thrombo strıp

KULLANICI KILAVUZU
Genequality
THROMBO STRIP
Kod 09-10A
Kod 09-10R
Faktör II, faktör V ve MTHFR kodlayan
genlerdeki mutasyonların eş zamanlı
belirlemesi ve tanısı için reverse hibridizasyon
testi (RHA)
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
1 ÜRÜN BİLGİSİ
3
2 KİT İÇERİĞİ
4
3 REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI
7
4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER
8
5 GÜVENLİK KURALLARI
8
5.1
Genel güvenlik kuralları
9
5.2
Kit hakkında güvenlik kuralları
10
6 KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER
11
6.1
Reaktifler
11
6.2
Cihazlar
11
6.3
Materyaller
11
7 ÖN MUAMELE VE REAKTİF HAZIRLAMA PROSEDÜRÜ
12
7.1 Faktör II, faktör V ve MTHR kodlayan genlerin uygun kısımlarının
amplifikasyonu
12
7.2
Reverse hibridizasyon için reaktifler
12
8 GİRİŞ
14
9 TEST PRENSİBİ
16
10 ÜRÜN TANIMI
17
11 ÖRNEK TOPLAMA,MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ
18
12 PROTOKOL
18
12.1 DNA ekstraksiyonu
18
12.2 Trombosis ile ilişkili genlerin uygun kısımlarının amplifikasyonu 18
12.3 Reverse hibridizasyon
20
12.3.1 İnkubasyon için talimatlar
20
Page 1
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
12.3.2 Oluklardaki sıvı değişimi için talimatlar
20
12.3.3 Beyanat ve önlemler
21
12.3.4 Denaturasyon ve hibridizasyon prosedürü
21
12.3.5 Sıkı yıkama prosedürü
23
12.3.6 Boyama prosedürü
23
13 SONUÇLARIN YORUMLANMASI
24
13.1 Kalite Kontrol
24
13.2 Yorumlama
24
14 SORUN GİDERME
25
15 TEST LİMİTLERİ
28
16 TEST PERFORMANSI
28
16.1 Özgünlük
28
17 REFERANSLAR
29
18 İLGİLİ ÜRÜNLER
30
Page 2
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
1 ÜRÜN BİLGİSİ
Bu kullanıcı kılavuzu aşağıdaki ürünleri içerir:
THROMBO STRIP
(Kod 09-10A)
Faktör II, faktör V ve methylentetrahydrofolate reductase (MHTFR) kodlayan
genlerdeki mutasyonların eş zamanlı belirlenmesi ve tanımlanması için kit.
Tanımlanan mutasyonlar: Faktör V Leiden, G1691A (Arg505Gln), Faktör V
Cambridge, G1091C (Arg306Thr), Faktör II, G20210A, MTHFR C677T.
Kit, striplerde reverse hibridizasyon (RHA) ile DNA amplifikasyonu ve
belirlemesi için reaktifler içerir.
Kod
09-10A-20
Ürün
THROMBO STRIP
Pkg
20 test
THROMBO STRIP
(Kod 09-10R)
Faktör II, faktör V ve methylentetrahydrofolate reductase (MHTFR) kodlayan
genlerdeki mutasyonların eş zamanlı belirlenmesi ve tanımlanması için kit.
Tanımlanan mutasyonlar: Faktör V Leiden, G1691A (Arg505Gln), Faktör V
Cambridge, G1091C (Arg306Thr), Faktör II, G20210A, MTHFR C677T.
Kit, striplerde reverse hibridizasyon (RHA) ile DNA amplifikasyonu için
primerler ve belirleme için reaktifler içerir.
Kod
09-10R-20
Ürün
THROMBO STRIP
Pkg
20 test
Page 3
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
2 KİT İÇERİĞİ
NOT: Kit içeriğinde farklı kodlarda (A ve R) farklı komponentler bulunur. (kısaltma: X= kit
içeriğinde bulunan komponent; 0= kit içeriğinde bulunmayan komponent)
KUTU R
kod
09-10A
kod
09-10R
+2 / +8 DE SAKLANIR
AÇIKLAMA
ETİKET
TÜP (T)
YA DA
KAPAK
RENGİ
20 test
Mavi
1 X 300 μL
X
X
Primer Miks
PRIMER MIKS
(PM)
X
X
Spesifik problar bağlı
Nitroselülöz strip
Thrombo Strip
X
X
EDTA (Ethylene-diamine-tetraacetic
acid) alkaline solution)
20
Denatürasyon
Solusyonu
1 X 1 mL
R 36/38
S 23-24-26
X
X
Sodium dodecyl sulfate (SDS)
solusyonu
Hibridizasyon
solusyonu
1 X 80 mL
X
X
Sodium dodecyl sulfate (SDS)
solusyonu
Sıkı Yıkama
Solusyonu
2 X 80 mL
X
Protein stabilizörleri ve koruyucu
olarak Micro-O-Protect 0.4% içeren
Tris-bufferda alkaline phosphatase ile
streptavidin işaretli 100X konsantre
solusyon
KONJUGAT 100X
1 X 800 μL
X
87.5% dimethylsulphidede 100X
konsantre Nitro blue tetrazolium
chloride ve Bromo-chloro-indolylphosphate solusyonu
X
X
NBT/BCIP
Tahriş edici
1 X 800 μL
toksik
R 36/37/38
S 36/37
X
X
NaCl, Triton®, protein stabilizör ve
koruyucu olarak 0.05% ProClin 300®
içeren Phosphate buffer.
