(CCl4) VE - Gazi Üniversitesi Açık Arşiv

T.C.
GAZĠ ÜNĠVERSĠTESĠ
SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
TIBBĠ BĠYOKĠMYA ANA BĠLĠM DALI
KARBON TETRAKLORÜR (CCl4) VERİLEN RAT KALP
DOKULARINDA OKSİDAN / ANTİOKSİDAN SİSTEMLERİN
ARAŞTIRILMASI
DOKTORA TEZĠ
DR. TÜLAY ŞAHİN
Tez DanıĢmanı
PROF. DR. HATĠCE PAġAOĞLU
ANKARA
Haziran 2011
İÇİNDEKİLER
Kabul ve Onay……………………………………………………………………I
İçindekiler……………………………………………………………………..…II
Şekiller, Grafikler……………………………..…………………………..…...V
Tablolar, Resimler ……………………………………………………..……..VI
Semboller ve Kısaltmalar……....…………………………….…………..…VII
1. GİRİŞ…………………………………………………………………………..1
2. GENEL BİLGİLER…………………………………………………………...4
2.1. Karbon tetraklorür..……………………...…………………………..4
2.1.1. Karbon Tetraklorürün Organizmaya Olan Etkileri…………...5
2.1.2. CCI4 Toksisitesi…………………………………………………6
2.1.2.1. Hepatik Etkileri ..………………………………………….8
2.1.2.2. Kardiyovasküler Etkileri…………………………………..8
2.1.2.3. Gastrointestinal Sistem Etkileri…………………………..9
2.1.2.4. Nörolojik Etkileri……………………………………………9
2.1.2.5. Genitoüriner Sistem Etkileri………………………………9
2.1.2.6. Hematolojik Sistem Etkileri……………………………....9
2.1.2.7. Dermatolojik Etkileri……………………………………….9
2.2. Kalp Anatomisi .…………………………………………………....10
2.2.1. Kalp Duvarının Yapısı………………………………………...11
2.2.2. Kalbin BoĢlukları ve Kan AkıĢı……………………………….13
2.2.3. Kalbe Gelen ve Kalpten Çıkan Büyük Damarlar………......15
2.2.4. Kalbin ÇalıĢması...………………………………………........16
2.2.5. Kalpte Uyarı Merkezleri……...……………..........................17
2.2.6. Büyük ve Küçük DolaĢım ……………………………………17
2.2.7. Kalbin Kan Ġhtiyacının Sağlanması………………………….17
2.3. Oksidatif Stres ve Serbest Radikaller……………………...…….18
2.3.1. Serbest Radikal Kaynakları…………………………………..20
2.3.2. Serbest Radikal Türevleri………………………………...…..25
2.3.2.1. Süperoksit Radikali (O2˙-)………………….………...….26
ii
2.3.2.2. Hidroksil Radikali (OH˙)………….…………………..….28
2.3.2.3. Hidrojen Peroksit (H2O2)………….………………...…..30
2.3.2.4. Hipoklorik Asit (HOCl)…………….……………………..32
2.3.2.5. Singlet Oksijen (1O2)…………...…….…………….……32
2.3.2.6. Perhidroksil Radikali (OOH˙)…………….……………..33
2.3.2.7. Peroksil Radikali (ROO˙)…..……….……….……….....33
2.3.2.8. Nitrik Oksit (NO˙)…………………..…………….……....34
2.3.2.9. Peroksinitrit (ONOO )………………………………..….35
2.3.3. Serbest Radikallerle OluĢan Lipit Peroksidasyonu………36
2.3.4. Serbest Radikallerle OluĢan Protein Oksidasyonu……....40
2.3.5. Serbest Radikallerle OluĢan Karbonhidrat Oksidasyonu..43
2.3.6. Serbest Radikallerin Nükleik Asit ve DNA‘a Etkileri……….43
2.4. Serbest Oksijen Radikallerine KarĢı Savunma
Mekanizmaları……………………...……………………………………44
2.4.1. Antioksidan Etki Tipleri…………………………………....….44
2.4.2. Nonenzimatik Yapıda Olan Antioksidanlar……..………….47
2.4.2.1. Glutatyon (GSH)…………………………………………47
2.4.3. Enzimatik Yapıda Olan Antioksidanlar……………….……49
2.4.3.1. Süperoksit Dismutaz (SOD; EC 1.15.1.1)………..…...49
2.4.3.2. Glutatyon Peroksidaz (GSH-Px; EC.1.11.1.9) ve
Glutatyon Redüktaz (GR; EC.1.6.4.2)…………….…..50
2.4.3.3. Glutatyon-S-Transferaz (GST; EC 2.5.1.8)….…….….52
2.4.3.4. Katalaz (CAT; EC .1.11.1.6)……………….…….…..…53
2.4.3.5. Glukoz 6 Fosfat Dehidrogenaz…………………………53
3. MATERYAL VE YÖNTEM…………………………………………………55
3.1. Deney Grupları………………………………………..……..…......55
3.1.1. Deney Hayvanlarının Hazırlanması………………..….…...55
3.2. Kullanılan Aletler………………………………..…………...……..56
3.3. Yöntemlerin Uygulanması………………………….……………..57
3.3.1. Lowry Protein Tayini (Doku protein tayini)…………………57
3.3.2. Kalp Dokusu Malondialdehit (MDA) Analizi…………….....59
iii
3.3.3. Kalp Dokusunda Glutatyon ( GSH ) Düzeyi Tayini….…...61
3.3.4.
Kalp
Dokusunda
Glutatyon
Peroksidaz
(GSH-Px)
Aktivitesinin Ölçümü…………………………………………………………63
3.3.5. Kalp Dokularında Glutatyon-S-Transferaz Aktivitesinin
Ölçümü…………………………………………………………64
3.3.6. Kalp Dokusunda Katalaz Aktivitesi Ölçümü……………….66
3.3.7. Kalp Dokusunda Süperoksit Dismutaz (SOD) Ölçümü…..67
3.3. Ġstatistiksel Değerlendirme……...…………………………………69
4. BULGULAR…………………………………………………………………71
4.1. Kalp Dokusu MDA Düzeyleri…………………………………..…72
4.2. Kalp Dokusu Glutatyon Düzeyleri…………………..…………….73
4.3. Kalp Dokusu Glutatyon Peroksidaz Aktivitesi…………...………74
4.4. Kalp Dokusu Glutatyon-S-Transferaz Aktivitesi…………..…….75
4.5. Kalp Dokusu Katalaz Aktivitesi……………..……………….….…76
4.6. Kalp Dokusu SOD Aktivitesi………………..………………..……77
4.7. Spearman Korelasyon Analizi………………….…………….…..78
4.8. Histopatolojik Bulgular………………….……………………..…..85
4.8.1.Ġmmünhistokimyasal Yöntem………..…………………...…..85
5. TARTIŞMA ve SONUÇ……………………………………………………93
6. ÖZET………………………………………………………………………..108
7. SUMMARY………………………………………………...……………….111
8. KAYNAKLAR……………………………………………………………...114
9. ÖZGEÇMİŞ………………………………………………………...………132
10. TEŞEKKÜR……………………………………………………………...133
11.ETİK KURUL RAPORU………………………………………………...134
iv
Şekil Listesi
ġekil 1 .Kalp anatomisi …………………………….………………………..10
ġekil 2.Kalbin boĢlukları………………………..………..……………………14
ġekil 3. Kalbe gelen ve çıkan damarlar……………………….………….…15
ġekil 4. Oksidatif Stres ……………….………………………..………….….19
ġekil 5. Memeli hücrelerinde reaktif oksijen ve reaktif nitrojen türlerinin
meydana geliĢi………………………………………………………..26
ġekil 6. ROS ve RNS‘nin birbirleriyle etkileĢimi………………...…………..36
ġekil 7. Metallerin katalizlediği lipit peroksidasyonu………….……………37
ġekil 8. Lipit peroksidasyonu ile oluĢan aldehitler………….………..……..38
ġekil 9. Metallerin katalizlediği bölge spesifik protein oksidasyonu…...…42
ġekil 10. Memeli Hücrelerinde Antioksidan Sistem………………….…….47
ġekil 11. Glutatyon peroksidaz ve glutatyon redüktazın katalizlediği
reaksiyon…………………………………………………………….51
Grafik Listesi
Grafik1. Doku Protein Standart Grafiği…………...………………………….58
Grafik 2. Doku MDA Standart Grafiği………………………………………..61
Grafik 3. Doku Glutatyon Standart Grafiği………………...………………...62
Grafik 4. Kalp MDA (nmol/g doku) Düzeyleri……………….……………….72
Grafik 5. Kalp Glutatyon (nmol GSH/mg protein) Düzeyleri………….…..73
Grafik 6. Kalp Glutatyon Peroksidaz Aktivite (IU/mg protein) Düzeyleri…72
Grafik 7. Kalp Glutatyon-S-Transferaz Aktivitesi….…………….…….…....75
Grafik 8. Kalp Katalaz Aktivitesi ………………………...…………………...76
Grafik 9. Kalp SOD Aktivitesi …………………………………………….…..77
Grafik 10: Doku MDA düzeyleri ile doku GSH-Px aktivitesi arasındaki
korelasyon………………………………………………………………………79
Grafik 11: Doku MDA düzeyleri ile doku SOD aktivitesi arasındaki
korelasyon………………………………………………………….…………..80
Grafik 12: Doku GSH düzeyleri ile doku SOD aktivitesi arasındaki
korelasyon …………………………………………………………….………..81
v
Grafik 13: : Doku GSH-Px aktivitesi ile doku Katalaz aktivitesi arasındaki
korelasyon …………………………………………………………………......82
Grafik 14: Doku GSH-Px düzeyleri ile doku SOD aktivitesi arasındaki
korelasyon…………………………………………………………………..…..83
Grafik 15: Doku GST düzeyleri ile doku Katalaz aktivitesi arasındaki
korelasyon………………………………………………………………...…….84
Tablo Listesi
Tablo 1. Doku Protein Tayini……………………….…………………………58
Tablo 2. Doku MDA Tayini………………………….………………………...60
Tablo 3. Doku Glutatyon Tayini………………………………………………62
Tablo 4. Doku GSH-Px Aktivitesi Tayini……………………….……………64
Tablo 5. Doku GST Aktivitesi Tayini…………………………………………65
Tablo 6. Doku Katalaz Aktivitesi Tayini…………………..………………….67
Tablo 7. Doku SOD Aktivitesi Tayini………………………….……………...69
Tablo 8. Kalp dokusu MDA ve GSH düzeyleri ile SOD, GSH-Px, GST ve
Katalaz enzim aktiviteleri istatistik sonuçları…………….………71
Tablo 9. Kalp MDA Düzeyleri………………..……………………………..…72
Tablo 10. Kalp Glutatyon Düzeyleri…..…………………………………..….73
Tablo 11. Kalp GSH-Px Aktivitesi…………………………….………….…..74
Tablo 12. Kalp GST Aktivitesi……………………………….………………..75
Tablo 13. Kalp Katalaz Aktivitesi……………………………….…………….76
Tablo 14. Kalp SOD Aktivitesi……………………………………..………….77
Tablo 15. Spearman Korelasyon Analizi Sonuçları…………………….…..78
Resim Listesi
Resim 1: Kontrol grubuna ait kalp kası dokusu enine kesiti ………..…….88
Resim 2: CCl 4 grubuna ait kesit……………………………………………..89
Resim 3: CCl4 grubuna ait kesit………………….…………………………..90
Resim 4:Kontrol grubuna ait caspase-3 immünoreaktivitesi……………..91
Resim 5: CCl4 grubuna ait caspase-3 immünoreaktivitesi……………….92
vi
Semboller ve Kısaltmalar
MDA :
Malondialdehit
SOD :
Süperoksit Dismutaz
GSH :
Redükte Glutatyon
CAT :
Katalaz
GSH-Px :
Glutatyon Peroksidaz
GST :
Glutatyon-S-Transferaz
GSSG :
Okside glutatyon
CCl4 :
Karbontetraklorür
CCl3 ˙:
Triklorometil radikali
OH˙ :
Hidroksil radikali
O2˙ :
Süperoksit radikali
H2O2 :
Hidrojen peroksit
NO˙ :
Nitrik Oksit
NOS :
Nitrik Oksit Sentaz
NO2˙ :
Nitrojen Dioksit Radikali
ONOO :
Peroksinitrit
HOCI :
Hipoklorik Asit
OOH˙ :
Perhidroksil radikali
FAD :
Flavin Adenin Dinükleotid
FMN :
Flavin Mononükleotit
MPO :
Myeloperoksidaz
ROO˙ :
Peroksit Radikali
RO˙ :
Alkoksil Radikal
1
O2 :
Singlet Oksijen
IP :
Ġntraperitoneal
mM :
Milimolar
μmol :
Mikromol
IU :
Ġnternasyonal Ünite
vii
1. GİRİŞ
Kalp, damarlar içinde kapalı bir sistem halinde bulunan kanı,
homeostazın sağlanması için tüm vücuda pompalayan organdır. Kalbin
temel fonksiyonu;
1. OksijenlenmiĢ kanı arteriyal sisteme ve hücrelere pompalamak
2. Kirli kanı venöz sistem aracılığı ile toplayarak yeniden
temizlenmek ve oksijenlenmek üzere akciğerlere göndermektir.
Kalp; normal bir insan uyku halindeyken günde 8-14 bin
litreden fazla kan pompalar. Hayatın devamının sağlanmasında durmadan
çalıĢması Ģart olan kalp kasının bu görevi yerine getirebilmesi için yüksek
metabolik ihtiyacının karĢılanması gerekir. Kalp, enerji ihtiyacı açısından
beyinden sonra en fazla enerjiye ihtiyaç duyan organdır.1
Oksidatif stresin birçok hastalığın patolojisinin baĢlamasında
ve ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Miyokard enfarktüsü
gibi kardiyolojik hastalıklar, nörolojik hastalıklar, astım, diabetes mellitus,
romatoid artrit gibi romatolojik hastalıklar, kanser ve yaĢlanma dahil birçok
hastalığın oksidatif stresle iliĢkisi gösterilmiĢtir.2-7
Ġlaç ve ksenobiotiklerin zehirlemesi veya iyonize radyasyon
gibi çeĢitli faktörler tarafından, oksidatif stres ve serbest radikallerin üretimi
artar.Tiyobarbütirik
reaktif
madde
konsantrasyonlarının
artması
ve
antioksidan enzim mekanizmasında defekt olması, bu dokularda oksidatif
stres parametrelerinin görülmesine neden olur.8
Karbon tetraklorür ( CCl4 ) deneysel olarak karaciğer hasarı
oluĢturulmasında yaygın kullanılan bir ksenobiyotiktir.9,10
1
CCl4 ile deneysel olarak oluĢturulan intoksikasyondan ve
sirozdan pekçok organ ( karaciğer, dalak, pankreas, timus, lenf düğümleri,
akciğerler,
kalp)
ile
sistem
doğrudan
veya
dolaylı
bir
Ģekilde
etkilenmektedir.
