Prenatal Tanıda Yeni Ufuklar Non İnvaziv Prenatal Test
advertisement
Prenatal Tanıda Yeni Ufuklar Non İnvaziv Prenatal Test Dr İsrael Aruh, Kent hastanesi IVF Ünitesi Direktörü PRENATAL TEST: NIPT TEKNOLOJİSİNE BAKIŞ Kromozom Anomalilerinin Prenatal Görülme Sıklığı Percent of Reported Chromosome Abnormalities 16 T21 T18 5 8 53 5 Major fetal aneuploidies T13 45,X Sex trisomy 13 Other rare Data adapted from Wellesley, D, et al., Rare chromosome abnormalities, prevalence and prenatal diagnosis rates from population-based congenital anomaly registers in Europe. Eur J of Hum Gen, 11 January 2012. PRENATAL TARAMA SEÇENEKLERİ – RISK SCORE Down Syndrome Testing with 5% Screen Positive Rate Detection Rate (%) 1st Trimester 64-70 1st Trimester 82-87 2nd Trimester 69 2nd Trimester 81 Integrated Screen 94-96 Serum Integrated 85-88 ACOG Practice Bulletin No. 77, January 2007 . GÜNÜMÜZDEKİ TANI SEÇENEKLERİ KARYOTYPE Trimester - Test Sensitivity Specificity 1st – CVS 99.25%1 98.65%1 2nd - Amniocentesis 99.4%2 99.5%2 Kesin cevap, ancak girişimsel olup anne ve fetus için risk taşır. Tarama testlerindeki yüksek yanlış pozitif oranlarından dolayı, çoğu zaman gereksiz yere uygulanır. 1. Hahnemann JM, Vejerslev LO. Accuracy of cytogenetic findings on chorionic villus sampling (CVS)--diagnostic consequences of CVS mosaicism and non-mosaic discrepancy in centres contributing to EUCROMIC 1986-1992. Prenat Diagn. 1997 Sep;17(9):801-20. 2. Mid-trimester amniocentesis for prenatal diagnosis. Safety and accuracy. JAMA. 1976 Sep 27; 236(13): 1471-6. . PRENATAL TEST SPEKTRUMU TARAMA Risk skorları biyokimyasal analiz ve populasyon istatistikleri kullanılarak elde edilir. TANI Sonuçlar tamamen genetik faktörlere bağlıdır. Serum Screening CVS Combined Serum Screens, NT, Ultrasound SCREENING NIPT Amnio DIAGNOSTIC NIPT’NİN HEDEFLERİ NELERDİR? Fetal, maternal riski azaltmak Tüm gebelere kolay uygulanır olması Yalancı pozitifleri azaltmak Yüksek tespit oranı sağlama MATERNAL KANDA FETAL DNA’NIN İKİ KAYNAĞI: • Fetal hücreler • Tüm hücre popülasyonunun milyarda biri • İzolasyonu için mekanik ve biyokimyasal yöntemler gerekir • Cell-free DNA (cfDNA) • Anne kanında maternal ve fetal cfDNA birarada mevcuttur • Total cfDNA’nın %2–20’si fetus’a aittir . MATERNAL KANDA FETAL cfDNA Gebelikte güvenli analiz edilebilen bir komponenttir • Apoptosis sonucu salınır • Fetal cfDNA plasentanın cytotrophoblastic hücrelerinden salınır • Kan dolaşımına küçük DNA fragmentleri(150-200bp) olarak karışır • 7+ gebelik haftasında güvenle tespit edilir • Postpartum saatler içinde dolaşımdan kaybolur . NIPT Metodları COUNTING SNPs MPSS DANS+FORTE Targeted Sequencing Massively Parallel Shotgun Sequencing Digital Analysis of Selected Regions+ Fetal Fraction Optimized Risk of Trisomy Evaluation NIPT Metodları Massively Parallel Shotgun Sequencing Sequenom MaterniT21 Targeted Sequencing Verinata Verifi COUNTING Ariosa Harmony Targeted Sequencing Natera Panorama SNPs Sayarak Chrom 21 Chrom 3 Sayarak Expected