FISH ve in situ melezleme

FISH ve in situ melezleme
In situ melezleme belirli bir mRNA’nın doku içinde nerede
bulunduğunu görmemize yarar. Bu metod inceleyenin ilgilendiği
mRNA’nın normal yerini görmesine olanak sağlar.
In situ melezleme oldukca kolay bir tekniktir ve histolojik
dokulardaki hedef mRNA’nın işaretlenmis nükleik asit probuna
hibridizasyonunu sağlayarak dengeli hibridler oluşturur ve böylece
probun yeri görülür.
Bu teknoloji ayrı türlerdeki hücre populasyonlarında gen anlatımı
calısmak için kesin bir metoddur.Çünkü tek bir hücre
çözünürlüğünde hedef mRNA’nın bulunmasına izin verir.
Kullanılan prob tipleri:
DNA probları:
Yüksek spesifik aktivite gösterir.
Prob olarak kullanılmadan önce denatüre edilmelidir.
RNA probları:
RNA-RNA hibridleri en stabil hibridlerdir.
RNA probları düsük stabilite gösterir ve RNaz’larla
kolaylıkla yok edilebilirler.
Oligonükleotid probları (15-50 nükleotid):
Dizi hedef diziye tamamlayıcı olarak tasarlanır.
Problar çok stabildir.
Küçük boyutundan dolayı hedefe kolayca girebilir.
Prob işaretleri
Radyoaktif işaretler
Direkt işaretleme
Radyoaktif olmayan işaretler
Affinity molekül
Direkt işaretleme
Indirekt işaretleme
Marker molekül
Reporter molekül
FISH
Floresan in situ hibridizasyon çoklu, sayı, yapı
ve mikrodelesyon gibi kromozom anomalilerini
saptamak için kullanılan bir metodtur.
Üstünlükleri:
Sonuca hızlı ulaşılılır.
Bütün doku tiplerine uygulanabilir (kan, ilik vb.)
Standart sitogenetik metodlarla saptanamayan
delesyonları saptar.
Olumsuz yönleri:
Standart G-bantlama calışmalarının yerine geçemez fakat
yanında kullanılabilir.
Tüm kromozom için iyi olmasına rağmen sadece birkaç
kromozomal segmentle sınırlıdır.
Bu teknolojide ilk aşama; floresan özelliği taşıyan bir
kimyasalın spesifik DNA dizilerini tanıyabilecek bir
molekülle bağlanmasıdır. Bu işaretli moleküle prob
denir.
Kromozomlar, probun kromozomun üzerinde aranan
DNA dizisine bağlanmasına izin verilecek şekilde
hazırlanırlar. Bu işleme hibridizasyon denir.
Kromozoma bağlı olan işaretli DNA probu
kromozomlar
UV ışığa maruz bırakıldıklarında ışıma
yaparlar. Eğer probda floresan ışıma olursa gen
mevcuttur, floresan ışıma yok ise delesyona
uğramıştır.
Her prob kromozomun belli bir bölgesine özeldir ve floresan
molekülle işaretlenmiştir.
Her mikroskop lamı birçok metafaz içerir.
Her metafaz kromozomun tam bir setinden oluşur ve bu
setin
küçük bir segmenti her bir prob tarafından aranır ve prob
buraya baglanır.
İlk aşama çift iplikli kromozom DNA’sını ve prob
DNA’sını denatüre etmektir.
Böylece prob ve kromozom DNA’sı birbirine
bağlanabilirler.
Bu işlem DNA’nın yüksek sıcaklıkta ısınmasıyla
gerçekleşir
Prop lam üzerine konulduktan sonra üstüne
buharlaşmayı engellemek için lamel örtülür ve lamelin
kenarlari iyice kapatılır.Lamel 37 c lik inkubatore
koyulur ve bir gece boyunca bekletilir. Böylece prob
hedef kromozomla hibridize olur.
Gece boyunca prob DNA spesifik kromozom
üzerinde hedef diziyi arar ve ona yapışır.
This image shows a paint of chromosome 22.
In addition to the two normal copies
of 22, there is also a small extra piece, a marker,
derived from 22 material.