Oksidatif stres, pro-oksidan (reaktif oksijen türleri ve reaktif
nitrojen türleri) ile antioksidan savunma sistemi arasındaki hassas
dengenin, pro-oksidan ve oksidan maddelerin lehine kayması olarak
tanımlanmaktadır.11
Serbest radikaller; dıĢ orbitallerinde ortaklanmamıĢ veya
çiftleĢmemiĢ elektron taĢıyan, yüklü veya yüksüz, atom veya moleküllerdir.
Serbest
radikaller; organizmada
normal metabolik yolların
iĢleyiĢi
sırasında meydana gelebildikleri gibi, dıĢ etkenlerle de oluĢabilirler.
Biyolojik sistemlerde bulunan serbest radikallerin baĢlıcaları; süperoksit
anyonu (O2˙-), hidrojen peroksit (H2O2) ve hidroksil (OH˙) radikalleridir.
YaĢam süreleri çok kısa, ancak yapılarındaki dengesizlik nedeniyle çok
aktif olan bu bileĢikler tüm hücre bileĢenleri ile etkileĢebilme özelliğine
sahiptirler. Serbest radikaller lipit peroksidasyonunu tetikleyerek oksidatif
stresi arttırır.12-17
Canlılarda serbest radikallerin hasarını önleyen, sınırlayan
veya kısmen onaran antioksidan mekanizmalar mevcuttur. Hücre dıĢında
ve hücrede farklı organellerde yerleĢerek savunma mekanizmasında rol
alan antioksidanlar; enzimatik yapıda olabilecekleri gibi non enzimatik
yapıda da olabilirler.18
ÇalıĢmamızda
karbon
tetraklorür
verilen
ratların
dokularında lipit peroksidasyon ürünü olan malondialdehit
kalp
(MDA)
düzeylerini ölçtük. Bunun yanında karbon tetraklorürün oksidan özelliğini
incelemek için, enzimatik ve non-enzimatik antioksidan sistem üzerinde
2
araĢtırmalar yaptık. Kalp dokularında glutatyon
(GSH) düzeylerini,
glutatyon peroksidaz (GSH-Px), glutatyon-s- transferaz (GST), katalaz
(CAT) ve süperoksit dismutaz (SOD) enzim aktivitelerini ölçtük. Ayrıca
histopatolojik ve immünhistokimyasal boyama teknikleriyle de hücresel
boyuttaki değiĢiklikleri değerlendirdik.
3
2. GENEL BİLGİLER:
2.1. Karbon tetraklorür:
Moleküler
formülü
CCl4
olan
karbon
tetraklorürün;
karakteristik bir kesif kokusu vardır. Ksenobiyotik olan karbon tetraklorür
(CCI4)
renksiz, berrak, akıcı, yoğun, yanıcı olmayan, iletken olmayan
uçucu bir sıvıdır.19,20
CCl4 -23°C‘de
katılaĢır
ve
kaynama
sıcaklığı
77°C‘dir.
3
Yoğunluğu 1,585 g/cm olan CCI4‘ ün moleküler yapısı düzgün tetraedron
olup merkezinde karbon atomu bulunur. Apolar yapıya sahiptir, suda
çözünmez. Fakat alkol gibi apolar çözücülerde çözünür. CCl 4 deneysel
olarak
karaciğer
ksenobiyotiktir.
hasarı
9,10,21,22
oluĢturulmasında
yaygın
kullanılan
bir
Ġyi yağ temizleyici olduğu için, eskiden kuru
temizlemede kullanılırdı. Önceleri yangın söndürme, tahıl dezenfeksiyonu
ve böceklerle mücadelede yararlanılan bu kimyasal bileĢik; günümüzde
petrol ürünleri, çeĢitli yağlar, vernik, cila, reçine çözücüsü ve organik
bileĢiklerin imalatında kullanılmaktadır.20,23
CCI4 sanayi çözücüsü ve yağ giderici diğer maddelerin elde
edilmesinde ara maddesi olarak geniĢ ölçüde kullanılır. Tahılların
buharlanmasında ve böcek öldürücü olarak da ziraatta kullanılır. CCI4
yangın söndürücü olarak da kullanılıyordu. Isınma sonucu meydana gelen
karbon tetraklorürün buharının yoğunluğu havanın yoğunluğunun yaklaĢık
5,3 katı olduğundan, yanan madde ile havanın irtibatını keser. Fakat buhar
alev sıcaklığında hidrolize olarak zehirli fosfeni (COCl2) meydana
getirdiğinden
artık
yangın
söndürmede
kullanılmamaktadır.
Ġletken
olmadığından elektrik yangınlarında emniyetle kullanılabilir.
Karbon tetraklorür zehirli olup, hava içinde bulunan milyonda
25 nisbetindeki buharı zehirlemeye yeterlidir. Çevreden insan vücuduna
günlük ortalama 0,1µg CCI4 giriĢi olduğu tahmin edilmektedir.20 BirleĢik
4
Devletler Çevre Koruma Dairesi(EPA) hayvan deneylerinden elde edilen
sonuçlara dayanarak CCI4‘ü insan için olası kanserojen sınıfına(Grup B2)
dahil edilmiĢtir.20,23
CCl4 demir varlığında karbondisülfitin klorin ile karĢılıklı
etkileĢimi ile yani hidrokarbonların klorlanması ile elde edilir.19
CS2 + 3Cl2 ® CCl4 + S2Cl2
Elde edilen ürünler birbirinden fraksiyonlu destilasyon ile
ayrılır. S2Cl2 tekrar karbon sülfür ile reaksiyona sokulur:
2 S2Cl2 + CS2 ® CCl4 + 6S
CCI4 solunan hava, su, gıda alımı ve deriden temas yoluyla
vücuda girer. Karaciğer, beyin, böbrek, kaslar, yağ dokusu ve kanda daha
yüksek konsantrasyonlarda olmak üzere tüm dokulara dağılır.
20,24,25
Vücuttan atılımı baĢta solunum yoluyla ve çok az miktarda
dıĢkı ve idrar yoluyladır.
2.1.1. Karbon Tetraklorürün Organizmaya Olan Etkileri:
CCI4 tipik bir toksik ajandır ve toksik etkisi serbest radikal
üretimi ile olmaktadır.CCI4 yağda çözünebildiği için hücre membranından
geçebilir. CCI4 verildiğinde karaciğer, böbrek, kalp dokusu gibi organlara
dağılır ve depo edilir. CCI4‘ün alım ve eliminasyon süresi dokudaki yağ
oranına ve dokudaki kan perfüzyonuna bağlıdır. Beyin ve karaciğer
tarafından hızla alınır.
26
CCI4 ‗den karaciğerde sitokrom P450 aktivasyonu
ile triklorometil (CCI3-) radikali oluĢur. Bu da, hemen hücre zarı ile
reaksiyona girer. 27
5
P450
→ CCl3∙ + Cl –
CCl4
CCl3∙ + O2 → CCl3O2 ∙
DoymamıĢ yağ asitleri ile kovalent bağ oluĢturarak oksijen
varlığında hızla triklorometil peroksite ( CCI3O2- ) veya hidrojen atomlarını
kaybetmiĢ olan kloroform formuna dönüĢür.28,29 Bu radikaller çoklu
doymamıĢ yağ asitlerinden hidrojen alarak lipit peroksidasyon zincirini
baĢlatırlar. Lipit peroksidasyonu biyolojik membranların yapısını dramatik
olarak değiĢtirir, hastalıkların patogenezinde rol oynayan Ģiddetli hücre
hasarına neden olur.30,31
Reaktif
oksijen
radikalleri
Alzheimer,
multiple
skleroz,
diyabet, karaciğer sirozu ve hepatosellüler karsinomanın patogenezinden
sorumlu tutulmaktadır.
32-34
CCI4‘ün deneysel çalıĢmalarda inhalasyon
yoluyla verilmesinin, oral verilmesine göre daha toksik etkili olduğu
gösterilmiĢtir. Çünkü CCI4 ‗ün vücut içine giriĢinde asıl ana yol
inhalasyondur.35,36 Deneysel çalıĢmalarda CCI4 ‗ün intraperitoneal olarak
verilmesiyle oluĢan %50-60‘lık mortalite oranı, subkutan olarak verildiğinde
%20‘lere kadar inebilir. 35
2.1.2. CCI4 Toksisitesi:
CCI4 ‗ün toksisitesi ölüme neden olduğu için 1970‘de evde
kullanımı, 1985‘de de tütsü olarak çiftliklerde kullanımı yasaklandı. Deri,
sindirim ve inhalasyon yolu ile absorbe edilerek toksik etki gösterir.
CCI4 karaciğerde sitokrom P450 tarafından triklorometil
(CCI3˙) serbest radikaline dönüĢtürülür;
6
Sitokrom P450
CCl3.- + Cl –
CCl4
Triklorometil radikali çok aktif olup, CCI4‘ün karaciğerde
özellikle sentrolobüler bölgede neden olduğu nekrozdan sorumludur.
Triklorometil radikali, makromoleküllerle dayanıklı bileĢikler oluĢturduğu
gibi oksijenle de birleĢerek triklorometilperoksi ( CCI3О2-) radikali meydana
gelir. Bu radikal kuvvetli bir lipit peroksidasyonu baĢlatıcısıdır.
CCl3.- + O2
CCl3O2.-
Bu Ģekilde reaktif serbest radikal üretimi,
karaciğerde
antioksidan sistemleri aĢar. GeliĢen lipit peroksidasyonu çok zararlı bir
zincir reaksiyonudur. Direkt olarak membran yapısına, indirekt olarak
reaktif aldehitler üretmek suretiyle diğer hücre bileĢenlerine zarar verir.
Sonuç olarak hücresel membranların oksidatif yıkımı ve ciddi doku hasarı
baĢlar.
27,38,39,41,42
CCl4 ‗e bağlı karaciğer hasarında meydana gelen lipit
peroksidasyonu oldukça önemlidir.43,44 Çünkü lipit peroksidasyonuna bağlı
hasar sonunda karaciğerde fibrozis ve siroz oluĢabilir. Karaciğer fibrozisi;
ekstrasellüler
matriks
komponentlerinin
artması
ile
karakterizedir.
Ekstrasellüler matriksin yapımı ve yıkımı arasındaki denge; oluĢan toksik
oksijen radikallerine bağlı olarak, potent profibrojenik mediatörlerin de
aktive olması ile sürekli matriks yapımı yönünde bozulmaktadır.45
7
2.1.2.1. Hepatik Etkileri:
Akut CCI4 zehirlenmesinden ölümün en sık nedeni akut
karaciğer yetmezliğidir.
Hepatik zarar deri maruziyetinden sonra bile çıkabilir.
Karaciğer hasarının; oksidatif stres ve bunu takiben ortaya çıkan serbest
radikallerle oluĢtuğu bilinmektedir. Toksik oksi ve hidroksi radikallerinin lipit
peroksidasyonu
hasarlayabilecekleri
ve
baĢka
invivo
/
yollarla
invitro
hepatosit
ortamlarda
membranını
deneysel
olarak
gösterilmiĢtir.46,47
CCl4 e bağlı karaciğer hasarında meydana gelen lipit
peroksidasyonu oldukça önemlidir.43,44 Çünkü bu hasara bağlı olarak
ilerleyen süreç sonunda karaciğer fibrozisi ve siroz oluĢabilir.
Hepatotoksisitenin
alıĢılageldik
belirtileri;
karaciğerde
büyüme, asit, sarılık, AST/ALT enzimlerinin, bilurubin ve diğer karaciğer
laboratuvar ölçümlerinin
artmasıdır.
Yağlı karaciğer dejenerasyonu
muhtemeldir. Kronik etanol kullanımı CCI4 ‗ün toksik etkisini daha çok
artırır.19
2.1.2.2. Kardiyovasküler Etkileri:
Zehirlenmeye bağlı olarak hipotansiyon, ventriküler disritmi,
kalp kasının deprese olması, kalp kasının yağlı dejenerasyonu , yavaĢ
veya düzensiz nabız görülebilir. Ventriküler fibrilasyona bağlı ani ölümler
olabilir. Bunun nedeni de; katekolaminlerin miyokadiyumdaki eĢik
değerlerinin düĢmüĢ olmasıdır. 19
8
2.1.2.3. Gastrointestinal Sistem Etkileri:
CCI4 ‗ün ağız yoluyla alınmasını takiben oluĢan zehirlenmeye
bağlı olarak bulantı, kusma, hematemez, abdominal ağrı ve diyare
meydana gelir. Bu etkiler CCI4 ‗e deri maruziyetinden sonra bile meydana
gelebilir.19
2.1.2.4. Nörolojik Etkileri:
CCI4 yüksek konsantrasyonda santral sinir sistemini deprese
edebilir. Eğer kosantrasyon yeterince yüksek değilse bilinç kaybı, baĢ
dönmesi, yorgunluk, vertigo, baĢ ağrısı, duygu durum değiĢiklikleri,
depresyon, mental konfüzyon veya nöbet geçirme, koma, amnezi, tutarsız
konuĢma, ataksi, istemdıĢı titreme ve rhmberg bulgusu pozitif olabilir.19
2.1.2.5. Genitoüriner Sistem Etkileri:
Ġnsanların CCI4 ile zehirlenmesinde çoğunlukla görülen akut
böbrek yetmezliğidir. Akut böbrek yetmezliği derinin maruziyetinden sonra
bile oluĢabilir. Önce poliüri, sonra oligüri, azotemi, üremi
geliĢebilir.
19
Hematüri ve proteinüri yaygındır .
2.1.2.6. Hematolojik Sistem Etkileri:
Aplastik anemiye neden olabilir. 19
2.1.2.7. Dermatolojik Etkileri:
Eritem ve arasıra vezikül geliĢebilir. Yağsız deriye neden
olarak dermatit geliĢir.
9
CCI4 yukarıda belirttiğimiz etkileri dıĢında; gaz ya da sıvı
CCI4 göz irritasyonu, konjuktivit, bulanık görme, optik sinirde hasar
yapabilir. CCI4 iĢitme kaybına neden olabilir. Yüksek konsantrasyonlarda
inhalasyonla alındığı zaman alveolitis ve pulmoner ödeme neden olabilir.
Asit-baz dengesi üzerine etki ederek metabolik asidoz geliĢtirir. 19
2.2. Kalp Anatomisi
Kalp, kan dolaĢımını sağlayan ve pompa vazifesi gören,
kastan yapılmıĢ koni Ģeklinde bir organdır.48
Kalp
vücudumuzdaki
kanın
dolaĢımını
sağlayan
organımızdır. Kalp kanı vücuda dağıtır, vücuda dağılmıĢ olan kanı
topladıktan sonra akciğerlere gönderir. Akciğerlerde oksijenlenen kanı
aldıktan sonra tekrar bütün vücuda dağıtır. Bu dolaĢımın sonucu bütün
doku ve hücrelere besin ve oksijen gider. Metabolizmanın sonucu oluĢan
artıklar doku aralarından alınıp böbreğin de devreye girmesi ile vücuttan
atılır. Bu dolaĢımın sonucunda yaĢamımız devam eder.(ġekil 1)
Şekil 1:Kalp anatomisi
( www. trialsightmedia.com)
10
Kalbin temel fonksiyonu;
1. OksijenlenmiĢ kanı, arteriyal sisteme ve hücrelere pompalamak.
2. Kirli kanı venöz sistem aracılığı ile toplayarak yeniden temizlenmek ve
oksijenlenmek üzere akciğerlere göndermektir.