Amount: Observed Amount: Chrom 21 20% 25% Chrom 3 80% 75% Sayma Metodu Collect (MPSS, Targeted) Sequence Assign/Map with Reference Calculate ratio Observed:Expected Create result Confidential and Privileged Cell free DNA ve Fetal Fraksiyon cfDNA comes from apoptytic cells derived from: •Maternal • Adipocytes • Hematopoetic system •Fetal • Placenta (trophoblasts) Fetal DNA Fetal Fraction = Fetal DNA + Maternal DNA Cell free DNA (cfDNA) Chromosome 21 is 1.5% of genome equivalents (0.75 per chromo) Difference of 0.03% At 10% fetal DNA: [1.5% x (90% maternal)] + [1.5 + 0.75 =2.25%] x (10% fetal)] = 1.575% At 5% fetal DNA: [1.5% x (95% maternal)] + [1.5 + 0.75 =2.25%] x (5% fetal)] = 1.530% Kromozoma bağlı amplifikasyon değişimleri Adapted from: Fan, Quake et al. 2008 PNAS Average Counting Sensitivity1,2,3,4 SNP Sensitivity5 Trisomy 21 99.67% >99% Trisomy 18 98.5% >99% Trisomy 13 86.4% >99% -“Özellikle G ve C’nin çok düşük veya fazla olduğu kromozomlarda, amplifikasyon aşaması daha geniş varyasyonlara yol açar.”6 Sayma metodu DNA’daki bilgilerden ziyade DNA miktarına dayanır ve bu nedenle bu varyasyonlardan daha çok etkilenir. - SNP metodu ile kromozomdan kromozoma amplifikasyon değişimi elimine edilerek, trizomi 13 ve seks kromozomlarındaki azalmış sensitivite ve spesifisite sorunu önlenir.”6 1 Palomaki 2011 2 Bianchi 2012 3 Ashoor 2212 4 Ashoor 2012 5 Nicolaides, 2013 6 Boon & Faas 2013 SNP’ler: Genomdaki herhangi bir nükleotidin A,T,G ve C’nin DNA sekanslarındaki dizilimindeki varyasyonlarından dolayı değişimine SNP adı verilir. SNP’ler toplumlardaki doğal genetik varyasyonların bir parçasıdır. SNP-Bazlı Yaklaşım 19,488 SNP simultane hedeflenir SNP Sequencing Plasma = Maternal + Fetal DNA Maternal blood SNP Sequencing Buffy coat = Maternal DNA Maternal + Fetal Genotype Fetal Genotype Maternal Genotype SNP (NATUS) Algoritması kullanılarak Next-generation Anöploidi Testi Genotypic Data from Mom +/Dad Multiple hypotheses for each chromosome + Sub-hypotheses with different crossover points Data from Human Genome Project (HapMap) Maksimum Olasılık Tahmini Doğru Hipotezi Belirler Sequencing Measurements from Maternal plasma Compare Maksimum Olasılık Tahmini Doğru Hipotezi Belirler Sequencing Measurements from Maternal plasma Compare Maksimum Olasılık Tahmini Doğru Hipotezi Belirler Sequencing Measurements from Maternal plasma Compare Her koşul için kişiselleştirilmiş risk skoru SNP profilinin çözülümü Disomy Trisomy Mother AA, Fetus AA Mother AA, Fetus AAA Mother AA, Fetus AB Mother AA, Fetus AAB Mother AB, Fetus AAA Mother AB, Fetus AA Mother AB, Fetus AAB Mother AB, Fetus AB Mother AB, Fetus ABB Mother AB, Fetus BB Mother AB, Fetus BBB Mother BB, Fetus AB Mother BB, Fetus ABB Mother BB, Fetus BB Mother BB, Fetus BBB NATUS Algoritma Özeti • Anne ve babadan fetüse geçen, ilgili kromozomlardaki (21,18,13,X,Y) tüm crossover’lar dahil milyonlarca olası sonuç hipotezleri bilgisayar tarafından oluşturulur. • Olası tüm sonuçlar fetüsün fragmente SNP