyolojisi, H.V. Güneş, Kaan Kitabevi, 2006.
Hücre, Moleküler Yaklaşım. Cooper & Hausman. 3. Baskının
Çevirisi (Sakızlı & Atabey), İzmir Tıp Kitabevi, 2006.
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ders Notları, Demirtaş H. Erciyes Üniv.
Yayınları, 1996.
Tıbbi Biyoloji ve Genetik, Fulya Teksen, Ankara Univ. Yayınları,
2006.
Hücrenin Moleküler Biyolojisi, Alberts ve ark., 4. Baskı çevirisi,
TUBA, 2008.
Online kaynaklar (konu içinde kaynaklara gerekli atıflar
yapılır)
Ve diğer kaynaklar.
Download