X
X
X
X
Koniugat
diluent
1 X 80 mL
NaCl, MgCl2 ve koruyucu olarak
0.05% ProClin 300® içeren Trisbuffer.
Substrat Buffer
2 X 60 mL
X
NaCl, Triton ve koruyucu olarak
0.05% ProClin 300® içeren Trisbuffer.
Yıkama Solusyonu
1 X 80 mL
X
Her birinde 8 oluk içeren
İnkübasyon tray
3
Page 4
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
Triton® and ProClin® are registered trademark of Röhm e Haas Co
Page 5
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
KUTU F*
kod
09-10A
kod
09-10R
– 20°C DE SAKLANIR
AÇIKLAMA
ETİKET
TÜP (T)
YA DA KAPAK
RENGİ
20 test
Mastermiks
Sarı
2 X 520,5 μL
AB Taq
5 U/μL
Kırmızı
X
0
Amplifikasyon Miks (10X Buffer
,MgCl2 ve dNTP içeren)
X
0
Thermostabil Taq DNA
polimerase
X
0
Mineral Yağı
Mineral Yağı
Page 6
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
1 X 20 μL
1 X 1 mL
3 REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI
Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore
saklanmalıdır.
Özellikle:
KUTU F*
KUTU R
-20°C de saklanır
+2 / +8°C DE SAKLANIR
Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine
kadar stabil kalır.
Kutu R de test stripi içeren tüm reaktifler ve tüpler kullanılmadan önce oda
ısısında (20 - 25°C) eritilmelidir ve kullanımdan sonra hemen dondurucuya
kaldırılmalıdır.
Denaturasyon solusyonunu içeren şişe kullanımdan sonra hemen
kapatılmalıdır; bu solusyonun uzun süreli açık kalıp hava ile temasında hızlı
bozulmalar oluşur.
Geliştirilmiş kuru stripler karanlıkta, oda ısısında (20 - 25°C) saklanmalıdır.
Farklı lotlardaki reaktifleri karıştırmayın.
Page 7
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER
•
Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve
tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır;
•
Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve
tamamen okuyun;
•
Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun;
•
Son kullanım tarihi geçmiş kit parçalarını kullanmayın;
•
Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili
herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile
bağlantı kurun: laboratorio@abanalitica.it;
Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri
almalıdır:
•
Filtreli uç kullanın;
•
Biyolojik örnekler, ekstrakte edilmiş DNA, kit içeriğindeki referans DNA ve
tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde
saklanmalıdır.
•
PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında
materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın.
•
Sık sık eldiven değiştirin.
•
Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin.
•
Ekstrakte edilmiş DNAyı kısa bir süre için +2° / +8°C de saklayın ya da
daha uzun süreli saklamak için -20°C de dondurun.
•
Kullanmadan once PCR premiksi oda ısısında eritin; Taq DNA
polymerase ekleyin ve oda ısısında ya da buz kabında oldukça hızlı DNA
purifiye edin.
Page 8
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
5 GÜVENLİK KURALLARI
5.1 Genel Güvenlik Kuralları
•
Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın
ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın.
•
Ağızla pipetleme yapmayın.
•
Bilinen hiçbir diagnostik metod enfektif ajalnların yok olduğunu garanti
etmez. Tüm klinik örnekleri potansiyel enfeksiyonu ajanı olarak kabul
edip o şekilde kullanmak gerekir;
•
Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu
ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin
kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile
temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel
konteynerlere atılmalıdır.
•
Klinik örnekler, materyaller ve kontamine
dekontaminasyondan sonra atılmalıdır:
ürünler
aşağıdaki
30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit
solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna
batırılmalı
YA DA
en az 2 saat 121°C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren
solusyonları otoklavlamayın !!)
Page 9
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
5.2 Kit Hakkında Güvenlik Kuralları
Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir:
Tehlikeli Komponentler:
BCIP/NBT (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (X-phosphate) 4toluidine salt and 4-nitro blue tetrazolium chloride (NBT) in
dimethysulphide
Risk tanımı:
Xi Tahriş edici
RİSK İBARESİ VE S İBARESİ
R 36
R 37
R 38
S 36/37
Gözler için tahriş edici.
Solunum sistemi için tahriş edici.
Deri için tahriş edici.
Koruyucu giysi ve uygun eldivenler kullanın.
Denatürasyon Solusyonu
Sodium Hydroxide içerir.
Risk tanımı:
Xi Tahriş edici
RİSK İBARESİ VE S İBARESİ
R 36 ve R 38
S 23-24-26
Gözler için tahriş edici. Deri için tahriş edici.
Buharını solumayınız. Deri ile temasından kaçının.
Gözler ile temas etmesi halinde, bol su ile yıkayın ve
doktora başvurun.
Page 10
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
6 KİT
İÇERİĞİNDE
MATERYALLER
BULUNMAYAN
GEREKLİ
6.1 Reaktifler
•
•
•
•
DNA ekstraksiyonu için reaktifler
Steril DNase ve RNase free su;
Distile su;
DNA amplifikasyonu için reaktifler (kit kodu 09-10R için).
6.2 Cihazlar
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon
premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte
DNa eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir);
Mikropipetler (aralık: 0,2-2 µL; 0,5-10 µL; 2-20 µL; 20-200 µL; 100-1000
µL);
Thermalcycler;
Çalkalama platformu ile su banyosu (80 rpm; eğimli kapak ile; 50°C ±
0,5°C ye ayarlanabilir)
Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga;
Mikrosantrifüj (max 12-14.000 rpm);
Hibridizasyon kuyucuklarından likit aspirasyonu için cihaz
Dağıtıcı multipipet (opsiyonel).