Kalbin yapısı ters çevrilmiĢ fakat oblik durumda koni
Ģeklindedir. Apex denilen tepe kısmı aĢağıda, basis denilen tabanı ise
aĢağıdadır. Kalp, göğüs boĢluğunun merkezinde, iki akciğer arasında
pericard (pericardium) denilen torbanın içinde yer alır. Kalp; orta hatta
göre (sternuma göre) 2/3 solda, 1/3 sağda bulunur. AĢağıya, öne ve sola
doğru bakan apex kısmı 5.-6. kaburgalar arasında ve orta hattın 9cm
kadar solunda yer alır. Üste olan basis (taban) kısmına büyük damarlar
girer ve çıkar.1
Ağırlığı insan vücudunun ağırlığına göre değiĢmekle birlikte
kadınlarda 250-300gr, erkeklerde 300-350gr‘dır.Serbest duvar kalınlığı
sağ ventrikülde 0,3-0,5cm ve sol ventrikülde 1,3 ve 1,5 cm‘dir.49
2.2.1. Kalp Duvarının Yapısı:
Kalp duvarı üç tabakadan meydana gelmiĢtir.Bu tabakalar
dıĢtan içe doğru perikard(pericardium), miyokard (myocardium) ve
endokard (endocardium)‘ dır.
Perikard; elastik liflerden zengin bağ dokusundan oluĢan
seröz bir zardır. Mezotel hücreleri ile döĢelidir. Perikard iki yapraktan
oluĢur.
A) Visseral yaprak(epikard) kalbin ve büyük damarların kök
kısımlarının üzerlerini örter ve bunlara sıkıca yapıĢıktır.
11
B) Paryetal perikard, diyafragmanın santral tendonu sıkıca
yapıĢarak önden sternuma ve arkadan mediastinal dokulara yapıĢıklık
gösterir.49
Miyokard; kalbin pompa gibi çalıĢmasına imkan veren özel
kas tabakasıdır. Kalp kası da denilen miyokard kardiak iskeleti oluĢturan
bir fibröz halkaya (fibröz üçgen) bağlanan üç spiral tabakaya sahiptir.
Spiral, kanın odacıklardan sıkıĢtırılmasında en önemli düzenlemedir.
Ġsteğimiz dıĢında çalıĢan kalp kası spontan ritmik kasılma ve impuls
üretme ve iletme özelliğine sahiptir. 1
Kalbin fonksiyonu kalp kasına (miyokard) bağlıdır. Dallanan
ve anastomoz yapan çizgili kas hücrelerinden(kardiyak myosit) oluĢur.
Kalbin kas tabakası atrium oluĢturarak uzanır. At nalı Ģeklinde atriumların
tavanında önden arkaya doğru ilerler. Bu lifler venlerin açılma yeri
çevresinde
sirküler
olarak
yerleĢir.
Ventriküllerin
özellikle
de
sol
ventrikülün kas tabakası çok kalın ve daha fazla katlıdır. Yüzeyel
tabakadaki kas lifleri sağdan sola, tabandan tepeye doğru spiral demetler
oluĢturur. Ortadaki sirküler kas lifleri en içdeki uzunlamasına (longitudinal)
kas liflerini oluĢturur. DıĢdaki kat her iki ventrikülü birden sararken sirküler
kas liflerinin dıĢ tabakası da her iki ventrikülü birden sarar. Derindeki
sirküler lifler ise her iki ventrikülü ayrı ayrı sarar.49
Kardiyak myositlerin beĢ temel komponenti bulunur. Bunlar;
1.
Hücre membranı(Sarkolemma)
2.
Sarkoplazmik retikulum
3.
Kontraktil elementler
4.
Mitokondri
(
kardiyak
myositlerde
çizgili
iskelet
kasından daha fazla mitokondri bulunur ). Hücre volümüne göre oranı
12
aerobik solunum nedeniyle mitokondri kardiyak miyositte % 23 iken iskelet
kasında % 2‘dir.
5.
Nukleusdur.49
Kardiyak myositler myokard volümünün %90 kadarını
oluĢturur. Ancak myositler toplam hücre sayısının %25 kadarını oluĢturur.
Diğerleri intertisiyel hücreler, zengin kapiller ağ oluĢturan endotelyal
hücreler, bağ dokusu elemanları ve nadir yangısal hücrelerdir.
En iç tabaka olan endokard ise ince bir tabaka olup iç tarafı
tek sıralı endotel hücreleri ile döĢeli bunun altında yer alan kollajen ve
elastik lifleri içeren bağ dokusundan oluĢmuĢtur. Bu bağ dokusu bazı
alanlarda daha kalın olup belirgin bir subendokardiyal tabaka meydana
getirir. Bu tabaka myokardaki kas lifleri arasındaki bağ dokusuyla devam
ederek endokardın myokarda sıkıca yapıĢmasını sağlar. Endokard kas
yapısının fazla olduğu yerlerde ve sürtünmenin az olduğu yerlerde incedir.
Sürtünmenin fazla olduğu yerler de ise kalındır. Endokardın en kalın
olduğu yer aortanın olduğu yerdir.1,49
2.2.2. Kalbin BoĢlukları ve Kan AkıĢı:
Ġçi boĢluklu bir organ olan kalp dört odacıklıdır.(ġekil 2) Üst
odacıklara atrium (kulakcık), alt odacıklara ventrikül (karıncık) denir. Kalbin
sağ ve sol ayırımı kesin olarak belli iken atrium ve ventriküller birbirinden
birer kapakla ayrılırlar. Atrioventriküler kapaklar denilen bu kapaklardan
sağ atrium ve ventrikül ile olanına triküspit, sol atrium ve sol ventrikül ile
olanına biküspid veya daha yaygın bir kullanıĢla mitral kapak adı verilir.
13
Şekil 2 :Kalbin boĢlukları ( www. trialsightmedia.com)
Kalbin sağ tarfında mutlaka deoksijenize, kirli kan; sol
tarafında ise mutlaka oksijenize, temiz kan bulunur. Bu sayede temiz ve
kirli kan kalpte birbiri ile karıĢmaz. KuĢlar ve memelilerde mevcut olan bu
özellik sayesinde vücudun sabit sıcaklığı ortaya çıkar. 1
Atrium dextrum olarak adlandırılan sağ kulakcık, akciğer
hariç diğer tüm doku, yapı ve organlardan gelen vücut kanının toplandığı
yerdir. Kanı getiren büyük toplardamarlar vena cava süperior ve vena cava
inferiordur. Ayrıca kalbin kendi kanı da sinus coranirius yolu ile gelir.
Buradaki kan triküpit kapakdan geçerek sağ karıncığa gelir.1
Ventriculus dexter olarak adlandırılan sağ karıncık kendinde
bulunan kirli kanı pulmoner aracılığı ile turuncus pulmonalis ve arteria
pulmonalis yolu üzerinden akciğerlere pompalar.1
14
Atrium sinistrum olarak adlandırılan sol karıncık pulmoner
venlerin getirdiği oksijenize, temiz kanın döküldüğü kalp bölümüdür.
Buradan kan sol karıncığa geçer.
Ventriculus sinister olarak adlandırılan sol karıncık tüm
vücuda temiz, oksijenize kanı pompalar.1
2.2.3. Kalbe Gelen ve Kalpten Çıkan Büyük Damarlar:
Kalbe giren damarlara ven, kalpten çıkan damarlara ise arter
adı verilir. Venler kirli, arterler temiz kan taĢırlar. Vena pulmonalisler ve
arteria pulmonalisler bu kuralın dıĢında kalan damarlardır. Vena cava
superior, üst ekstremite baĢ ve boyun, vena cava inferior ise alt
ekstremitenin venöz kanını sağ atriuma getirir.(ġekil 3)
Şekil 3:Kalbe gelen ve çıkan damarlar ( www. trialsightmedia.com )
15
Sağ ventrikülden arteria pulmonalis çıkar. Adı arter olmasına
rağmen kirli kanı taĢır ve bu kirli kanı temizlenmek üzere akciğerlere
götürür. Arter denmesinin nedeni kalpten çıkan damar olması ve duvar
yapısından kaynaklanmaktadır. Sol atriuma akciğerlerde temizlenen kanı
getiren dört tane pulmoner ven vardır. Kalbe girdikleri için ven adını alan
bu damarlar temiz kan taĢırlar. Sol ventrikülden temiz kanı vücuda
dağıtacak olan en büyük arteri aorta çıkar.
2.2.4. Kalbin ÇalıĢması:
Kalbin kasılmasında (sistol) kalp tepesi çok az hareket eder
buna karĢılık kalbin tabanı tepeye doğru hareket eder. Tabanı ostium artioventriculareler, ostium trunci pulmonale ve ostium aortae meydana getirir. Bu hareket eden bölmeye septum atrioventriculare denir. Bu hareket
eden yüze kalbin ventil yüzü denir. Bu çekme hareketini kalbin longitudinal
kas tabakası sağlar. Buna oblik kaslarda yardım ederler. Sirküler kaslarında kasılması ventrikül boĢluğunun daralmasını sağlar. Kalbin apaexinin az
hareket etmesinin sebebi sirküler kasların kasılması sonucu ventrikülün
uzamasından kaynaklanmaktadir. Bu uzama olmasaydı kalbin tepesi daha
çok hareket edecekti. Kalbin ventil yüzü apexe doğru çekilirken atriumların
ve auriculaların hacmı artıyor. Böylece buraya venlerden kan geliyor.
Ventriküldeki sistolde kan atardamarlara atılırken atriumlarada doluyor. Diastolde (ventrikülün geniĢlemesi) kan atriumlardan ventriküllere ostium atrioventriculareler yolu ile geçiyor. Böylece ventrikül tekrar kanla dolmuĢ
oluyor.
Kalp kasının fazla çalıĢmasında hypertrofi meydana gelir.
Hypertrofiyi yapan sebeplerin ortadan kalkmaması halinde kalbi meydana
getiren boĢluklarda dilatasyon (geniĢleme) meydana gelir. Bunu radyolojik
olarak teĢhis etmek mümkündür.
16
2.2.5. Kalpte Uyarı Merkezleri:
Kalp, otonom sistemin etkisi altında çalıĢır. Fakat bu sistemin
devreden çıkması durumunda yine çalıĢmasına devam eder. Bu çalıĢmada normal fonksiyon yapmaz ama kalbin kendi kendini uyaran bir sistemi
bulunur. Bu sistem kalp kasının meydana getirdiği uyartıyı yayan bir sistemdir. Bu sistem his huzmesi ve purkinje liflerinden meydana gelmiĢtir.
Uyarı sağ atriumda bulunan bir gangliondan meydana gelir. Bu ganlionun
yeri v.cava superiorun atrium dextruma girdiği yerde önde bulunur bir bacağı arkaya sulcus terminalis atrii dextri içindedir diğer bacağı ise septum
inter atrialede öne doğru uzanır. Bu düğüme Keith - Flack düğümü veya
nodus sinuatrialis denir. Bu düğüm dakikada 60-80 uyarı oluĢturur. Bu
uyarı diğer düğüme iletilir.
2.2.6. Büyük ve Küçük DolaĢım:
Sağ atriuma v.cava superior - inferior ve sinus coronarius ile
kirli kan gelir bu kan sağ atriumdan sağ ventriküle geçer buradan a. pulmonalis ile akciğerlere gider oksijene olur. Akciğerlerden kalbe geri döner
bu dolaĢıma küçük dolaĢım denir. Sol atriuma v. pulmonalis'lerle akciğerden kan gelir gelen kan sol ventriküle geçer buradan aortae ile vücuda dağılır sonra venlerle tekrar sağ atrium‘a döner bu dolaĢıma büyük dolaĢım
denir.1
2.2.7. Kalbin Kan Ġhtiyacının Sağlanması :
Kalp; normal bir insan uyku halindeyken günde 8-14 bin
litreden fazla kan pompalar. Günün 24 saati uyunmayacağı ve aktivitelere
bağlı olarak artacağı düĢünülürse oldukça yüksek bir orandır. Hayatın
devamının sağlanmasında durmadan çalıĢması Ģart olan kalp kasının bu
17
görevi yerine getirebilmesi için yüksek metabolik ihtiyacının karĢılanması
gerekir.
Kalp, enerji ihtiyacı açısından beyinden sonra en fazla
enerjiye ihtiyaç duyan organdır. Bu enerji ihtiyacının karĢılanabilmesi için
kalp, tüm vücuda pompaladığı kanın yaklaĢık %5-10 ‗unu kendi için
kullanır. Ana arter aorttan çıkan ve kalbi besleyen damarlara özel olarak
koroner arterler adı verilir.1
2.3. Oksidatif stres ve Serbest Radikaller
Doğal bir süreç olan oksidatif stres, oksijene ihtiyaç duyan
tüm canlı sistemlerde, çeĢitli basamaklarda oluĢmaktadır. Biyolojik
sistemler, spesifik mekanizmalar ile bu stresi kontrol altında tutar. Kontrol
mekanizmalarının yetersiz olduğu durumlarda oksidatif hasar meydana
gelmektedir 50
Oksidatif stres, pro-oksidan (reaktif oksijen türleri ve reaktif
nitrojen türleri) ile anti-oksidan savunma sistemi arasındaki hassas
dengenin, pro-oksidan ve oksidan maddelerin lehine kayması olarak
tanımlanmaktadır. 11 ( ġekil 4)
Oksidatif stresin birçok hastalığın patolojisinin baĢlamasında
ve ilerlemesinde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Miyokard enfarktüsü
gibi kardiyolojik hastalıklar, nörolojik hastalıklar, astım, diabetes mellitus,
romatoid artrit gibi romatolojik hastalıklar, kanser ve yaĢlanma dahil birçok
hastalığın oksidatif stresle iliĢkisi gösterilmiĢtir. 2-7
18
Şekil 4 : Oksidatif Stres (www.woongbee.com)
Atomlar; proton ve nötronlardan oluĢan yüklü bir çekirdek ve
çekirdeğin
etrafında
bulunan
negatif
yüklü
elektronlardan
oluĢur.
Elekrtonlar hem partikül hem de dalga özelliğine sahip olup çekirdek
etrafında ıĢık hızıyla hareket ederler. Bu nedenle elektronların çekirdek
etrafındaki yeri tam olarak tarif edilemez, yalnızca bulunma olasılığının en
yüksek olduğu
yerden
bahsedilebilir.