profilleri ile karşılaştırılır • Sonucu verebilmek için tüm eşleşmeler toplanıp maksimum olasılık bayesian analizi kullanılır • Özelleştirilmiş risk skoru elde etmek için, SNP sayıları,, fetal fraksiyon,maternal yaş ve diğer örneğe bağlı faktörler kullanılır. SNP-bazlı Yaklaşımın Avantajları • Tüm otozomlarda daha tutarlı tespit oranı – Düşük veya yüksek GC içeriğinden kaynaklanan kromozom amplifikasyonu önyargısından bağımsız • Referans kromozoma ihtiyaç yok • Düşük hata oranı • Triploidiyi tespit edebilme Taken from http://wdic.net/word/snp • Düşük fetal fraksiyonlarda daha hassas performans Neden Sayma Metodu Triploidiyi Tespit Edemez? No difference Triploidi Tespiti • Sayma metodu triploidiyi tespit edememektedir – Sayma metodu uygulanan 8 olgu ‘’etkilenmemiş olarak” raporlanmıştır (Bianchi 2012, Futch 2013) – 2 kör çalışmada, 5 paternal triploidi olgusunun tamamı SNP metoduyla tespit edilmiştir. Triploidi Tipleri Extra haplotypes Placenta Fetus Biochemistry Other findings DIGYNIC Maternal DIANDRIC Paternal Small, normal Growth-restricted, often abnormal Large, cystic Less affected Very low free βhCG and PAPP-A free β-hCG 10X higher than normal Partial Molar - Maternal complications Vanishing Twin/Triploidi Sonucunu Alındığında Takip • Vanishing twin/ Triploidi – Eğer ikinci sak yok ve/veya anormal plasenta bulgusu mevcut ise, girişimsel tanı testi önerilir Düşük Fetal cfDNA Fraksiyonu Tespit Oranını Düşürür 40 9-14. gebelik haftasında anne adaylarının %25’inde fetal fraksiyon oranı %4-8 arasında saptanmıştır. (2,3) Counting Down Syndrome Sensitivity1 Panorama Down Syndrome Sensitivity2 30 Fetal Fraction (%) % Fetal DNA Fraction 35 25 20 15 10 >8% >99% >99% 5 4-8% 75% >99% 0 8 10 12 14 16 18 20 Gestational Age (weeks) 1.Palomaki GE et al DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an interntional clinical validation study. Genet Med 2011 Nov; 13(11):913-2 2. Natera Internal Data 3. Norton ME et al. Non-Invasive Chromosomal Evaluation(NICE) Study: results of a multicenter prospectgive cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18. AJOB 2012;1.e1-1.e8 22 24 Fetal Fraksiyonun Önemi “Son 1.5 yıl içerisinde, anöploidi tespiti için Dünya’da 100,000’den fazla DNA testi uygulanmış olup, test performansını etkileyen faktörler daha belirginleşmiştir. cffDNA’nın relatif oranı yani fetal fraksiyonun önemi kriktir.” -- Lyn Chitty and Diana Bianchi Prenatal Diagnosis 2013, 33, 511–513 Fetal Fraksiyon Aralıkları Fetal Fraction too low to report Intermediate fetal Fetal fraction adequate to fraction – decreased achieve best performance sensitivity with counting methodology Fetal fraksiyonun %4’ten düşük olduğu durumda puzzle’daki resim What is this a picture of? aşağıdaki gibi gözükür. Sonuç alınamaz. Edges are minimum ff – so no call is made by anyone <4% fetal fraction Confidential and Privileged 63 4-8% fetal fraksiyonda sayma metoduyla, puzzle’da halen eksik parçalar Missing rağmen, moderate amount of pieces, but still making