Vorteks;
Orbital, resiprokal ya da salıncak platformlu shaker.
6.3 Materyaller
•
•
•
•
Tek kullanımlık eldivenler;
Mikropipetler için steril filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 µL; 0,5-10 µL; 2-20 µL;
20-200 µL; 100-1000 µL);
Stripi tutmak için pens;
Dereceli silindirler (10, 25, 50 ve 100 mL);
Page 11
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
7 ÖN MUAMELE VE REAKTİF HAZIRLAMA PROSEDÜRÜ
7.1 Faktör II, faktör V ve MTHFR kodlayan genlerin uygun
kısımlarının amplifikasyonu
NOT:
Mastermiks sadece kit 09-10A da bulunur.
•
Mastermiksi eritin. Amplifikasyon reaksiyonunun tüm kurulumu sırasında
reaktifler buzda tutulmalıdır.
7.2 Reverse hibridizasyon için reaktifler
•
Kullanmadan once tüm test materyallerinin oda ısısında (20° - 25°C)
erimesine izin verin.
•
Hibridizasyon Solusyonu ve Sıkı Yıkama Solusyonu en az 37°C ye kadar
ön-ısıtılmalıdır (tüm kristaller kullanılmadan önce çözdürülmelidir) fakat
hibridizasyon ısısı 50°C nin üzerine çıkmamalıdır.
•
Konsantre Rinse Solusyonunu 1:5 seyrelterek Rinse Solusyonunu
hazırlayın (1 volüm konsantre solusyon + 4 volüm distile ya da deiyonize
su). Herbir test oluğu için 8 mL Rinse Solusyonu + 10 mL fazladan
hazırlayın. Hazırladıktan sonra, seyreltilmiş Rinse Solusyonu +2/+8°C de
saklanırsa 2 hafta stabildir.
•
Konsantre Konjugatı 1:100 Konjugat Diluentte seyrelterek Konjugat
solusyonu hazırlayın.
Herbir test oluğu için 2 ml Konjugat Solusyonu + 2ml fazladan hazırlayın
(konjugat solusyonu sıkı yıkama aşaması sırasında hazırlanabilir).
•
Konsantre NBT/BCIP solusyonu Substrat Bufferda 1:100 seyrelterek
Substrat solusyonunu hazırlayın.
Page 12
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
•
Herbir test oluğu için 2 ml Sustrat Solusyonu + 2ml fazladan hazırlayın
(substrat solusyonu sıkı yıkama aşaması sırasında hazırlanabilir).
•
Konjugat ve substrat solusyonu hazırlamak için kullanılan tüm şişeler
iyice temizlenmelidir ve distile su ile yıkanmalıdır.
•
Hazırlanmasından sonra, seyreltilmiş Konjugat ve Substrat solusyonları
karanlıkta oda ısısında (20° / 25°C) 8 saat stabil kalır.
Page 13
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
8 GİRİŞ
Venöz tromboz, venlerde lokalize olan ya da trombustan salınan pıhtı ile
sirkülasyonun tıkanmasıdır. Trombus formasyonunun genel bölgeleri
yüzeyeldir ve bacaklardaki derin venlerdir, fakat beyinde, retinada,
karaciğerde ve mezenterdeki venlerde de görülebilir.
En önemli soru venöz tromboz gelişim riski ön görülüp görülmediğidir.
Travma, cerrahi, immobilizasyon, hamilelik ve oral kontraseptif kullanımı gibi
koagülasyon sisteminin lokal aktivasyonundan başka bireylerin genetik
altyapısı da önemli bir rol oynar. Venöz trombozun artmış riski, hemostatik ve
fibrinolitik ilerleyişi de içeren proteinleri kodlayan genlerdeli mutasyonların
görülmesi yüzünden yaşamı boyunca devam eder.
Şimdi, venöz tromboz gelişiminde önemli rol oynayan çeşitli mutasyonlar
tanımlanmıştır: Faktör II, Faktör V ve MHTFR (methylentetrahydrofolate
reductase).
Faktör V geni, inaktif pro-kofaktör olarak kanda görülen homonim proteinleri
kodlar. Protrombinin trombine dönüşümünde faktör Xa nın kofaktörü olarak iş
gören iki zincirli bir formasyonda (faktör Va) sonuçlanarak trombin ile aktive
hale gelebilir. Faktör Va nın inaktivasyonu aktive protein C (APC) ile Arg306,
Arg506 ve Arg679 de ağır zincirde direk seçici proteolitik ayrılma gösterir.
Trombozis, faktör V proteininde kritik bölgeyi etkileyen çeşitli genetik
mutasyonlarla sonuçlanabileceğine dair bir hipotez bulunmaktadır.
Faktör V geninin exon 10 unda G-A transisyonu pozisyon 506 daki argininin
glutamin ile yer değişimi sonucuna neden olur. Faktör V in bu mutasyonlu
formu faktör V Leiden mutant olarak bilinir. Aktive faktör V Leiden APC ile
yarılmaz ve bu nedenle APC-direnci göstermektedir. Bu APC direncinin
laboratuar fenotipinin moleküler temelidir.
Beyaz populasyonda faktör V Leiden taşıyıcı populasyon sınırı 2-15 kişidir.