Belirli elektronların
bulunma
olasılığının en yüksek olduğu yer orbital olarak adlandırılır.51-54
Normal kimyasal bağ, bir çift elektron içerir ve bunların
pozisyonları (spin),terstir.55
Serbest radikalin en yaygın tanımı; son orbitalinde bir veya
birden fazla eĢleĢmemiĢ elektron bulunduran atom veya atom grupları
olduğu Ģeklindedir.56 Bu yapılarıyla bir açık bağ ya da yarım bağ içeren,
kimyasal olarak reaktif moleküllerdir.57,55
19
Bu eĢleĢmemiĢ elektron,
serbest radikali kararsız bir
konuma getirir. Serbest radikalin kararlı, stabil bir yapıyı tekrar kazanması
amacıyla elektronunu bir baĢka elektronla eĢleĢtirmesi gerektiğinden bu
durum serbest radikale kimyasal olarak büyük bir aktivite kazandırır.58
Serbest radikalle ilgili bu tanımlama; hidrojen atomunu,
birçok geçiĢ metal iyonlarını oksijen molekülünü kapsar.
59
2.3.1. Serbest Radikal Kaynakları
BaĢlıca üç mekanizma ile oluĢmaktadır:
1.Kovalent bağların hemolitik kırılması ile:
Yüksek enerjili
elektromanyetik dalgalar ve yüksek sıcaklık kimyasal bağların kırılmasına
neden olur. Kırılma sırasında bağ yapısındaki iki elektronun her biri ayrı
ayrı atomlar üzerinde paylaĢılmamıĢ olarak kalmakta ve iki adet serbest
radikal oluĢmaktadır.60-62
X :Y
X .+ Y .
2. Normal bir molekülün elektron kaybetmesi veya heterolitik
bölünmesi ile: Radikal özelliği bulunmayan bir molekülden elektron kaybı
sırasında dıĢ orbitalinde paylaĢılmamıĢ elektron kalıyorsa radikal formu
oluĢur.61,62
Askorbik asit, glutatyon (GSH) ve tokoferoller gibi hücresel
antioksidanlar radikal türlere tek elektron verip radikalleri indirgerken;
kendilerinin radikal formu oluĢur. Bu tipteki bölünmede kovalen bağı
oluĢturan her iki elektron; atomların birinde kalır ve serbest radikal değil
iyonlar meydana gelir.
20
X :Y
X- : + Y +
3) Normal bir moleküle elektron transferi ile: Radikal özelliği
taĢımayan bir moleküle tek elektron transferi ile dıĢ orbitalinde
paylaĢılmamıĢ elektron oluĢuyorsa bu tür indirgenme radikal oluĢumuna
sebep olabilir. Moleküler oksijenin tek elektron ile indirgenmesi radikal
formu olan superoksidin oluĢumuna neden olur.
X+e-
X. –
Moleküler oksijen dıĢ orbitalinde paylaĢılmamıĢ iki elektron
içerir. Bu elektronlar, spinleri aynı yönde ve farklı orbitallerde iken
minimum
eneji
seviyesindedirler.
Radikal
tanımına
göre
oksijen
‗‘diradikal‘‘yapıya sahip bir moleküldür. Oysa oksijenin reaktivitesi
beklenenin aksine çok düĢüktür. Diradikal yapıya sahip oksijenin herhangi
bir molekül ile tepkimeye girebilmesi için, tepkimeye gireceği molekülün de
benzer yapıya(farklı orbitallerde spinlerin aynı yönde elektron içermesi)
sahip olması gerekir. Oysa baĢta organik moleküller olmak üzere atom ve
moleküller orbitallerinde elektronları antiparalel ve eĢleĢmiĢ olarak içerirler
veya paylaĢılmamıĢ elektronlar kovalent bağlara
dahildirler . Bunun
sonucu olarak oksijenin diğer moleküllere olan reaktivitesi son derece
kısıtlanmıĢtır. Bu kısıtlama ‗‘spin kısıtlaması‘‘ olarak adlandırılır. Canlıların
oksijeni kullanabilmesi için, oksijene elektron transferi yaparak spin
kısıtlamasını aĢması gerekir. Bu iĢlem için canlılar bazı metal iyonlarından
(Fe,Cu,Mn,Zn) yararlanırlar.Spin kısıtlaması iki Ģekilde aĢılır.51,52,53,63,64,65
1. Oksijene elektron transferi; proteinlere bağlı metal iyonları
aracılığıyla oksijene bir ve ya iki elektron aktarımı katalizlenebilir. Oksijene
tek elektron transferi ile süperoksit radikali oluĢur. Spin kısıtlaması kalktığı
için süperoksit oksijene göre çok daha reaktiftir. Ġki elektron transferi ile de
peroksi anyonu oluĢur.
21
2. Enerji absorbsiyonu; Bu mekanizma ile oksijenin iki
uyarılmıĢ formu oluĢur. Singlet oksijen diye adlandırılan oksijenin bu
formlarında dıĢ orbitalde paylaĢılmamıĢ elektronlardan birisinin spini
değiĢmiĢtir. Zıt spinli elektronlar aynı orbitalde ( delta formu ) veya ayrı
ayrı
orbitallerde
(sigma
formu)
bulunabilirler.51,52,53,63,64,65
Aerobik organizmalar için O2 esansiyel bir moleküldür. Aynı
zamanda O2 oksidan bir ajandır. Normal koĢullar altında moleküler
oksijenin çoğu sitokrom sistemi gibi hücre içi sistemler içinde tetravalan
redüksiyona uğramaktadır. Bununla birlikte %1-2 oranında bu yoldan
sızan oksijenin biyolojik yapılarda univalan redüksiyonu sonucu serbest
oksijen radikalleri olarak adlandırılan birçok reaktif ürün ortaya çıkar.
Aerobik organizmalarda radikaller daha çok oksijen radikalleri Ģeklinde
bulunmaktadır.57 Reaktif oksijen ve nitrojen türleri insanlarda çeĢitli
fizyolojik ve patolojik durumlarda oluĢurlar 57,66
Serbest radikallerin büyük çoğunluğu invivo olarak üretilir ve
amino asitler, yağ asitleri, karbonhidratlar ve nükleotitler gibi birçok
biyolojik molekülü okside edebilirler. 67
Birçok sistem ve metabolizma üzerine etkili olan serbest
radikaller, normal metabolik olaylar sırasında ortaya çıkabildikleri gibi çok
çeĢitli dıĢ etkenlere bağlı olarak da oluĢabilirler.66,68
Ekzojen kaynaklar; hava kirleticiler, doğal zararlı gazlar
(ozon, oksijen ve hiperbarik oksijenin yüksek konsantrasyonları ), iyonize
ve non-iyonize radyasyon, ilaçlar, alkol, patojenik bakteri ve virüsler.69,70
Endojen
kaynaklar
ise
mitokondrial
elektron
transport
sistemi, endoplazmik retikulum, araĢidonik asit metabolizması, redoks
22
döngüsü, fagositik hücreler (monosit ve makrofajlar, nötrofil, eozinofil) ve
endotelyal hücreler gibi hücrelerdeki oksidatif reaksiyonlar, ksantin
oksidaz, NADPH oksidaz, indolamin dioksijenaz, triptofan dioksijenaz,
galaktoz oksidaz, siklooksijenaz, lipooksijenaz, monoamin oksidaz gibi
oksidan enzimler ve otooksidasyon reaksiyonlarıdır.62
Mitokondrial
mitokondrial
membrana
oksijen
radikallerinin
baĢlıca
kaynağı,
iç
lokalize eletron transport zinciridir. NADPH
dehidrojenaz ve ubikinon-sitokrom b‘ nin oksijeni süperokside indirgerken,
karĢılığında hidrojenperoksit ve hidroksil radikali için bir prekürsör gibi
hizmet ettiği gösterilmiĢtir. Respiratuar zincir taĢıyıcıları büyük oranda
indirgendiğinde,
mitokondri
tarafından
hidrojenperoksit
üretimi
en
büyüktür. Peroksizomlar yüksek konsantrasyonda oksidazlar içerirler ve
hidrojenperoksitin potent kaynaklarıdır. Oksijen radikalleri oluĢumunda
görev alan majör enzimlerden biri hücre membranına bağlı olan NADPH
oksidazdır. Bu oksidaz fagositik hücrelerin membranında, b-tipi sitokromla
birlikte bulunur. Ġnflamatuar mediatörlerle aktivasyonu bu hücrelerin
uyarımıyla oluĢan oksidatif burst‘ten sorumludur. Sitoplamik yüzde
NADPH‘ ı okside ederek, membranın dıĢ yüzünde oksijeni süperokside
indirger.71,72
Hücre membranı fosfolipitlerden araĢidonik asit salınımını
katalizleyen fosfolipaz A2 ve C‘ yi de içerir. AraĢidonik asitin siklooksijenaz
ve lipooksijenaz yolları aracılığıyla enzimatik olarak oksidasyonu, özellikle
hidroksil radikali olmak üzere, serbest radikal oluĢumuna neden olur.71
Organizmanın yapısında bulunan proteinler, serbest amino
asitler, DNA, lipitler ve nükleik asitler gibi makro moleküller, bu sistemler
tarafından üretilen reaktif oksijen türlerinin etkilerine maruz kaldıklarında
hasara uğramaktadırlar.73
23
Oksidatif hasar oluĢturan türler (reaktif oksijen türleri, nitrojen
ve klorin türleri); metabolizma ürünleri, fizyolojik mediyatörler ve sinyal
molekülleri olarak ortaya çıkarlar.
Fizyolojik koĢullarda O2‘nin %98‘i mitokondride bulunan
sitokrom oksidaz tarafından indirgenmekte ve 4 elektron alarak suya
dönüĢmektedir.
O2 + 4H+ + 4eSerbest
oksijen
2H2O
radikallerinin
oluĢum
basamaklarında
öncelikle tek elektron transferi ile moleküler oksijen süperoksit (O 2˙)
radikaline dönüĢmektedir. Süperokside iki elektronun eklenmesi ile
hidrojen
peroksit
(H2O2)
oluĢmaktadır.
Hidrojen
peroksit
radikal
olmamasına karĢın elektron almasıyla son derece toksik olan hidroksil
(OH˙) radikalini oluĢturmaktadır. Hidroksil radikali de univalan redüksiyon
ile suya dönüĢmektedir.
Vücutta oluĢturulan radikallerin her zaman tehlikeli ve zararlı
maddeler olduğu düĢünülmemelidir. Serbest radikaller; zararlı etkilerinin
yanında vücut için gerekli bir
çok fonksiyonun gerçekleĢtirilmesinde
önemli rol oynarlar. 74
Steroid yapıdaki çok sayıda bileĢiğin üretimi, eikozanoidler
gibi biyolojik aktif moleküllerin sentezi, ksenobiyotiklerin detoksifikasyonu,
çok sayıda oksidaz ve hidroksilaz enzimlerinin etkileri ve sitotoksik etkilere
sahip hücrelerin fonksiyonları için serbest radikal yapımı olmazsa olmaz
bir koĢuldur.75
Serbest radikallerin en iyi bilinen zararlı etkileri; hücre
membranı, yağ asitleri ve lipoproteinlere saldırarak lipit peroksidasyonu
olarak
bilinen
bir
zincir
reaksiyonunu
baĢlatmalarıdır.
Lipit
24
peroksidasyonunun ürünleri ileri aĢamalarda membran proteinlerinde de
hasara yol açarak yapısal ve fonksiyonel bozuklukların ortaya çıkmasına
neden olurlar. 76
2.3.2. Serbest Radikal Türevleri:
Reaktif oksijen türlerinin ( ROS ) ve reaktif nitrojen türlerinin (
RNS ) oluĢumu için oksijen gereklidir. 66,77
Serbest oksijen radikallerine süperoksit: O2˙, hidroksil
radikali:
OH˙,
alkoksil
radikali:
RO˙,
peroksil
hidroperoksil radikali: OOH ˙ örnek verilebilir.
radikali:
ROO˙
ve
66,67
Nitrik oksit: NO˙, nitrojen dioksit: NO2˙ radikalleri de RNS‘ yi
oluĢturur.
66
Oksijen ve nitrojen serbest radikalleri, hidrojen peroksit: H2O2,
peroksinitrit: ONOO , hipoklorik asit: HOCl, hipobromöz asit: HOBr, gibi
diğer reaktiflere dönüĢebilir. (ġekil 5)
25
ġekil 5. Memeli hücrelerinde reaktif oksijen ve reaktif nitrojen türlerinin meydana
66
gelişi.
(İR:İyonize
radyasyon,
Sit
:Sitrüllin,
D-AA
:D-Amino
asit,
BH4:
Tetrahidrobiopterin, Gly:Glisin, L˙: Lipit radikali, SOD : Süperoksit dismutaz, MPO
: Myeloperoksidaz)
2.3.2.1. Süperoksit Radikali (O2˙-) :
Süperoksit radikali; oksijenin bir elektron alarak indirgenmesi
sonucu kararsız bir yapı olarak meydana gelir.
O2 + e -
O2˙
Mitokondriyal elektron transport zinciri sırasında O2‘nin
otooksidasyonu sonucu oluĢur. Süperoksit radikali O2 varlığında ksantin
oksidaz‘ın ksantini veya hipoksantini indirgemesiyle, NADPH‘nin NADPH
oksidaz ile oksidasyonuyla, mitokondriyal elektron transport sistemi ile
NADH2 ve FADH2‘nin NAD ve FAD‘ye dönüĢümü sırasında, O2‘nin iyonize
radyasyonla, sit p450 ile ve arginin veya tetrahidrobiopterin eksikliğinde
nitrik oksit sentazla indirgenmesiyle oluĢur.77,78
26
Makrofajlar
ve
polimorf
nüveli
lökositler
tarafından
gerçekleĢtirilen fagositoz sırasında O2 tüketimi artar ve bu durumda
plazma
membranında
bulunan
NADPH
oksidaz
tarafından
O2˙-
oluĢumunu tetikler.
NADPH oksidaz
2 O2 + NADPH
NADP + 2 O2˙- + H+
Antibakteriyel etki için gerekli olan bu radikal oluĢumu, daha
reaktif türlerin oluĢumunu da baĢlatır. Yani radikal yapımı bazı hücresel
fonksiyonlar için gerekli olabilir.
O2˙- dioksijen redüksiyonunun, biyotik ve abiyotik sistemde
en sık rastlanan ara üründür. O2˙- ‘nin fazla üretimi ya da enzimatik
korumanın azalması, büyümenin yavaĢlaması, mutagenez ve hücre ölümü
ile sonuçlanır.
O2˙- ‘nin kimyasal davranıĢı nerede çözündüğüne göre
değiĢmektedir. Suda çok reaktif değildir. Bazen bir elektron alarak, okside
edici ajan olarak davranabilir. Örneğin askorbik asidi okside etmektedir.69
Askorbik Asit + O2˙-
Askorbik asit radikali + H2O2
Organik solventlerde daha reaktif ve tehlikelidir. Biyolojik
membranlarda oluĢtuğunda oldukça fazla hasar meydana getirmektedir.