call bulunmasına resim daha belirginleşti. Photo of car and highway 4-8% fetal fraction, single Confidential and Privileged rejection test 64 SNP metoduyla 4-8% fetal fraksiyonda puzzle parçaları daha Still yerleşerek have same amount of pieces, but now they are the right pieces doğru resim daha nettir. -BUFFALO walking in the street 4-8% fetal fraction with metrics Confidential and Privileged 66 Reporting Reporting Method Sequenom MaterniT21 Plus Verinata Verifi Ariosa Harmony Natera Panorama Positive Negative Detected Not Detected Suspected Risk score (mat age, fetal fraction, 1 metric) Risk Score (mat age, fetal fraction, multiple metrics) Confidential and Privileged Confidential and Privileged Confidential and Privileged Confidential and Privileged Confidential and Privileged Low Risk Report High Risk Report for Trisomy 21 FETAL FRACTION: 9.2% Confidential and Privileged Unable to Report – Low Fetal Fraction FETAL FRACTION: 3.2% Unable to Report – Redraw Recommended • Spesifik bir örnekteki DNA fragmentlerine bağlı bir durum olduğu düşünülüp, yeni bir örneğin daha hassas bir sonuç verebileceği ihtimalinde tekrar bir kan örneği alınması istenebilir. • Böyle bir sonucun gelmesi, gebelikte herhangi bir sorun olduğunu göstermez. • Redraw önerilmesinin amacı daha hassas ve güvenilir bir sonuç alınabilmesini hedefler. • Redraw önerildiğinde, 2. bir örneğin alınmasıyla %90 ihtimalle sonuç alınır. • DÜŞÜK FETAL FRAKSİYON – <3.5% fetal fraksiyon – Algoritmayla yüksek güvenirlikte sonuç alınamaz. – Not:Diğer NIPT metodlarında fetal fraksiyon cutoff değeri %4’tür. • DOES NOT PASS QUALITY METRICS -– DNA daha az bilgi verici ise ("noisy" data) – Algoritmanın yüksek güvenirlikte sonuç vermesinde güçlük olduğunda. – Bunlar, total DNA miktarı (kombine maternal ve fetal DNA), okuma sayısı ve de hassas ve tutarlı sonuçlar elde etmek için iyi kalitede veri sağlıyan diğer kontrol ölçümlerini içerir. Unable to report – Redraw NOT recommended • Uninformative DNA Pattern – Vakaların <1% – DNA yorumlanamıyorsa – Bu hasta için klinik öykü tekrar dikkate alınıp takip ve/veya daha ileri tetkik seçenekleri önerilebilinir • Fetal mozaisizm • Maternal kromozom anomalileri veya mozaisizm • Beklenenden fazla seviyedeki homozigosite (Haploblock) • Egg donor or surrogate NIPT IS A INVASIVE PROCEDURE UPDATE BY MONTH (7/2010 THROUGH 3/2013) NIPT’yi öneren kurumlar Nisan 2013, TJOD İstanbul Şubesi • Maternal Kanda Hücre Dışı Fetal DNA (cffDNA) ile Non-Invasive Prenatal Test (NIPT) • Uzman Görüşü • Raporu onaylayanlar (soyadı sırasına göre); BAKSU Başak, BAŞARAN Seher, BAŞGÜL Alin, BATUKAN Cem, ERMİŞ Hayri, GEDİKBAŞI Ali, GÜL Ahmet, HAS Recep, KALELİOĞLU İbrahim, PEKİN Oya, POLAT İbrahim, ŞAHİNOĞLU Zeki, ULUDOĞAN Mehmet, TUĞRUL Semih, YAZICIOĞLU Fehmi, YILDIRIM Gökhan, YÜKSEL Atıl) • cffDNA ile NIPT'nin olası kullanım alanları: * * * * * Maternal yaşın 35 ve üstünde olması. Trizomi tarama testlerinin pozitif olması durumunda. Trizomi 21 ve 18 için spesifik ultrason