Mutasyonlar beyaz olmayanlarda çok yüksek orandadır.
Heterozigot taşıyıcılar genel populasyonda 7 kata kadar derin venöz tromboz
riski taşırlar; homozigot taşıyıcılarda risk 80 kata kadar çıkar.
Faktör V Leiden mutasyonu olmadan APC direnci ve derin venöz trombozu
olan hastaların %5-10 unda, APC direnci hamilelik ya da yüksek faktör VIII
seviyesi gibi diğer faktörlere bağlı olabilir. Ayrıca, yakın zamanda yeni bir
faktör V mutasyonu APC direnci ile ilişkili bulunmuştur. Bu G-C mutasyonu
ekson 7 de görülür ve faktör V proteininde Arg306Thr de değişim ile
sonuçlanır: Bu mutasyon Faktör V Cambridge olarak adlandırılmıştır.
Protrombin ya da Faktör II trombinin inaktive öncüsüdür. Gen, 5’UTR, 13
intron ile 14 ekson ve 3’UTR içerir. Yakın zamanda, yükselmiş protrombin
Page 14
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
seviyesi ile ilişkili ve venöz trombozda artmış 3'UTR de genel bir genetik
varyasyon bulunmuştur. Nukleotid 20210 da bu G-A transisyonunun önemi
henüz tam olarak anlaşılamamıştır, fakat çeşitli araştırmacılar; heterozigot
taşıyıcıların taşıyıcı olmayanlardan yüzde 30 daha yüksek plazma protrombin
seviyesine sahip olduğunu ve genel populasyondan 3-6 kez daha yüksek
derin-ven tromboz riskine sahip olduğunu rapor etmişlerdir. Mutasyon beyaz
olmayanlarda nadir görülür. Beyazlarda, taşıyıcı oranı 0,7-4 kişi aralığındadır.
G20210A, serebral-ven trombozu için önemli bir risk faktörü olarak görülür.
Ayrıca, G20210A mutasyonu oral kontraseptif kullanımı ile sinerjetik olarak
görülebilir. Bu nedenle, hem G20210A mutasyon taşıyıcısı olan hem de oral
kontraseptif kullanıcısı olan bayanlar serebral-ven trombozunun yüksek riski
altındadırlar.
Hiperhomosisteinemi, serebrovasküler, periferal vasküler ve koroner
hastalıklar için bir risk faktörü olarak tanımlanmıştır. Plazma homosisteinin
yükselmiş seviyesi, homosistein metabolizması için trans-sülfürasyon ya da
re-metilasyon yollarında genetik ya da beslenme-ilişkili bozukluklar ile
sonuçlanabilir. 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR), 5,10
methylenetetrahydrofolate
to
5-methyltetrahydrofolate
indirgenmesini
katalizler. Isıya dayanıksız enzimler ile indirgenmiş MTHFR aktivitesi koroner
ve periferik arter hastalığı olan hastalarda rapor edilmiştir. Yakın zamanda,
MTHFR da genel bir mutasyon (C677T; Ala-Val) tanımlanmıştır ve bu
değişim seçilmemiş kişilerin yaklaşık %38 inde sıklıkla görülür. Mutasyon için
heterozigot ya da homozigot kişiler MTHFR önemli düşük spesifik aktivitesi
gösterirler. Mutasyon için homozigot olan kişiler önemli derecede yükselmiş
plazma homosistein seviyesine sahiptirler.
Multiple mutasyon görülmesi sinerjistik etkilere sahiptir. Bu nedenle, bu eş
zamanlı testlerin performansı için avantajdır.
Page 15
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
9 TEST PRENSİBİ
PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürlerde ilk DNA amplifikasyonu
metodudur. (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase
ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon
reaksiyonu olarak tanımlanabilir.
Reaksiyonda nükleik asitin üç segmenti yer alır: Amplifiye olması için çift iplikli
DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid “primerler” kalıp DNA
ya spesifik olarak dizayn edilmiştir.
DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine
başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin
(dNTPler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile
aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra,
hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir.
Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar.
Strip üzerinde immobilize spesifik prob ile işaretli amplifiye ürünlerin sonraki
hibridizasyonu (alel spesifik hibridizasyon/ Reverse Dot Blot) farklı
mutasyonları ayırt edebilir.
Page 16
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
10 ÜRÜN TANIMI
Thrombo-strip metodu reverse hibridizasyon prensibine dayanır. Faktör II,
Faktör V ve methylenetetrahydrofolate reductase kodlayan genlerin uygun
kısımları PCR tarafından amplifiye edilir ve denature biotinli amplikonlar,
membran stripinde paralel hatlarda immobilize olan spesifik oligonukleotid
problar ile hibridize olur. Hibridizasyon ve sıkı yıkamadan sonra, streptavidin
konjuge alkaline phosphatase eklenir ve önceden oluşan biotinli herbir
hibiride bağlanır. BCIP/NBT kromojen ile inkübasyon mor bir presipitat üretir
ve görünüşte yorumlanabilen bir sonuç oluşturur.
Bu kit ile aşağıdaki mutasyonlar tespit edilebilir: Faktör V Leiden G1691A (Arg
506 Gln), Faktör V Cambridge G1091C (Arg 306 Thr), Faktör II nin G20210A
mutasyonu ve MTHFR ın C6677T mutasyonu; sonuç yorumlama bunların
statüsünü değerlendirmeye izin verir (homozigot, heterozigot, genetik bileşik).