O2˙- çeĢitli organik ya da inorganik bileĢiklerle de reaksiyona
girebilir. Nitrik oksit ile reaksiyona girebilir. Nitrik asit ile reaksiyona girip
peroksinitriti(ONOO , ) oluĢturması önemlidir. 79
27
2.3.2.2. Hidroksil Radikali (OH˙) :
Yarılanma ömrü kısa, kimyasal ve biyolojik sistemlerde
üretilen ve oldukça güçlü bir serbest radikal olan hidroksil radikali kuvvetli
hasar oluĢturur. Canlılarda iki mekanizma ile oluĢabilir. 51,52,65,80
1- Dokular γ radyasyona maruz kaldıklarında, enerjinin çoğu
hücre içindeki su tarafından absorbe edilmekte ve radyasyon, oksijen ile
hidrojen arasında kovalent bağa neden olmaktadır. UV ıĢığına maruz
kalması ile de hidroksil radikali oluĢabilmektedir.60,62
ĠyonlaĢtırıcı
radyasyonun
etkisi
ile
sulu
ortamda
su
moleküllerinin iyonlaĢması gerçekleĢir.
2H2O
H2O+
+
e-
+
H2O˙
UyarılmıĢ su molekülü (H2O˙ ) homolitik yıkım ile H2O+ ise bir
su molekülü ile tepkimeye girerek hidroksil radikali oluĢtururlar. Bu
tepkimeler çok kısa sürede oluĢur ve üretilen hidroksil, radyasyonun
canlılardaki toksik etkisinden sorumlu baĢlıca kimyasal türdür. Ġyonize
radyasyon etkisi ile de OH˙ oluĢur.66
H2O
H+ + OH˙
2- Hidrojen peroksitin eksik indirgenmesiyle hidroksil yapımı,
vücutta bu radikalin en önemli kaynağıdır. Hidrojen peroksitin iki elektron
ile indirgenmesinden su oluĢurken, tek elektron ile indirgenmesi hidroksil
oluĢumuna neden olur. Bu tür indirgenme Fe, Cu gibi metal iyonları
tarafından katalizlenir. Askorbik asit, süperoksit gibi bileĢiklerin de
bulunduğu ortamda oksitlenen metal iyonu tekrar indirgendiğinden
hidrojenperoksitten hidroksil yapımı sürekli bir duruma gelir.
28
Fe+2
O2˙- + H2O2
O2 + OH
+ OH˙
Ayrıca demirin katalizlediği Haber-Weiss reaksiyonuyla da
OH˙ oluĢur. 82
Bu tepkimede hidroksil radikalinin oluĢması vücutta üretilen
hidrojenperoksitin deriĢimi ve serbest metal iyonunun varlığına bağlıdır.
Süperoksit hem hidrojenperoksitin öncülü hem de metalleri indirgeyici bir
tür olduğundan (süperoksit proteinlere bağlı metallerin indirgenip serbest
kalmasına
neden
olabildiğinden)
biyolojik
koĢullarda
oluĢumunun arttığı ortamda hidroksil üretimi kaçınılmazdır.
süperoksit
51,52,54,64,83
Toksik OH˙ oluĢumunda demir, bakır gibi bazı metal iyonları
da rol oynar. Asıl olarak Fe+2 molekülünün de katıldığı Fenton reaksiyonu
ile oluĢur.1* Fe+3‘ün O2˙- ile indirgenmesi ile oluĢan Fe+2, H2O2 ile
reaksiyona girerek OH˙ radikalini meydana getirir. Bu reaksiyon ‘Fenton
Reaksiyonu‘ olarak adlandırılır.
Fe+3 + O2˙-
Fe+2 + O2
Fe+2 + H2O2
Fe+3 + OH˙ + OH
Biyolojik sistemlerin tanıdığı en reaktif tür olan OH˙ su dahil
ortamda rastladığı her biyomolekülle tepkimeye girer. Hidroksil radikalinin
tepkimeleri baĢlıca;
1) Elektron transfer tepkimeleri,
2) Proton çıkarma tepkimeleri,
3) Katılma tepkimeleri (protein ve lipitler arası çapraz
bağlar oluĢturarak) Ģeklindedir.
29
Bütün bu tepkimeler, hidroksilin paylaĢılmamıĢ elektron
içeren
dıĢ
orbitaline
elektron
alma
ilgisinden
kaynaklanır.Katılma
tepkimeleri, özellikle elktronca zengin moleküllerle( pürin ve pirimidin
bazları, aromatik
amino asitler gibi) gerçekleĢir.Hidroksil radikalinin
organik moleküllerden hidrojen atomu alarak suya indirgendiği tepkime
,hidrojen çıkarma tepkimesi olarak bilinir. Hidroksil radikali ile oluĢan en iyi
tanımlanmıĢ biyolojik hasar, lipit peroksidasyonu olarak bilinen serbest
radikal zincir reaksiyonudur. Her türlü biyolojik molekül hidroksil radikalinin
bir hedefi ise de özellikle elektronca zengin bileĢikler tercihli hedeflerdir.
Nükleik asitler, proteinler ve lipitlerde baĢlatılan radikal tepkimelerde
binlerce farklı ara ürünler oluĢabilir.
DNA ile tepkimesi sonucu baz modifikasyonları, baz
delesyonları, zincir kırılmaları gerçekleĢebilir. Ġleri derecedeki DNA
hasarları tamir edilemeyeceğinden hücre ölümüne neden olur. Proteinler
üzerinde oluĢan oksidasyonlar yapı değiĢimine neden olacağından
proteinleri proteolitik yıkıma götürür. Hücre zarı su içermediğinden
hidroksil
radikalinin
baĢlıca
hedefi
yağ
asididir.
Zar
lipitlerinin
peroksidasyonu zarın yapısını bozar ve geçirgenliğini artırıp yine hücre
ölümüne
neden
olabilir.
Özellikle
hidroksil
radikalinin
yapımını
katalizlemelerindeki etkileri nedeniyle, canlılarda metal iyonları radikal
hasarlarından birinci derecede sorumludurlar ve bu etkiye sahip
olamadıkları formda (proteine bağlı) tutulmalıdırlar.
51,52,54,64,83
2.3.2.3. Hidrojen Peroksit (H2O2) :
Hidrojen Peroksit, oksijen molekülünün enzimatik olarak iki
elektron
alarak
indirgenmesi
veya
yapıya
iki
hidrojen
atomunun
eklenmesiyle oluĢur.84
30
Süperoksit radikalinin yapısına enzimatik ve enzimatik
olmayan dismutasyon tepkimeleri sonucunda bir elektron katılmasıyla da
meydana gelmektedir. Biyolojik sistemlerde daha sık olarak iki süperoksit
molekülü, iki protonla birleĢerek hidrojen peroksit ve oksijen oluĢturur.
O2 + 2e- + 2H+
H2O2
O2˙- + e- + 2H+
H2O2
O2˙- + O2˙- + 2H+
H2O2 + O2
H2O2, O2 den iki elektronun sit p450, yağ-açil KoA oksidaz,
asetil KoA oksidaz, ürik asit oksidaz, α-hidroksiasit oksidaz veya D-amino
asit
oksidaz
ile
redüksiyonu,
monoaminler
(dopamin,epinefrin,
norepinefrin), hemoglobinin otooksidasyonu ve glisin sentezinde de
oluĢur.85
Peroksizomlar
fazla
miktarda
oksidaz
içerdiklerinden
hücresel H2O2 için potansiyel kaynaktır.
H2O2 bir serbest radikal olmamasına karĢın yüksüz bir
molekül olduğundan hücre içerisine kolaylıkla girebilir. H2O2 in oksitleyici
bir tür olarak bilinmesinin nedeni; Fe, Cu gibi metal
iyonlarının
varlığında kolaylıkla yıkılıp, bu yıkım sonucu en reaktif radikal olan OH˙
oluĢmasıdır. 66
H2O2 özellikle proteinlerdeki hem grubunda bulunan demir ile
tepkimeye girerek, yüksek oksidasyon düzeyindeki reaktif demir formlarını
oluĢturmaktadır. Bu formdaki demir çok güçlü oksitleyici özelliklere sahip
olup, hücre zarlarında lipit peroksidasyonu gibi radikal tepkimeleri
baĢlatabilmektedir . 61,62,86
31
2.3.2.4. Hipoklorik Asit (HOCl) :
Nötrofiller, stoplazmada bulunan myeloperoksidaz (MPO)
enziminin katalizlediği reaksiyonla güçlü oksidatif bir yapı olan hipokloridi
oluĢturur.87
MPO
H2O2 + Cl -
HOCl + OH .
2.3.2.5. Singlet oksijen (1O2) :
Yapısında
ortaklanmamıĢ
elektron
bulundurmaması
sebebiyle serbest oksijen radikali olmayıp reaktif oksijen türleri grubunda
yer alan bir moleküldür. Singlet oksijen serbest radikal reaksiyonlarının
baĢlamasına neden olması açısından önem taĢımaktadır.
1
O2, oksijen
elektronlarının dıĢardan enerji alması sonucu kendi dönüĢ yönünün ters
yönündeki farklı bir yörüngeye geçmesi ile oluĢabileceği gibi, O 2˙
radikalinin dismutasyonu ve MPO‘nun katalizlediği H2O2‘nin HOCl ile
reaksiyonu sonucunda da oluĢabilir.52
Oksijenin enerjitik olarak uyarılan bu formunda reaktivite çok
yüksektir. Aldığı enerjiyi çevreye dalga enerjisi Ģeklinde verip yeniden
oksijene dönebilir. BaĢlıca Ģu mekanizmalarla vücutta oluĢabilir. 51,52,53,63,88
a) Pigmentlerin ( örneğin flavin içeren nükleotitler, retinal,
bilirubin ) oksijenli ortamda ıĢığı absorblamasıyla.
b)
Hidroperoksitlerin
metaller
varlığındaki
yıkım
tepkimelerinde
c) Kendiliğinden dismutasyon tepkimeleri sırasında
32
d)
Prostaglandin
endoperoksit
sentaz,
sitokrom
p450
tepkimeleri, myelo/kloro/laktoperoksidaz enzimlerinin etkileri sırasında
Oksijenin bu enerjitik reaksiyonu sonucunda iki tip singlet oksijen üretilir,
-Sigma singlet oksijen: Enerjisi daha fazladır ve çok kısa
ömürlüdür.
-Delta singlet oksijen: Daha uzun ömürlüdür ve gözlenen
kimyasal reaksiyonlardan esas sorumlu olduğu kabul edilmektedir.
Singlet oksijen diğer moleküllerle etkileĢtiğinde ya içerdiği
enerjiyi transfer eder ya da kovalent tepkimelere girer. Özellikle karbonkarbon çift bağları singlet oksijenin tepkimeye girdiği bağlardır. DoymamıĢ
yağ asitleri ile de doğrudan doğruya tepkimeye girer ve hidroksil radikali
kadar etkin bir Ģekilde lipid peroksidasyonunu baĢlatabilir.
2.3.2.6. Perhidroksil radikali (OOH˙) :
O2˙ radikali asidik ortamda daha reaktif olup protonlanarak
kendisinden daha kuvvetli bir oksidan olan OOH˙ radikalini oluĢturur.84
pH
O2˙ + H +
OOH˙
2.3.2.7. Peroksil radikali (ROO˙) :
Karbon
merkezli
radikaller(R˙)
;
lipid,
nükleik
asit,
karbonhidrat, protein gibi biyolojik moleküllerin hidroksil grubu ile
reaksiyona girmesi sonucu oluĢur. R˙ radikalleri hızlı bir Ģekilde oksijen ile
reaksiyona girerek ROO˙yi oluĢtururlar.84 ROO˙, lipit peroksidasyonunu
baĢlatan radikal olup çok uzun ömürlüdür.
33
R˙ + O2
ROO˙
Peroksi radikalinden de alkoksil radikali ( RO˙)oluĢabilir.
2.3.2.8. Nitrik Oksit (NO˙) :
Nitrik Oksit, çok önemli biyolijik fonksiyonları terine getirmek
üzere üretilen nitrojen merkezli bir radikaldir. PaylaĢılmamıĢ elektron
aslında nitrojen atomuna ait ise de, bu elektronun hem nitrojen hem de
oksijen üzerinde delokalize olması nedeniyle tam radikal özelliği taĢımaz.
Bunun sonucu, bilinen diğer radikallere göre reaktivitesi baskılandığından
oldukça uzun ömürlüdür. 51, 52,53,54,65,83
Oksijen radikalleri çok sayıdaki enzimatik ve enzimatik
olmayan yollar ile fiziksel/kimyasal mekanizmalarla oluĢturulurlar. Oysa
vücudumuzda nitrik oksit sentezini sağlayan mekanizmalar son derece
kısıtlıdır. Vücuda giren nitro bileĢiklerinin metabolize edilmesi sırasında
oluĢan nitrik oksit bir tarafa bırakılacak olursa, endojen nitrik oksit
oluĢturan tek kaynak NOS‘un (NO-Sentaz) aktivitesi sonuçu sentezlenir.
NOS,
oksijeni kullanarak L-arjinin amino asitinden sitrülin ve NO‘yu
oluĢturur. Bu olay, nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADPH), flavin
mononükleotit (FMN), flavin adenin dinükleotit (FAD), tetrahidrobiopterin
(BH4) ve kofaktör olarak bir tiyol donörüne ihtiyaç duyar.98
Arginin + O2 + NADPH + H+
Sitrülin + NO˙+ NADP + H2O
EĢleĢmemiĢ elektronu nedeniyle bir serbest radikal türü
olarak bazı memeli hücre tiplerince üretilen NO; damar tonüsünün
kontrolünde, platelet agregasyonunda, lökosit adezyonunda, hücre aracılı
immün sitotoksisitesinde, sinaptik geçirgenlikte sinyal molekülü olarak
önem taĢımaktadır.89
34
Radikal olarak reaktivitasi düĢük olan nitrik oksit, metal
içeren merkezler ve radikaller ile büyük hızla tepkimeye girer. Özellikle
lipid radikaller ile tepkimeye girmesi nitrik oksite antioksidan bir etki de
kazandırır.
Fizyolojik
oksihemoglobin
değiĢimde
tarafından
üretilen
nitrata
nitrik
(NO3˙)
oksit
esas
oksitlenerek
olarak
aktivitesi
sonlandırılır. Oksijen radikallerindeki durumun aksine, nitrik oksidi
ortamdan temizleyen herhangi bir özel enzim yoktur. Aerobik ortamda
nitrik oksid stabil değildir. DeriĢiminin artması ile oksidasyonu hızlanır. Bu
nedenle ortamdaki deriĢimi ile kendi ömrü arasında ters bir orantı
vardır. 51, 52, 53,54,83
2.3.2.9. Peroksinitrit (ONOO ) :
Süperoksit
radikali
veya
hidrojen
peroksitin
NO˙
ile
reaksiyona girmesi ile oluĢur.90
O2˙ + NO˙
ONOO
H2O2 + NO˙
ONOO
OluĢan peroksinitrit radikalinin oksidatif potansiyeli O2˙ ve
H2O2‘ye göre daha yüksektir.66
Oksidatif stresle analog olmak üzere NO‘nun ve NO‘dan
türeyen reaktif nitrojen türlerinin (RNS) artan miktarları organizmada
nitrozatif stresi meydana getirir.91 Nitrozatif stres ile inflamasyon olayları,
nörotoksisite ve iskemi gibi patolojik olaylarla bağlantılı bulunmuĢtur.92
Her iki stresi ortaya çıkaran reaktif türler birbirleriyle etkileĢim
halindedir. 93(ġekil 6)
35
Şekil 6: ROS ve RNS‘nin birbirleriyle etkileĢimi. 93
2.3.3. Serbest Radikallerle OluĢan Lipit Peroksidasyonu
Organizmanın yaĢam sürecinde karĢılaĢtığı radikal türlerin
çeĢitli olması nedeniyle, serbest radikallerin biyolojik etkilerini genellemek
zordur. OluĢan serbest radikaller, ortamdan uzaklaĢtırılamadığı takdirde
pek çok yolla konsantrasyonlarına bağlı olarak, metabolik bozukluklara,
hücre hasarına ve hatta ölüme yol açarlar.94
Serbest radikaller, kimyasal modifikasyonlarla protein, lipit,
karbonhidrat ve DNA‘da hasar oluĢtururlar.