belirteçlerinin varlığında. Trizomi 21 ve 18’li fetus / bebek öyküsünde. Parental dengeli robertsonian Trizomi 21 ve Trizomi 13 translokasyonu. The performance of screening for trisomy 21 and trisomy 18 by NIPT using chromosome-selective sequencing in a routine population is as effective as previously reported in high-risk groups with DR 99% and FPR 1%. Daha önce bildirilen yüksek risk gruplarındaki %99 tespit oranı ile %1’lik yalancı pozitif oranı, trizomi 21 ve trizomi 18’in taramasında kromozom-selektif sekanslama kullanılarak uygulanan NIPT performansı, rutin popülasyonlarda da eşit derecededir. Am J Obstet Gynecol 2012;207:374.e1-6. On the basis of existing data, NIPT can potentially be used in universal screening for trisomies 21 and 18 in all singleton pregnancies and the main limiting factor for such widespread application of the test at present is the associated cost. Mevcut verilere göre, NIPT potansiyel olarak , tüm tekil gebeliklerin trizomi 21 ve trizomi 18 açısından taramasında üniversal kullanılabilinir. Günümüzde, yaygın uygulamayı sınırlayıcı esas faktör testin maliyetidir. Am J Obstet Gynecol 2012;207:374.e1-6. Validation of targeted sequencing of single-nucleotide polymorphisms for non-invasive prenatal detection of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y K.H. Nicolaides, A. Syngelaki, M. Gil, V. Atanasova and D. Markova This blinded validation study has demonstrated that cfDNA testing in maternal blood using targeted sequencing of SNPs at chromosomes 13, 18, 21, X and Y and use of the NATUS algorithm holds promise as an accurate method for detecting fetal autosomal aneuplodies, sex chromosome aneuploidies and triploidy in the first trimester of pregnancy. Bu kör doğrulama çalışması, gebeliğin birinci trimestrinde maternal kanda cfDNA testiyle, 13,18,21,X ve Y kromozomlarındaki SNP’lere yönelik hedeflenmiş sekanslama ve NATUS algoritması kullanımının fetal otozomal anöploidileri, seks kromozom anöploidileri ve triplodiyi tespitte, gelecek vaad eden kesin bir metod olduğunu göstermiştir. Prenatal Diagnosis 2013 June, 33(6): 575-579 NIPT DAHA GÜVENLİ PRENATAL TANI 1. NIPT kadınlar için mevcut prenatal test opsiyonları spektrumunu genişletmiştir 2. Tarama sonucunun pozitif olduğu durumda, invaziv tanı testi yerine, NIPT, kadınlar için bir alternatiftir. • T18 and T21 için yüksek sensitivite ve spesifisite. (T13 performansı nispeten daha düşük) NIPT DAHA GÜVENLİ PRENATAL TANI 3. İnvaziv tanı testlerini kabule yanaşmayan kadınlar için, NIPT güven verici ve rahatlatıcı bir seçenektir. 4. NIPT, girişime bağlı riski ortadan kaldırarak kadınların bu tip testleri reddetme ihtimalini düşürür. GELECEK UFUKLAR • Düşük risk popülasyonlarda geniş kapsamlı çalışmalar • Çoğul gebeliklerde çalışmalar • Sub-kromozomal anomalilerin tespiti • cfDNA ve gebelik komplikasyonları • Tek örnekte NIPT + Maternal taşıyıcılık taraması • Genetik sendromların tedavisi (Down v.s) Teşekkürler! Dr İsrael Aruh, Kent hastanesi IVF Ünitesi Direktörü