---------------------------------------------------
Marker line
Control line
Factor V wildtype
Factor V Leiden Arg506Gln
Factor V wildtype II
Factor V Cambridge Arg306Thr
Factor II wildtype
Factor II mutant G20210A
MTHFR wildtype
MTHFR C677T
Figür 1:
Thrombo-strip üzerinde spesifik probların lokalizasyonu. Markır çizgisi
oryantayon için stripin en üstünde çizilmiştir.
Page 17
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
11 ÖRNEK TOPLAMA,
MUAMELESİ
MANİPULASYON
VE
ÖN-
Tromboziste olan genlerin mutasyonlarının araştırılması periferik tam kandan
başlayarak yapılır.
Örnek toplama genel sterilite önlemlerini takip etmelidir ve örnekler transport
medyum olmayan steril kutulara transport edilmelidir.
Kan EDTAlı olarak alınmalıdır. Heparin gibi diğer koagülasyon ajanları TAQ
polymerase’ın güçlü inhibitörleridir ve bu yüzden amplifikasyon
reaksiyonunun verimliliğini bozar.
Taze kan +2/+8°C de saklanabilir (toplanmadan 4 saat içinde kullanılmalıdır);
eğer DNA hemen ekstrakte edilmeyecekse örnek -20°C de dondurulmalıdır.
12 PROTOKOL
12.1 DNA ekstraksiyonu
Saf ve integral DNA ekstrakte eden herhangi bir diğer ekstraksiyon yöntemi
de kullanılabilir.
12.2 Tromboz ile ilişkili genlerin uygun kısımlarının
amplifikasyonu
NOT: Mastermiks sadece kit 09-10A da bulunur.
Aşağıdaki reaksiyon miskini hazırlayın:
N X 34,7 μL
N X 10 μL
N X 0,3 μL
Mastermiks
PRIMER MIKS (PM)
AB Taq
N= örnek sayısı
Amplifikasyon aşamasında kontaminasyondan korunmanın yanında, analiz
edilecek tüm örneklere yetecek, DNA solusyonu dışında tüm reaktifler ile (ve
mineral yağı sonra gereklidir) bir mastermiks hazırlamanız önerilir; miks daha
Page 18
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
sonra DNA ve mineral yağı eklnecek olan 0.2 ya da 0.5 mL test-tüplerine
alikuatlanır.
Amplifikasyon için her bir tüpe ekleyin:
5 μL
2 damla
Ekstrakte DNA
Mineral Yağı
Her bir deneyde kontaminasyonları izlemek için bir negatif kontrol içermesi
önemlidir (mikse ekstrakte DNA yerine distile su ekleyin).
Mikrotüpleri aşağıdaki thermalcycler programına koyun:
1 cycle
94°C
5 min
94°C
30 sec
60°C
45 sec
72°C
45 sec
1 cycle
72°C
5 min
storage
4°C
40 cycles
Amplifikasyon ürünleri fragmanları uzunluğu:
Faktör II:
Faktör V Cambridge:
Faktör V Leiden:
Faktör MHTFR:
115 bp
130 bp
138 bp
134 bp
Elde edilen amplifikasyon ürünleri hemen hibridizasyon aşamasında
kullanılmalıdır ya da kullanılana kadar -20°C de saklanmalıdır.
Page 19
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
12.3 Reverse hibridizasyon
12.3.1 İnkübasyon için talimatlar
Hibridizasyon ve sıkı yıkama inkübasyonları tamamen 50°C de
yapılmalıdır ve yanlış pozitif sonuçlardan (eğer sıcaklık çok düşükse) ya da
yanlış negative/düşük sinyal sonuçlardan (eğer sıcaklık çok yüksekse)
kaçınmak için en kritik aşamadır. Eğimli kapağı olan çalkalamalı su banyosu
sıcaklık değişimlerini control etmek için iyidir. Kalibreli termometre ile sıkı
sıcaklık takibi gereklidir.
Sıcak hava shaker hibridizasyon ve sıkı yıkama için kullanılmamalıdır.
Çalkalamalı su banyosu (hibridizasyon aşaması) ve orbital, resiprokal
shaker ya da salıncak platformu (boyama aşaması) tarafından meydana
getirilen hareketin büyüklüğü maksimum duyarlılık ve homojen boyama
başarısı için kritiktir. Hareketin büyüklüğü, hem sıvının hem de test stripinin
oluk içinde ileri geri hareketi için yüksek olmalıdır. Ayrıca, sıvının olukların
kenarından sıçramasını da önlemelidir.
Hibridizasyon ve sıkı yıkama için oluklar su banyosunun sallama
platformu üzerinde olmalıdır. Su seviyesi oluklarun 1/3 ve ½ yüksekliğine
ayarlanmalıdır. Olukların suyun içinde yüzmediğinden emin olun. Su direk
tray ile temasta olmalıdır.
Daima inkübasyon sırasında su banyosunun kapağı kapalı olmalıdır.
Trayi kaplamayınız.
12.3.2 Traydeki sıvının değiştirilmesi için talimatlar
-
Sıvı, tercihen aspiratöre bağlı pipe tile oluklardan aspire edilmelidir.
Tray sıvının bir köşeye akmasını sağlayacak açı ile tutulmalıdır.
Her bir oluğa uygun solusyondan 2 ml ekleyin ve protokole devam edin.
NOT: Dağıtıcı multipipet (Eppendorf gibi) bu amaç için yararlıdır.