Spektral Karyotipleme
Herbiri 5 florokromun farklı kombinasyonlarıyla
hazırlanmış probların 24 kromozomla
hibridizasyonuna ve tek bir filtreye sahip floresan
mikroskobu ile analizine dayalıdır.
M-FISH (Multicolor FISH)
5 florokromun çeşitli kombinasyonlarıyla
hazırlanmış probların hibridizasyonu ve farklı
flouresans sinyalleri ile analizine dayalı bir
yöntemdir.
M-band
COBRA-FISH
Diğer FISH yöntemlerine benzer. Ancak 4 florokrom
kullanılır. 24 kromozomun 12si bir gruba diğer 12si
diğer gruba ayrılır. İlk grup 3 florokromla
hibridleştirilirken, 2. gruba ek olarak dördüncü florokrom
uygulanır.
R x FISH
Gibbon kromozomları prob olarak kullanılır. Gibbon
ve insan kromozomlarının homolojisi yaklaşık % 98
dir. RxFISH ile yalnızca kromozom arası parça
değişimleri değil, aynı zamanda kormozom içi
değişimler de belirlenebilmektedir. (delesyon,
inversiyon).
Cosmid prob
Cosmid (unique sequence) prob, belli kromozomların
spesifik küçük segmentlerine bağlanır. Bu problar bir
kromozomun bir bölgesinin varlığı veya yokluğunun
belli bir sendrom veya anomalinin tanısını
kolaylaştıracağı mikrodelesyon calışmaları için
uygundur.
Elastin Williams Syndrome probe
Alfa satellit probları
Alfa satellit DNA insan kromozom sentromerlerinin
yanında bulunan yüksek tekrarlı dizileri karsılastırmaya
olanak sağlar. Bu tür problar anoploidileri tanımlamak
ve küçük marker kromozomlarının kökenini teşhis
etmek için kullanılır.
Painting probes
Gerçekte bir sürü ayrı bölgeye özel problardır
yanlızca tek bir kromozoma bağlanırlar ve hep
beraber bütün kromozomu boyuyor gibi bir
görüntü yaratırlar.
Karşılaştırmalı genomik hibridasyon
CGH floresan moleküler sitogenetik bir tekniktir ve DNA
kayıplarını, amplifikasyonlarını normal metafaz
kromozomlarında gösterir.
CGH niceliksel 2 renk floresan in situ hibridizasyonuna
dayanır.Eşit miktardaki farklı işaretlenmiş tumör genomik
DNA ve normal referans DNA’sı karıştırılır ve hibridize
edilir.Işaretlenmiş problar iki farklı floresan ile belirlenir.
Referans metafaz alanındaki kromozomlar boyunca
floresan yoğunluklarındaki farklılıklar, tumor DNA’daki
kopya numara değişikliklerine karşilik gelir.
CGH tümör genomlarındaki kromozomal kopya
numarası değişikliklerini incelemek için güçlü bir
tekniktir ve tek bir deneyde tüm genomları analiz
etmesi gibi bir avantaja sahiptir.
Özellikle Sitogenetik analiz için yeterli metafaz
vermeyen tümörlerin incelenmesi için kullanılabilir ve
donmuş veya taze dokulara uygulanabilir.
Exon-array CGH
Kromogenik in situ hibridizasyon (CISH)
CISH pratik, etkili ve FISH’a alternatif bir metodtur.
FISH ile karşılaştırıldığında üç önemli avantajı vardır:
1) Parafin bölgelerin histolojik ayrıntıları aydınlık alanda
genellikle daha iyi gözlenir.
2) Morfolojik ayrıntılar düşük güçlü mercekle kolaylıkla
görülebilir.
3) Prob sinyalleri hızlı solmazlar.
GISH (Genomik in situ Hibridizasyon)
Türler arası hibritlerde, parental genomların
ayrılmasına olanak tanıyan genomik boyama
tekniğidir.
Uygulama alanı genellikle hibritlerdeki
ebeveynlerin kromozom analizidir.
Başarılı çaprazların belirlenmesi açısından çok
önemlidir.
L. multiflorum ve F. pratensis
Genomic in situ-hybridization : on the left hand parental genome components of D. viminea
(green) in the genome of D. muralis (blue); on the right hand parental genome components
of D. tenuifolia (pink) in the genome of D. muralis (blue