Lipitler; biyolojik moleküler içinde reaktif oksijen türlerinin
yıkıcı etkilerine en fazla maruz kalan moleküllerdir. Hücre membranı
serbest oksijen radikalleri ile hızla reaksiyona girebilen çoklu doymamıĢ
36
yağ asitlerinden oldukça zengindir. Bu yağ asitlerinin doymamıĢ bağları
serbest radikallerle reaksiyona girip peroksidasyona neden olur. Membran
akıĢkanlığı, membran lipitlerinin yan zincirlerinde bulunan doymamıĢ yağ
asitleri
ile
sağlanır. DoymamıĢ
yağ
asitlerinin
hasarı,
membran
akıĢkanlığını azaltıcı etki gösterir.58
İlerleme
Başlama
Şekil 7: Metallerin katalizlediği lipit peroksidasyonu 95
Lipit peroksidasyonu, reaktivitesi oksijen serbest radikalleri
tarafından tetiklenen oksidatif stresin en önemli organik göstergelerinden
birisidir. Lipit peroksidasyonu sırasında oluĢan MDA (Malondialdehit),
biyolojik örneklerde kolaylıkla ölçülebilen ve peroksidatif hasarı gösteren
nispeten dayanıklı bir üründür.96 Biyolojik sistemlerdeki oksidatif stresin
ölçülmesinde günümüzde en yaygın metod MDA ölçümüdür. MDA,
proteinlerin lizin rezidüleriyle ve fosfolipitlerin amin gruplarıyla reaksiyona
girer.97
MDA, kolaylıkla difüze olabildiğinden, DNA
bazlarıyla da
reaksiyona girerek hasara neden olabilir.
Peroksidasyon sonucu oluĢan reaktif aldehitler serbest
radikallere göre daha stabildirler ve hücre içinde veya hücreden dıĢarıya
çıkarak daha uzaktaki bölgelerdeki proteinlerin serbest amino grupları,
37
fosfolipitler ve nükleik asitlerle reaksiyona girebilir. Bunun sonucunda
molekül içi ve moleküller arası 1-amino-3-imino propen (AIP) köprüleri
kurabilir ve biyolojik moleküllerde yapısal modifikasyonlar oluĢturabilir.
B
C
4-Hidroksialkalenler
Ketoaldehitler
Akrolein
4-Hidroksi-2-nonenal
(HNE)
Örnek
Grup
A
2-Alkalenler
Malondialdehit
(MDA)
Şekil 8: Lipit peroksidasyonu ile oluĢan aldehitler. 97
Üç karbonlu bir ketoaldehit olan MDA, normal metabolik
Ģartlarda, önce asetat veya malonata kadar okside olur, daha sonra krebs
siklusu ile CO2‘e indirgenerek atılır. Fakat aĢırı lipit peroksidasyonunda
MDA
konsantrasyonu artar ve dokulara hasar verir.98
Peroksiradikali, poliansatüre yağ asidi moleküllerini okside
edebilmekte, radikallerin ve aldehitlerin ortaya çıkmasına neden olan
hidroperoksitlerin meydana gelmesini sağlayabilmektedir. Aldehit ise bu
maddelerin yıkılması sırasında oluĢmakta ve uzun ömürlü olduklarından
hücre hasarının yayılmasına neden olabilmektedirler. Bu aldehitler
arasında en iyi bilinenleri MDA (Malondialdehit) ve 4-hidroksi alkalendir.62
Lipit hidroperoksitleri ve lipidperoksi radikalleri, serbest oksijen radikalleri
gibi aynı hücrenin birçok komponentiyle reaksiyona girerek, hücresel ve
metabolik fonksiyonlar üzerinde toksik etkilerini göstermektedirler. Bu
etkiler;
38
1. Membran komponentlerinin polimerizasyonuna ve çapraz
bağlanmalarına neden olan MDA, iç membranın deformabilite, iyon
transportu, enzim aktivitesi ve hücre yüzeyindeki determinantların
gibi bazı özelliklerini değiĢtirebilmektedir.
agregasyonu
2. Transmembran gradientini bozarak, Ca+2 gibi bazı iyonlara
karĢı spesifik olmayan geçirgenliği artırabilmektedirler. Ca+2 geçirgenliğinin
artması hücre fonksiyonlarını bozar ve oksidasyonla fosforilasyonun
ayrılmasına
yol
açabilir.
Sinir
peroksidasyonu(demiyelizasyon)
lifleri
etrafındaki
nörolojik
miyelin
hastalıklara
kılıfı
neden
olabilmektedir. Akciğer sürfaktanının peroksidasyonu ise atelektazi ve
pulmener disfonksiyona yol açabilmektedir.
3.
Mitokondride
oksidatif
62, 99,100
fosforilasyonu
çözerler
ve
mikrozomal enzim aktivitelerinde değiĢiklikler oluĢturabilirler. Subsellüler
organellerin( lizozom gibi) bütünlüğünün kaybolmasına neden olabilirler.
4. Ayrıca DNA‘ nın nitrojen bazları ile
reaksiyona
girebilirler.62
MDA ölçümünün en yaygın metodu; 2-tiyobarbitürik asit
(TBA) reaksiyonuna dayanan spektrofotometrik ölçümüdür.101 Fakat TBA,
biyolojik
numunelerde
bulunabilecek
diğer
bileĢiklerle
reaksiyona
girebildiğinden, bu metodla ölçüm sonrası MDA ifade edilirken MDA
ifadesi yerine tiyobarbitürik asit reaktif bileĢikleri (TBARS) olarak ifade
edilmektedir.102
MDA‘nın ölçümünde spesifitenin artırılması için yüksek
basınçlı sıvı kromatografisinin (HPLC) kullanılması yaygındır.103 HPLC
analizleri, diğer yöntemlerde interferans veren bileĢiklerin ölçümünü
ortadan kaldırırlar. Spesifik olmaları yanında, hassas ve daha basit
39
olmaları nedeniyle MDA-TBA
komplekslerinin HPLC ile analizine yönelik
yöntemler daha güvenilirdir. UV veya florometrik dedektörlü, HPLC
kullanımı bu metodun seçiciliğini geliĢtirmiĢ ve hassasiyetini arttırmıĢtır.105
MDA tayini için, diğer bir metod, aldehitler ve ketonların
düĢük pH‘da 2,4-dinitrofenilhidrazinle (DNPH) reaksiyonuna dayanır ve
DNPH derivelerinden oluĢur ki bu deriveler 300-380nm olan bölgede güçlü
bir absorbans verirler. Bu metod plazmadaki, idrardaki ve diğer biyolojik
örneklerdeki MDA ve diğer aldehitler ve ketonların ölçümü için
kullanılmıĢtır.106
2.3.4. Serbest Radikallerle OluĢan Protein Oksidasyonu:
Proteinler,
serbest radikal hasarına duyarlı moleküllerdir.
Serbest radikallerin etkisi ile bu moleküllerin sülfhidril gruplarında hasar
meydana gelebilmektedir. Protein moleküllerin yapısı değiĢmekte ve
oksidasyon
reaksiyonları
sonucu
büyük
agregatlar
haline
dönüĢebilmektedirler. Serbest radikallerin protein molekülleri üzerindeki
etkileri ile oluĢan yapısal değiĢiklikler üçe ayrılır.100
1.Aminoastlerin modifikasyonu
2.Proteinlerin fragmantasyonu
3.Proteinlerin agregasyonu veya çapraz bağlanmalar
Serbest radikaller, polipeptit zincirlerinde fragmantasyona yol
açabilirler. Bu Ģekilde oksidatifmodifikasyon yolu ile sitozolik nötral
proteazlar
kritik
enzimlerin
yıkımını
gerçekleĢtirebilirler.
Aromatik
aminoasitler de oksidatif ataklara çok hassas moleküllerdir. Proteinin temel
yapısındaki
değiĢme,
antijenik
yapıda
değiĢmeye
ve
proteolize
hassasiyete neden olabilmektedir. Radikaller, enzim, nörotransmitter ve
40
reseptör
proteinlerinin
fonksiyonlarının
bozulmasına
da
neden
olabilmektedir.62
Proteinler serbest radikallere karĢı lipitlerden daha az
hassastırlar
ve
Proteinlerin
serbest
bileĢimine
baĢlayan
reaksiyon
radikallerden
bağlıdır.
Serbest
lipidler
kadar
etkilenme
oksijen
hızlı
ilerlemez.
dereceleri
aminoasit
radikallerinin
sülfür
içeren
aminoasitlere karĢı ilgisi fazladır. Sülfür radikalleri oksijenle birleĢerek
oksisülfür
radikallerini
oluĢtururlar.
Oksisülfür
radikalleri
biyolojik
moleküllerde hasar yapıcı etkiye sahiptir. Triptofan, tirozin, fenilalanin,
histidin, metiyonin ve sistein aminoasitini taĢıyan proteinler sülfür grubu
taĢır. IgG ve albümin çok sayıda disülfit bağı bulundurur. Serbest oksijen
radikalleri sülfür içeren bu maddelerle reaksiyona girince proteinlerin üç
boyutlu yapıları bozulur ve normal fonksiyonlarını yerine getiremezler.
Sitoplazma ve membrandaki proteinler, okside edici ajanlara maruz
kaldıktan sonra çapraz bağlanarak dimerleĢir ve ya daha büyük
agregatlara dönüĢür. Prolin ve lizin, oksijen radikallerine maruz kalırsa
nonenzimatik hidroksilasyona uğrarlar. 62,107
Protein oksidasyonu; hem ROS ile direkt hem de oksidatif
stresin sekonder ara ürünlerinin reaksiyonlarıyla indüklenen proteinlerin
kovalent modifikasyonu olarak tanımlanmaktadır.(ġekil 9.) Ġn vivo olarak
proteinlerde meydana gelen oksidatif değiĢiklikler, proteinlerin rol oynadığı
çeĢitli
hücresel
mekanizmalarının,
fonksiyonları
yapısal
etkiler.
proteinlerin,
Reseptörlerin,
transport
sinyal
sistemlerinin
ileti
ve
enzimlerin rol oynadığı hücresel olaylar oksidatif protein hasarından
etkilenir.108 Protein oksidasyonu, bir
çok mekanizmayla gerçekleĢebildiği
ve amino açil yan zincirlerinin hepsi oksidatif olarak modifiye olabildiği için
çok farklı tipte oksidatif protein modifikasyonları vardır.109 Oksidatif protein
modifikasyonlarının
biyokimyasal
sonuçları;
yan
zincir
gruplarının
oksidasyonu, omurganın fragmentasyonu, çapraz bağlanmalar, yanlıĢ
41
katlanmalar, konformasyon ve hidrofobik yapıda değiĢiklikler ve proteolitik
enzimlerde aktivite kaybı olarak sıralanabilir 110
Şekil 9: Metallerin katalizlediği bölge spesifik protein oksidasyonu 95
ROS‘un proteinlerle etkileĢimi sonucunda histidin, prolin,
arjinin, ve lizin gibi çok sayıda aminoasit kalıntısında ve/veya peptid
omurgasında meydana gelen hasar sonucunda protein karbonilleri (PCO)
ürünleri meydana gelir. Protein oksidasyonunun en yaygın olarak ölçülen
ürünü protein karbonilleridir. PCO düzeylerinin saptanması, oksidatif
protein hasarını belirlemede duyarlı bir yöntem olmasına rağmen belirli bir
aminoasit için spesifik değildir.111
Son yıllarda, yeni bir protein oksidasyon belirteci olan AOPP
(ileri düzey okside protein ürünleri) tespit edilmiĢtir. AOPP, ditrozin içeren
çapraz bağlı protein ürünleri olarak tanımlanır ve protein hasarının
saptanmasında güvenilir bir belirteç olduğu düĢünülmektedir. 112,113
AOPP‘nin oksidanların zararlı aktiviteleri konusunda yeni bir
moleküler temel oluĢturduğu ve oksidatif streste proinflamatuar etkili bir
42
medyatör gibi davrandığı ve immundisregülasyona katkısı olduğu
düĢünülmektedir.114,115
2.3.5. Serbest Radikallerle OluĢan Karbonhidrat Oksidasyonu:
Monosakkaritlerin otooksidasyonusonucu hidrojen peroksit,
peroksitler ve okzoaldehitler meydana gelir. Bu maddeler diyabet ve sigara
içimi ile iliĢkili kronik hastalıkların patolojisinde önemli rol oynarlar.
Oksalaldehitler; DNA, RNA ve proteinlere bağlanabilirler ve aralarında
çapraz bağlar oluĢturabilirler. Bu Ģekilde hücre bölünmesinde, kanser ve
yaĢlanmada önemli rol oynarlar.62
Enflamatuar eklem hastalıklarında sinovial sıvıya geçen
lökositlerden
extrasellüler
sıvıya
salınan
H2O2
ve
O2,
buradaki
mukopolisakkarit olan hyalünorik asidi parçalamaktadır. Gözün vitröz
sıvısında bol miktarda hyalünorik asit bulunduğundan, bunun oksidatif
hasarı katarakt oluĢumuna katkıda bulunmaktadır.62
2.3.6. Serbest Radikallerin Nükleik Asit ve DNA‘a Etkileri:
Ġyonize edici radyasyonla oluĢan serbest radikaller, DNA‘yı
etkileyerek hücrede mutasyona ve ölüme yol açarlar. Hidroksil radikali
deoksiriboz ve bazlarla kolaylıkla reaksiyona girer. Aktive olmuĢ
nötrofillerden kaynaklanan H2O2 membranlardan kolayca geçer ve hücre
çekirdeğine ulaĢarak DNA hasarına, hücre disfonksiyonuna ve hatta
ölümüne neden olabilir. Bu nedenle DNA, serbest radikallerden kolay
zarar görebilen açık bir hedeftir. Süperoksite maruz kalan DNA molekülleri
hayvanlara enjekte edildiğinde daha fazla antijenik özellik gösterirler ki bu
oldukça önemli bir etkidir çünkü sistemik bir hastalık olan sistemik lupus
eritamatozus ve romatoid artritte dolaĢımda anti-DNA antikorları bulunur.