-
Bu aşamayı test protokolünde belirtildiği kadar tekrar edin.
Striplerin yıkama aşamaları arasında kurumasına izin vermeyin.
Sıvı aspirasyonu sırasında striplerin yüzeylerinin zarar görmediğinden
emin olun. Tercihen, sıvıyı stripteki markır çizgisinin üzerinden aspire
edin.
Tüm striplerin tamamen solusyon altına batıp yıkandığından emin olun.
Eğer gerekli ise shaker hızını değiştirin.
Page 20
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
12.3.3 Beyanat ve önlemler
-
Test striplerinin kaplı yüzleri (bu kısım işaretlidir) yukarı gelecek şekilde
oluklara yerleştirildiğinden emin olun.
Test striplerini tanımlarken kalem kullanın. Diğer işaretleyicileri
kullanmayınız. Tanımlama numaralarını markır çizgisinin üzerine yazın.
Striplere elle dokunmayın, temiz pens kullanın.
Herbir örnek için yeni bir filtreli uç kullanın.
Stripler güçlü gün ışığından ve ısıdan uzakta saklanmalıdır.
Yorumlamadan önce stripleri karanlıkta tamamen kurutun.
12.3.4 Denatürasyon ve hibridizasyon prosedürü
Bu test aşağıdaki prosedüre göre manuel olarak yapılabilir.
NOT:
Farklı inkübasyon aşamaları boyunca, test stripleri aynı oluk içinde
tutulmalıdır.
1.
2.
çalkalamalı su banyosunu tamamen 50°C ye ısıtın. Kalibreli termometre
kullanarak sıcaklığı kontrol edin ve eğer gerekirse sıcaklığı ayarlayın.
Hibridizasyon Solusyonu ve Sıkı Yıkama Solusyonunu en az 37°C ve 50°C
yigeçmeyecek şekilde ön-ısıtın. Kullanmadan önce karıştırın, tüm kristaller
çözülmelidir.
Pens kullanarak gerekli miktarda stripi tüplerden alın (herbir örnek için bir
strip) ve kalem kullanarak markır çizgisi üzerine tanımlama numaralarını
yazın.
3. gerekli miktarda test oluğu alın (herbir strip için bir oluk) ve tray içine
yerleştirin.
4.
Figür 2 de (aşama 1)gösterildiği gibi herbir oluğun üst köşesine 10 μL
Denatürasyon Solusyonu (DS) ekleyin.
NOT: Kullandıktan sonra hemen şişe kapaklarını kapatın.
5.
Denaturasyon Solusyonuna 10 μL biotinli amplifikasyon ürünü ekleyin ve
pipet yardımı ile dikkatlice karıştırın (Figür 2, Aşama 2). Daima steril filtreli
uç kullanın. Oda ısısında (20°-25°C) 5 dakika inkübe edin.
Page 21
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
6.
7.
Ön-ısıtılmış Hibridizasyon Solusyonunu çalkalayın ve amplifikasyon
ürünlerini denatüre etmek için herbir oluğa 2ml ekleyin.
dikkatlice
çalkalayarak karıştırın (Figür 2, aşama 3). Pipetleme sırasında komşu
oluğu kontamine etmemeye özen gösterin.
Stirpleri işaretli yüzleri yukarı bakacak şekilde hemen oluklara yerleştirin.
Stripler tamamen solusyon içine gömülmelidir. NOT: Tek kullanımlık
eldiven ve pens kullanın.
8. Trayi 50°C deki çalkalamalı su banyosuna koyun (yaklaşık 80 rpm,
İnkübasyon için talimatlara bakın), kapağını kapatın ve 60 dakika inkübe
edin.
NOT: Su banyosundan suyun olukların içine sıçramasına engel olun. Su
seviyesi olukların 1/3 ve ½ yüksekliğine ayarlanmalıdır. Trayin kaymasını
önlemek için iki ağırlık ile trayi hareketsiz hale getirin.
10 μL of
denaturation solution
tough
add 10 μL of
amplification product
add 2 mL of
hybridization solution
MIX BY
PIPETTING
Fig. 2: Denatürasyon ve hibridizasyon aşamaları
Page 22
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
put the strip
into the tough
12.3.5 Sıkı Yıkama Prosedürü
9. Hibridizasyondan sonra trayisu banyosundan alın.
10.
Trayi küçük bir açı ile tutun ve tercihen bir vakum aspiratöre bağlı pipet ile
sıvıyı oluklardan aspire edin. Herbir oluğa 2 ml ön-ısıtılmış Sıkı Yıkama
Solusyonu ekleyin ve oda ısısında 10-20 saniye çalkalayarak yıkayın. Her
bir oluktan sıvıyı aspire edin.
11. Bu yıkama aşamasını tekrar edin (oluklardaki sıvıyı değiştirme
talimatlarına bakın).
12. Sonunda, solusyonu aspier edin ve herbir stripi 2 ml ön-ısıtılmış Sıkı
Yıkama Solusyonunda 50°C çalkalamalı su banyosunda 30 dakika inkübe
edin. Su banyosunun kapağını kapatın.
NOT:
Sıkı yıkama aşaması sırasında Rinse solusyonu ve Konjugatı hazırlayın
(reaktifleri hazırlama kısmına bakın).
12.3.6 Boyama prosedürü
Aşağıdaki tüm inkübasyonlar 20°-25°C de shakerda yapılmalıdır.
1.
2.
3.
Herbir 2 ml seyreltilmiş Rinse solusyonu ile iki kez 1 dakika yıkayın
(reaktifleri hazırlama ve oluklarda sıvı değişimi talimatlarına bakın). Aspire
edin.
Herbir oluğa 2 ml Konjugat solusyonu ekleyin ve 30 dakika çalkalayarak
inkübe edin. Aspire edin.
NOT: Konjugat inkübasyonunun bitmesin 10 dakika kala Substrat
solusyonunu hazırlayın. (reaktifleri hazırlama kısmına bakın).
Herbir stripi 2 ml Rinse solusyonu ile iki kez 1 dakika yıkayın ve 2 ml
Subsrat Buffer ile bir kez daha yıkayın. Aspire edin.
Herbir oluğa 2 ml Substrat solusyonu ekleyin ve 30 dakika (karanlıkta)
çalkalayarak inkübe edin. Aspire edin.
5. Stripleri 2 ml distile su ile çalkalayarak en az 3 dakika yıkayarak renk
oluşumunu durdurun.
4.
Page 23
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
6.
Pens kullanarak stripleri oluklardan alın ve emici kağıt üzerine koyun.
Striplerin tamamen kurumasını sağlayın ve yorumlama kağıdına yapıştırın.
En üst çizgi markır çizgisidir. Bu çizgi yorumlama kağıdında striplerin
uygun sıra ile dizilmesini sağlar.
13 SONUÇLARIN YORUMLANMASI
13.1 Kalite Kontrol
Ilk pozitif çizgi Konjugat Kontrol çizgisidir (hemen markır çizgisinin altında).
Bu çizgi prosedür sırasında Konjugat ve Substrat arasındaki reaksiyonu
gösterir. Bu bant daima pozitif olmalıdır ve aynı test çalışmasında herbir
stirpte yaklaşık aynı şiddette olmalıdır.
13.2 Yorumlama
Temiz görünür çizgi olması pozitif reaksiyonu gösterir.
Stripte pozitif olan tüm çizgi numaralarını tanımlayın ve yorumlama kağıdı ve
aşağıdaki tabloyu kullanarak sonuçları belirleyin:
Bant
(1)
2
3
4
5
6
7
8
9
Prob reaktivitesi
(konjugat kontrol çizgisi; daima pozitif olmalıdır)
Faktör V wildtype I
Faktör V Leiden G1691A (Arg506Gln)
Faktör V wildtype II
Faktör V Cambridge G1091C (Arg306Thr)
Faktör II wildtype
Mutant Faktör II G20210A
MTHFR wildtype
MTHFR C677T
Page 24
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
14 SORUN GİDERME
Tüm striplerin konjugat control çizgilerinde zayıf sinyal ya da sinyal
olmaması
•
Muhtemelen boyama aşamasında uygun olmayan miktarda Konjugat ya
da Substrat eklenmiştir.
− Aynı stripler ile taze Konjugat solusyonu ve taze Substrat solusyonu
hazırlayarak boyama aşamasını tekrar edin.
•
Oda ısısı 20°C den düşük olmuştur.
− Laboratuarı doğru sıcaklığa ulaşana kadar ısıtın.
Konjugat kontrol çizgisi hariç prob çizgisinde yanlış-negatif sonuç ya da
oldukça zayıf sinyal.
•
Hibridizasyon aşaması ya da sıkı yıkama sırasında sıcaklık çok yüksektir
− Hibridizasyon ve sıkı yıkama aşamaları sırasında su banyosunun
sıcaklığını dikkatlice control edin.
•
Hibridizasyon solusyonu ya da sıkı yıkama solusyonu uygun şekilde önısıtılmamış ya da karıştırılmamıştır.
− Hibridizasyon solusyonu ve sıkı yıkama solusyonunu uygun şekilde önısıtın ve karıştırın.
•
Hibridizasyon için amplifikasyon ürünleri çok fazla seyreltildiğinden
yetersiz amplifikasyon olmuştur.
−
Amplifiye ürünlerin görünürlüğünü %3 agaroz jelde control edin. 10 µL
amplifiye ürün ekleyin. Jelde görünür olan PCR fragmanları stripte de
temiz sonuçlar verir.
− Artmış DNA hedef miktarı ile amplifikasyonu tekrar edin.
−
Ekstraksiyondan sonra elde edilen DNA solusyonu saf değildir (O.D.
260/280 oranı çok düşüktür). Ekstraksiyon protokolünü doğru şekilde
Page 25
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
−
yaptığınızı kontrol edin ve yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar
ekstraksiyon yapın.
Ekstraksiyondan sonra elde edilen DNA solusyonu rezidüel RNA içerir
(O.D. 260/280 oranı çok yüksektir). RNase sindirim aşaması ile RNA yı
uzaklaştırın.
−
Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır: Thermalcycler
programının uygunluğunu ve kullanıcı kılavuzundaki sıcaklık profilini
kontrol edin.
−
Amplifikasyon miksine çok fazla DNA eklenmiştir: DNA örneğini
seyreltin ve 10 kez az DNA ekleyerek amplifikasyonu tekrar edin.
•
DNA ekstraksiyon aşaması sırasında problemler
− Ekstraksiyon metodunun uygun olduğundan ve tüm bilgileri doğru
şekilde takip ettiğinizden emin olun;
− Ekstraksiyon kitinin kullanıcı kıalvuzundaki sorun giderme kısmına
başvurun
− Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar DNA ekstraksiyonu yapın.
Yanlış-pozitif sinyaller (spesifik olmayan sinyaller).