43
Süperoksit ve hidrojen peroksitin enzimatik toplayıcıları hidroksil radikali
prekürsörlerinin konsantrasyonunu azaltarak DNA‘ı korur.62,107
2.4. Serbest Oksijen Radikallerine Karşı Savunma mekanizmaları
Reaktif oksijen türlerinin oluĢumunu ve bunlara bağlı hasarı
önlemek için vücutta birçok savunma mekanizması geliĢtirilmiĢtir. Bunlara
‗‘antioksidanlar ‗‘denir.62
2.4.1. Antioksidan etki tipleri
Antioksidanlar dört ayrı Ģekilde etki ederler:
1.
Toplayıcı
etki
(Scavenging
etki):
Serbest
oksijen
radikallerini tutma ya da çok daha zayıf yeni moleküle çevirme iĢlemine
‗‗toplayıcı
etki‘‘
denilmektedir.
Bilirubin,
antioksidan
enzimler,
trakeobronĢial mukus ve küçük antioksidan moleküller bu tip etki
göstermektedir. 62,116, 117
Süperoksit
dismutaz,
glutatyon
peroksidaz,
ferritin,
serüloplazmin ve metallotiyonein gibi metal bağlayıcı proteinler bu tür
etkiye örnektir.
2. Bastırıcı etki(Quencher etki ):Serbest oksijen radikalleriyle
etkileĢip, onlara bir hidrojen aktararak aktivitelerini azaltan ya da inaktif
biçime dönüĢtüren etki ‗‗ bastırıcı etki‘‘ olarak adlandırılmaktadır.
Vitaminlerden β-karoten, vitamin C ve vitamin E bu tarz bir etkiye
sahiptirler. Bilirubinin bu tarz antioksidan etkisi de vardır.62,118
44
3. Zincir kırıcı (Chain-breaking etki): Serbest oksijen
radikallerine bağlanarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyici etkiye
‗‗zincir kırıcı etki‘‘ denir. Bilirubin, hemoglobin, seruloplazmin ve mineraller
zincir kırıcı etki gösterirler. 62,119, 120
4. Onarıcı etki(Repair etki):Onarıcı etki üzerinde çalıĢmalar
devam etmektedir. Oksidatif hasar görmüĢ DNA molekülünü tamir eden
enzimler ve metiyonin sülfoksit redüktaz bu gruba örnek olarak
verilebilir.62,121,122
Organizmada, oksidan ve prooksidan yapılar arasında denge
söz konusudur. Bu dengenin oksidanların lehine kayması, değiĢik
düzeylerde hücresel hasarlara neden olmaktadır.
Antioksidanlar, oksidatif Ģu prensipler doğrultusunda koruma
sağlarlar:
123,124

Enzim aktivitesi üzerinden veya doğrudan kimyasal
reaksiyonlar yoluyla,

Oksijenden türeyen moleküllerin oluĢumunu en az
düzeye indirerek,

Radikallerle doğrudan kimyasal yolla temasa geçerek,

Reaktif
metabolitlerin
temizlenmesini
veya
bu
radikallerin daha az aktif ve toksik olmayan ürünlere dönüĢümünü
sağlayarak,

Zayıf reaktif türlerin daha zararlı türlere dönüĢümü için
gereksinim duyulan metal iyonlarını bağlayarak,

Hedef molekülde oluĢan hasarı onarma yoluyla,

Hasarın çok büyük olduğunda, hasara uğramıĢ
molekülü uzaklaĢtırarak.
45
Vücutta reaktif oksijen türlerinin düzeylerini kontrol altında
tutmak ve oluĢturabilecekleri hasarları engellemek için birçok savunma
mekanizmaları bulunmaktadır.60,125
Serbest
radikalleri
metabolize
eden,
serbest
radikal
oluĢumunu önleyen veya serbest radikallerin temizlenmesini artıran bu
maddelere antioksidan maddeler denilmektedir. Bu antioksidanlar endojen
ve eksojen kaynaklı olarak ikiye ayrılmaktadır.
60, 62,100
Hücre dıĢında ve hücrede farklı organellerde yerleĢerek
savunma mekanizmasında rol alan biyomoleküller enzimatik yapıda
olabilecekleri gibi non-enzimatik yapıda da olabilirler. 123,126,127
Enzimatik yapıdaki antioksidanlar içinde süperoksit dismutaz
(SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GSH-Px),
glutatyon
redüktaz ve glutatyon -S-transferaz sayılabilir.123,126
Enzimatik
tokoferoller,
β-karoten
sayılabileceği gibi
69,97**
yapıda
gibi
olmayanlar
vitamin
arasında
yapıya
askorbik
katılan
glutatyon, α-lipoik asit, ubikinon
asit,
antioksidanlar
89,123
, ürik asit89,
serüloplazmin, transferrin, selenyum gibi antioksidan özellik gösteren
maddeler de sayılabilir.89,123
Bunlardan glutatyon-redoks sistemi ilk akla gelen savunma
mekanizmalarından birini oluĢturmaktadır. Diğer antioksidanlarla birlikte bu
sistem ve bu sistem içindeki enzimler oksidatif hasara karĢı güçlü bir
savunma hattı oluĢtururlar.66,127 (ġekil 10) .
46
Şekil 10: Memeli Hücrelerinde Antioksidan Sistem128.
2.4.2. Nonenzimatik Yapıda Olan Antioksidanlar:
Ekzojen Kaynaklı Nonenzimatik Antioksidanlar: β-karoten,
vitamin C ve vitamin E.
Endojen Kaynaklı Nonenzimatik Antioksidanlar: Hemoglobin,
ferritin, miyoglobin, ürik asit, bilirubin, laktoferrin, transferrin, melatonin,
askorbik asit, albümin ve glutatyondur.
2.4.2.1. Glutatyon (GSH)
Glutatyon (y-glutamilsisteinilglisin), organizmada tiyol grubu
içeren, düĢük molekül ağırlıklı önemli bir tripeptiddir. DNA ve protein
47
sentezleri, enzim aktivitelerinin düzenlenmesi, hücre içi ve dıĢı transportlar
gibi hücresel fonksiyonları dıĢında baĢlıca antioksidan olarak hücre
savunmasında da önemli rolü vardır.129
GSH
birçok
enzimin
kofaktörüdür
(örneğin
HMGCoA
redüktaz). Tiroid hormon sentezinde rol oynar. GSH‘a antioksidan
özelliğini sisteinin tiyol grubu kazandırır. Serbest radikal ve peroksitlerle
reaksiyona girerek hücreleri oksidatif hasara karĢı korur. Bunun dıĢında
proteinlerdeki –SH gruplarını redükte halde tutar ve bu grupları
oksidasyona karĢı muhafaza eder. Demirin Fe+2 halde tutulmasını sağlar.
Böylece, protein ve enzimlerin inaktivasyonunu engeller hatta rejenere
olmalarını sağlar
Ekstrasellüler mesafede çok düĢük konsantrasyonlarda
bulunan GSH ‗ın en önemli kaynağı karaciğerdir. GSH, tüm memeli
hücrelerinde bol miktarda (0,5-10 mM) sentezlenir. Bu sentez iki
basamakta gerçekleĢir. Birinci basamakta, γ-glutamilsistein sentetaz isimli
enzim GSH'ın prekürsör amino asidleri olan glutamat ve sisteinden, γglutamilsisteinin oluĢumunu katalizler. Ġkinci basamakta ise, glutatyon
sentetaz, glisin ve γ-glutamil-sisteinden glutatyonu oluĢturur. GSH negatif
feed-back ile glutamilsistein oluĢum hızını ve böylelikle kendi sentezini de
denetler. Bu sentezde bir molekül GSH için 2 molekül ATP'nın hidrolizi
gerekir.130
48
2.4.3. Enzimatik Yapıda Olan Antioksidanlar:
2.4.3.1. Süperoksit Dismutaz (SOD; EC 1.15.1.1)
Bu enzim 1969 yılında McCord ve Fridovich tarafından izole
edilmiĢtir.55
SOD, substrat olarak serbest oksijen radikallerini kullanarak
süperoksit anyonunu hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dismute eden
bir metalloenzimdir.
SOD
O2˙- + O2˙-
H2O2
+
O2
Bu reaksiyon, süperoksit zincirleme radikal reaksiyonlarının
güçlü bir baĢlatıcısı olduğundan, bu reaksiyon ‗‘ oksidatif strese karĢı ilk
savunma‘‘
olarak
değerlendirilir.
Bu
sistem
sayesinde
hücresel
kompartmandaki süperoksit düzeyleri kontrol altında tutulmaktadır.
Aynı zamanda SOD, lipit peroksidasyonunu da inhibe eder.
SOD aktivitesi, yüksek oksijen kullanan dokularda fazladır. SOD‘ın
ekstrasellüler aktivitesi çok düĢüktür.
Memelilerde üç çeĢit SOD bulunmaktadır.131
1) Sitozolik SOD (Cu-ZnSOD, SOD1): Genellikle sitozolde ve
lizozomal fraksiyonlarda yer alır, fakat mitokondriyal boĢlukta da
bulunmaktadır. Ġki alt birimden oluĢmaktadır. Kofaktörleri çinko ve bakırdır.
Enzimin aktivitesinden bakır, stabilitesinden çinko sorumludur.
2) Mitokondrial SOD (Mn-SOD, SOD2): Mitokondride bulunur
ve tetramerik yapıdadır. Kofaktörü mangandır.
49
3)
Ekstrasellüler
SOD
(EC-SOD,
SOD3):
Tetramerik
yapıdadır ve ekstrasellüler bölümlere salgılanır. Kofaktörleri çinko ve
bakırdır. Ayrıca bazı bakterilerde Fe-SOD da saptanmıĢtır.
2.4.3.2. Glutatyon Peroksidaz (GSH-Px; EC.1.11.1.9) ve Glutatyon
Redüktaz (GR; EC.1.6.4.2)
GSH-Px,
sitozol
ve
mitokondrilerde
SOD
tarafından
oluĢturulan hidrojen peroksit ve yağ asidi hidroperoksitlerini daha az toksik
yağ asitlerine indirger. Kofaktör olarak glutatyonu (GSH) kullanmaktadır.
GSH-Px
ROOH + 2GSH
ROH + GSSG + H2O
GSH-Px, hücrede H2O2‘nin temizlenmesinden sorumlu iki
enzimden biri olup diğer enzim ise katalazdır. Glutatyon-GSH-Px sistemi
H2O2‘nin H2O‘ya indirgenmesini katalizlerken organik hidroperoksitleri de
parçalamaktadır.57
H2O2 ve organik peroksitlerin indirgenmesiyle oksitlenen
glutatyon, glutatyon redüktaz enzimi ve baĢlıca pentoz fasfat yolundan
sağlanan
NADPH
yardımıyla
indirgenerek
reaksiyonların
devamını
sağlar.62
Genel olarak GSH-Px‘ın H2O2‘e karĢı en belirgin savunma
sistemi olduğu düĢünülmektedir. Tetramerik yapıda olan enzim en çok
karaciğer ve eritrositte aktif olarak bulunmaktadır. Kalp, akciğer ve beyinde
orta, kasta ise düĢük aktivitede bulunur. %60-75‘i stoplazmada, %25-40‘ı
mitokondride yer alır.
50
GSH-Px‘ın aktivitesindeki azalma H2O2‘in artmasına ve
Ģiddetli hücre hasarına yol açar. Yapılan çalıĢmalarda kord kanı glutatyon
peroksidaz ve total antioksidan düĢüklüğü olan bebeklerde DNA hasarının
yüksek olduğu gösterilmiĢ ve doğumda oksijen radikallerinin oluĢumunun
arttığı ifade edilmiĢtir.132 Selenyuma bağımlı ve bağımsız iki tipi mevcuttur.
Selenyuma bağımlı olan GSH-Px (Se-GSH-Px) sitozol ve mitokondride
bulunmaktadır ve hem H2O2 hem de lipit hidroperoksitleri metabolize eder.
Selenyumdan bağımsız olan GSH-Px (non-Se GSH-Px) ise sadece lipit
hidroperoksitleri
metabolize
eder.
Bu
fonksiyonu
peroksidasyonunun baĢlamasını ve ilerlemesini önlemektedir.
ile
lipit
134
GR; hücresel GSH redox siklusundan sorumlu olup endojen
peroksitlerin detoksifikasyonu için önemlidir.135
GSH-Px
tarafından
H2O2
ve
diğer
lipit
peroksitlerin
yükseltgenmesi sırasında glutatyon, okside glutatyona dönüĢmektedir.
Oksidasyona uğramıĢ bu yapıyı tekrar kullanmak için redükte glutatyona
dönüĢtüren enzim glutatyon redüktazdır.62 ( ġekil 11)
2 GSH
NADP+
ROOH veya H2O2
Glutatyon redüktaz
Glutatyon peroksidaz
NADPH + H+
ROH veya H2O
GSSG
Glukoz 6-fosfat
Glukoz 6-fosfat
dehidrogenaz
Glukoz
Şekil 11: Glutatyon peroksidaz ve glutatyon redüktazın katalizlediği
reaksiyon.
51
GSH-Px peroksitleri temizlemek için hidrojen donörü olarak
GSH‘a ihtiyaç duymaktadır. Okside formu olan GSSG, glutatyon redüktaz
ile yeniden glutatyona dönüĢmektedir. Gerekli olan NADPH pentoz fosfat
yolundan sağlanmaktadır.69
2.4.3.3. Glutatyon-S-Transferaz (GST; EC 2.5.1.8)
Glutatyon-S-transferazlar,
hücresel
detoksifikasyon
ve
transporttan sorumlu iki protein alt birimden oluĢan multifonksiyonel
protein ailesidir. Genel olarak üç sitozolik ve bir de mikrozomal olmak
üzere dört ana gruba ayrılır. GST ailesi hepatositlerdeki baĢlıca detoksifiye
edici sistemdir.136
Ksenobiyotiklerin
biyotransformasyonunda
önemli
rol
oynamaktadırlar. BaĢta araĢidonik asit ve linoleat hidroperoksitleri olmak
üzere lipit hidroperoksitlere karĢı GST‘ler, selenyumdan bağımsız GSH-Px
aktivitesi gösterirler.
GST
ROOH + 2 GSH
GSSG + ROH + H2O
GST‘ler, glutatyonun reaktif metabolitlerle konjugasyonunu
sağlayarak organizmadan uzaklaĢmasını sağlamaktadır.137
Antioksidan
aktivitelerine
ilaveten
çok
önemli
baĢka
biyokimyasal fonksiyonlara da sahip olup hem, bilirubin ve bazı
kortikosteroidler gibi endojen maddeleri reversibl olarak bağlayarak
bunların hücre içinde transportunda görev alırlar. Bazı güçlü alkilleyici
ajanlara
doğrudan
kovalent
bağlanarak,
hücresel
proteinler
ve
makromolekülleri bu ajanların etkisinden korurlar. GST‘ler LTB 4 ve
prostaglandin sentezinde de rol oynarlar.62
52
2.4.3.4. Katalaz (CAT EC 1.11.1.6)
Katalaz peroksizomlarda bulunan bir enzimdir. H2O2 ‗i oksijen
ve suya parçalar. Katalaz; yapısında protoporfirin-IX ve dört tane Fe(hem)
grubu bulunan hemoproteindir. Karaciğer, böbrek, eritrositlerde ve müköz
membranda aktivitesi yüksektir. 138
Katalaz
2 H2O2
2 H2O + O2
Aynı zamanda fenol ve alkollerin de detoksifikasyonunu
sağlayan katalaz; hidrojen peroksitin fenton reaksiyonları ile demir ve bakır
iyonları tarafından reaktif hidroksil radikaline dönüĢümünü engeller.139
2.4.3.5. Glukoz 6 Fosfat Dehidrogenaz (G6PDH, EC 1.1.1.49)
Pentoz fosfat (heksoz monofosfat) yolunun oksidatif faz hız
kısıtlayıcı enzimidir. ATP üretilmeyen bu yolun; indirgeyici reaksiyonlar
(yağ asiti ve steroid biyosentezi gibi) için NADPH üretmek ve nükleik asit
biyosentezi için 5 karbonlu üniteleri sağlamak gibi iki önemli iĢlevi vardır.