•
Hibridizasyon ve sıkı yıkama sırasında su banyosu sıcaklığı çok
düşüktür.
−
Spesifik sinyal elde etmek için hibridizasyon ve sıkı yıkama sırasında
sıcaklığın 50°C ± 0.5°C olduğundan emin olun.
− Daima inkübasyon sırasında su banyosunun kapağı kapalı olmalıdır;
•
Hibridizasyon solusyonu ya da sıkı yıkama solusyonu uygun şekilde önısıtılmamış ya da karıştırılmamıştır.
− Hibridizasyon solusyonu ve sıkı yıkama solusyonunu uygun şekilde önısıtın ve karıştırın.
Page 26
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
•
Renk gelişimi çok hızlıdır
−
15 dakika sonra renk gelişimini durdurun (önerilen 30 dakika yerine).
Fazla şiddetli renk gelişimi yüksek arka plana ve/veya yanlış-pozitif
sinyallere neden olabilir.
−
Amplifikasyon miksine çok fazla DNA eklenmiştir: DNA örneğini
seyreltin ve 10 kez az DNA ekleyerek amplifikasyonu tekrar edin.
•
Eğer aynı aspesifik patern tüm striplerde görülüyorsa kontaminasyon
olabilir.
− Tüm DNA ekstraksiyonunu ve PCR amplifikasyonunu taze hazırlanmış
solusyonlar ile tekrar edin.
Stripin merkezinde renklenmeme ya dab ant oluşmaması ya da homojen
olmayan boyanma.
•
Prosedür sırasında shakerın rotasyon hızı çok düşüktür.
−
Aynı stripleri kullanarak boyama prosedürünü tekrar edin. Hızı artırın ve
striplerin tamamen inkübasyon sıvısına gömülü olduğundan emin olun.
Güçlü arkaplan
•
Konjugat uygun olarak seyreltilmemiştir ya da konjugat fazlası uygun
şekilde yıkanmamıştır.
−
•
Aynı amplifiye materyalleri kullanarak dentaürasyon aşamasından
başlayarak yeni stripler ile testi tekrar edin. Boyama aşamasında Rinse
solusyonu ile yıkama sırasında striplerin oluklarda ileri geri hareket
ettiğinden emin olun. Yıkama zamanı en az 1 dakika olmalıdır.
Oda sıcaklığı 25°C den yüksektir.
− Laboratuarı doğru sıcaklığa ulaşana kadar soğutun.
•
Stripler substrat solusyonunda çok uzun inkübe edilmişlerdir.
− Prosedürde belirtilen inkübasyon zamanını uygulayın.
Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin.
laboratorio@abanalitica.it, faks (+39) 049-8709510, ya da tel. (+39) 049761698.
Page 27
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
15 TEST LİMİTLERİ
Kit performansı aşağıdaki durumlarda azalır:
Klinik örnekler kullanım için uygun değildir (doğru saklanmamış ya da heparin
ile alınmış kan örnekleri)
Kit uygun koşullarda saklanmamıştır.
16 TEST PERFORMANSI
16.1 Özgünlük
En önemli bilgi bankasında uygulanan primer dizisi spesifik olmayan dizilerin
yokluğunu değerlendirir.
Eğer protokoldeki sert şartlar doğru olarak yapılırsa striplerdeki problar için bu
geçerlidir.
Page 28
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
17 REFERANSLAR
Bagley PJ, Selhub J, Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95:13217-13220.
Bertina RM, Koeleman BPC, Koster T, Rosendaal RJ, Dirven RJ, de Ronde
H, van der Velden PA, Reitsma PH, Nature 1994; 369:64-67.
Malik NM, Syrris P, Schwartzman R, Kaski JC, Crossman DC, Francis SE,
Carter ND, Jeffery S, Clin Sci 1998; 95: 311-315.
Motti C, Gnasso A, Bernardini S, Massoud R, Pastore A, Rampa P, Federici
G, Cortese C, Atherosclerosis 1998; 139:377-383.
Poort SR, Rosendaal FR, Reitsma PH, Bertina RM, Blood 1996; 88:36983703.
Saiki RK, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich and N Arnheim,
Science 230, 1350-1354, 1985.
Williamson D, Brown K, Luddington R, Baglin C, Baglin T, Blood 1998;
91:1140-1144.
Page 29
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
18 İLGİLİ ÜRÜNLER
HEMO STRIP
(Kod 09-11A)
Reverse hibridizasyon testi (RHA) ile hemokromatozis-ilişkili HFE genindeki
mutasyonları eş zamanlı belirlemek ve tanımlamak için kit. Tanımlanan
mutasyonlar: C282Y; H63D; S65C.
Kit, striplerde reverse hibridizasyon (RHA) ile DNA amplifikasyonu ve
belirlemesi için reaktifler içerir.
Kod
09-11A-20
Ürün
HEMO STRIP
Pkg
20 test
HEMO STRIP
(Kod 09-11R)
Reverse hibridizasyon testi (RHA) ile hemokromatozis-ilişkili HFE genindeki
mutasyonları eş zamanlı belirlemek ve tanımlamak için kit. Tanımlanan
mutasyonlar: C282Y; H63D; S65C.
Kit, striplerde reverse hibridizasyon (RHA) ile DNA amplifikasyonu için
primerler ve belirleme için reaktifler içerir.
Kod
09-11R-20
Ürün
HEMO STRIP
Page 30
09-10A-20_8033622781288_TR.doc
Pkg
20 test