Bu iĢlevlerinden dolayı hücresel metabolizma ve oksidatif stres arasında
anahtar bir role sahiptir. Glukoz tüketimindeki ana yollar glikoliz ve pentoz
fosfat yoludur. Pentoz fosfat yolu; karaciğer, böbrek, eritrosit, adrenal
korteks,
yağ
dokusu
ve
laktasyondaki
meme
bezinde
aktiftir.
Eritrositlerdeki pentoz fosfat yolunda üretilen NADPH; okside olmuĢ
glutatyonun; FAD içeren flavoprotein enzimi olan glutatyon redüktaz ile
indirgenmiĢ glutatyona çevrilmesini sağlar. Daha sonra indirgenmiĢ
glutatyon;
glutatyon
tepkimeyle
H2O2‘i
peroksidaz enzimi
eritrositlerden
tarafından
uzaklaĢtırır.
katalizlenen
NADPH;
bir
thioredoksin
redüktaz reaksiyonundaki indirgeyici ekivalanları sağlamakla birlikte
katalaz aktivitesi için de gereklidir. G6PDH eksikliği; oksidan ajanların
53
detoksifiye edilememesi sonucu oluĢan hemolitik anemi ile karakterize X‘e
bağlı ressesif bir hastalıktır. Ġnsanlarda hastalığa neden olan en sık
görülen enzim anormalisidir.140
54
3. MATERYAL VE YÖNTEM
Bu çalıĢma; Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya
Ana Bilim Dalı AraĢtırma Laboratuvarında ve Gazi Üniversitesi Deneysel
AraĢtırmalar Merkezi‘nde (GÜDAM) gerçekleĢtirilmiĢtir.
3.1. Deney Grupları
Deney hayvanları Gazi Üniversitesi
Hayvan Laboratuvarı
(GÜDAM)‘ dan temin edilmiĢtir. Bilimsel araĢtırma için Gazi Üniversitesi
Tıp Fakültesi, Hayvan Etik Kurul‘undan izin alınmıĢtır.
ÇalıĢmada 250-300 gr ağırlığında wistar albino cinsi 20 adet
erkek rat kullanıldı. Standart rat diyetiyle beslenen denekler 12 saat
aydınlık, 12 saat karanlık sürecinde tutuldu.
Kalp dokularında lipit peroksidasyon seviyeleri, glutatyon
düzeyleri,
glutatyon
peroksidaz,
glutatyon-S-transferaz,
katalaz
ve
süperoksit dismutaz aktiviteleri ölçüldü.
3.1.1. Deney Hayvanlarının Hazırlanması
ÇalıĢmada hayvanlar 2 eĢit gruba ayrıldı.
Grup I- Kontrol grubu: Ratlara 8 hafta boyunca standart rat
diyeti verildi. (n=10)
Grup II- CCl4 grubu: Ratlara 8 hafta boyunca haftada 3 kez
intraperitoneal olarak 1/10 (v/v) oranında zeytinyağı içinde çözülmüĢ CCl4
verildi(n=10). CCl4;
55
1.hafta: 0.3 ml/kg
2.hafta: 0.7 ml/kg
Sonraki 6 hafta boyunca: 1ml/kg CCl4 verildi.141
Son uygulamadan 24 saat sonra ratlar genel anestezi ve kas
gevĢetici (40 mg/kg, Alfamin ve 2,5 mg/kg Alfazyne karıĢtırılarak,
intramüsküler uygulandı) uygulanarak feda edildi, kardiyak kan örnekleri
alındı, kalp dokuları çıkartıldı. Dokular, %0,9‘luk NaCl ile yıkandıktan sonra
biyokimyasal inceleme için alüminyum folyoya sarılarak sıvı azotta
donduruldu. Analiz gününe kadar -80° C‘de saklandı.
3.2. Kullanılan Aletler
Hassas terazi ( Schimadzu, Libror, AEG 220 )
Homojenizatör (Virtis-Virtisheur)
Vorteks (Heidolf Reax 200)
Benmari (Heto)
Santrifuj (Hermle Z 380K )
Soğutmalı santrifuj(Damon IEC, B-20A soğutmalı, Hermle Z 323K
Spektrofotometre (Schimadzu, UV1601)
Tecan Eliza okuyucu ve yıkayıcı
pH metre (Jenway)
Otomatik ve cam pipetler
Manyetik karıĢtırıcı
Diğer laboratuar gereçleri
56
3.3. Yöntemlerin Uygulanması
Kalp Doku Örneklerinin Homojenize Edilmesi
Kalp doku örnekleri derin dondurucudan çıkartıldı ve 1/10
oranında
50
mM
Tris-HCI
(pH=7.4)
tamponda
(400mgr
kalp
dokusu+3600ml Tris-HCI) , buz içinde, soğukta homojenize edilerek ham
ekstratlar (homojenat) elde edildi. Ham ekstraktlar soğutmalı santrifüjde
15.000 rpm‘de 15 dakika santrifüj edilip, süpernatantlardan, katalaz,
glutatyon-S-transferaz aktiviteleri, doku malondialdehit, doku protein ve
doku glutatyon düzeyi tayini yapıldı 142
Kalan süpernatan, 3/5 (v/v) oranında hazırlanmıĢ olan
kloroform/etanol karıĢımı ile 1/1 (v/v) oranında muamele edilip, 5000 x
g‘de +4°C‘de 30 dakika santrifüj edildi. Üst tabaka(extraksiyon) süperoksid
dismutaz, glutatyon peroksidaz enzim aktivitesi tayini ve protein tayini için
ayrıldı.143
3.3.1. Lowry Protein Tayini (Doku protein tayini) 143
Kullanılan Reaktifler:
A reaktifi: % 2‘lik Na₂CO₃ içinde 0.1 N‘lik NaOH
B1 reaktifi: %2‘lik Na-K tartarat
B2 reaktifi: %1‘lik CuSO4
Folin ciocalteu’s fenol
Standart:1 mg/ml bovine serum albumin (BSA) kullanıldı.
C solüsyonu: 0.5 ml B1 + 0.5 ml B2 + 16.5 ml A
Folin reaktifi (F.c): 1 hacim Folin ciocalteu‘s fenol + 1 hacim
distile su.
57
Deneyin yapılışı:(Tablo 1)
Tablo 1. Doku Protein Tayini
Tüpler
BSA
Numune
Distile su
Csolüsyonu
Kör
-
-
100 μl
2 ml
Standart-1
10 μl
-
90 μl
2 ml
Standart-2
20 μl
-
80 μl
2 ml
Standart-3
40 μl
-
60 μl
2 ml
Numune
-
20 μl
80 μl
2 ml
Deney tüpleri vortekslendikten sonra, 15 dakika bekletildi.
Daha sonra deney tüplerine 200 μl folin reaktifi eklenerek iyice
vortekslendi ve 1 saat karanlıkta bekletildi. Tüpler 750 nm‘de köre karĢı
okundu.
Doku Protein Standart Grafiği
y = 0,0083x + 0,008
R2 = 0,9999
0,4
0,35
Absorbans
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
10
20
30
40
50
Protein (m g/m l)
Grafik1: Doku Protein Standart Grafiği
58
Doku Protein Standart Grafiğinden yararlanılarak örneklerin
protein miktarı mg/ml olarak hesaplandı.
3.3.2. Kalp Dokusu Malondialdehit (MDA) Analizi
Doku MDA düzeyleri Ohkawa ve ark.
144
yöntemine göre
ölçüldü. Bu yöntemin ilkesi; süpernatandaki proteinlerin sodyum dodesil
sülfat (SDS) ile bağlanmasıyla, örnekte bulunan MDA‘nın tiobarbitürik asit
(TBA) ile ortam pH‘sı 3.5 olduğu Ģartlarda oluĢturduğu komplekse bağlı
kırmızı rengin spektrofotometrik ölçümüne dayanır.
Kullanılan Reaktifler:
% 8,1 Sodyum Dodesil Sülfat (SDS): Distile su içinde hazırlandı
% 0.8 Tiobarbitürik asit (TBA): Distile su içinde hazırlandı
% 20 Asetik asit: Distile su içinde hazırlandı (NaOH ile pH=3.5‘a
ayarlandı)
n-butanol/ piridin: (15:1, v/v)
59
Deneyin yapılışı:(Tablo 2)
Tablo 2. Doku MDA Tayini
Numune
Standart 1
Standart 2
Standart 3
Standart
-
50 μl
25 μl
12,5 μl
Distile su
150 μl
150 μl
175 μl
187,5 μl
Numune
50 μl
-
-
-
SDS
50 μl
50 μl
50 μl
50 μl
TBA
375 μl
375 μl
375 μl
375 μl
Asetik asit
375 μl
375 μl
375 μl
375 μl
0
Tüpler 60 dakika, 95 C’de su banyosunda kaynatıldı.
Bundan hemen sonra örnekler soğutularak,
Distile su
250 μl
250 μl
250 μl
250 μl
n-
1250 μl
1250 μl
1250 μl
1250 μl
butanol/piridin
Daha sonra 4000 rpm‘de 10 dakika santrifüj edilip üst faz 532
nm.‘de n-butanole karĢı okundu.
MDA standart olarak 1,1,3,3 tetraetoksi propan kullanılarak
standart grafik elde edildi (grafik 2) ve örneklerin absorbans değerlerinin
nmol/L cinsinden MDA miktarı saptandı. Çıkan sonuç homojenizasyon
sırasındaki dilüsyon faktörü ile çarpılıp sonuçlar ‗nmol/g
doku‘ cinsinden
belirlenmistir.
60
Doku MDA standart Grafiği
y = 0,0058x + 0,0125
R2 = 0,9985
0,14
0,12
Absorbans
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0
5
10
15
20
25
[MDA] nmol/ml
Grafik 2: Doku MDA Standart Grafiği
3.3.3. Kalp Dokusunda Glutatyon ( GSH ) Düzeyi Tayini:
Sigma
No:CS1020)
Fluorometric
Glutathione
Assay
Kit
(Catalog
ile ölçüldü. Bu kit plazma membranını kolayca geçebilen
serbest formda düĢük floresans veren, ancak redükte glutatyona
bağlandığında GST ile katalizlenen reaksiyonda güçlü floresans oluĢturan
monoklorobiman (monochlorobimane) kullanmaktadır.
Deneyin yapılışı:(Tablo 3)
Dokular tartılarak 1/10 oranında (w/v)
0,05 M Tris-HCl
(pH:7.4) tamponunda buzlu su banyosu içinde teflon uçlu homojenizatör
ile homojenize edildi. Elde edilen homojenat +4°C‘de 15000 rpm‘de 15
dakika santrifüjlendi. Süpernatandan redükte glutatyon çalıĢıldı. 1mM
Redükte Glutatyon (GSH) standardı assay buffer ile hazırlanıp, stok
standart olarak kullanıldı.
61
Tablo 3. Doku Glutatyon (GSH) Tayini
1mM
GSH std
(µl)
Numune
(µl)
Assay
Buffer
(µl)
GST
Substrat
(µl)
(µl)
_
_
92,5
5
2,5
1,3 nmol
GSH std
1,3
_
91
5
2,5
2,5 nmol
GSH std
2,5
_
90
5
2,5
5 nmol
GSH std
5
_
87,5
5
2,5
10 nmol
GSH std
10
_
82,5
5
2,5
Numune
_
20
72,5
5
2,5
Kör
Florometre eksitasyon dalga boyu 390 nm, emisyon dalga
boyu 478 nm olacak Ģekilde ayarlanmıĢtır.
Doku Glutatyon Standart Grafiği
y = 7475,5x + 5420
R2 = 0,9969
90000
80000
70000
Floresans
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
0
2
4
6
8
10
12
Kons antras yon (nm olGSH)
Grafik 3: Doku Glutatyon Standart Grafiği
62
Sonuçlar standart grafiğe göre (grafik 3) hesaplanmıĢtır.
Doku proteinine bölünerek nmol GSH / mg protein cinsinden verilmiĢtir.
3.3.4. Kalp Dokusunda Glutatyon Peroksidaz (GSH-Px) Aktivitesinin
Ölçümü:
Glutatyon
peroksidaz aktivitesi Paglia DE, Valentina
ve
ark.145 metoduna göre tayin edildi. Okside glutatyon, NADPH varlığında
glutatyon redüktaz tarafından indirgenir. Bu arada NADPH, NADP +' ye
oksitlenir. Metodun prensibi 340 nm dalga boyunda NADPH‘ın NADP‘ye
oksitlenmesi sonucu karıĢımın optik dansitesindeki azalmanın ölçümü
esasına dayanır.
Kullanılan Reaktifler:
Tris-HCl: 0.05 M pH=7.4
Fosfat tamponu: 50 mM pH:7.0 Na2HPO4/KH2PO4 (5mM EDTA içeren)
NADPH: 3mM tampon ile hazırlanır.
NaN3: 2 M
H2O2: % 30 luk stoktan 100 mM olarak, tamponda hazırlanır.
GSH: 150 mM olacak Ģekilde tamponda hazırlanır.
Glutatyon Redüktaz: (200 U/mg protein) 1N
(NH4)2SO4 ile 10 kat
seyreltilerek kullanılır.
Deneyin Yapılışı:( Tablo 4)
Numune tüplerine Fosfat tamponu + EDTA, NaN3, GSH,
NADPH, GSH-red ve numune konuldu. 340 nm‘de, distile suya karĢı
sıfırlandıktan sonra, 1-2 dakika absorbans değiĢimi takip edildi. Bu kör
olarak değerlendirildi. Absorbans değiĢimi durduğunda ve ortama H2O2
ilave edilir edilmez absorbans azalması 0., 1., 2., 3.dakikalarda okundu.
63
Tablo 4. Doku GSH-Px Tayini
Reaktifler
Numune
Fosfat tamponu + 5mM
2560µl
EDTA
NaN3
30 µl
GSH
100 µl
NADPH
100 µl
Glutatyon Redüktaz
10 µl
Numune
100µl
H2O2
100 μl
H2O2 ilave edilerek reaksiyon baĢlatıldı. 3 dakika boyunca
340 nm dalga boyunda numune absorbansı azalması izlendi. Dakikadaki
absorbans değiĢimi hesaplandı. NADPH için molar absorbsiyon katsayısı
olan ε =6.22 x 103 M-1 cm-1 kullanılarak ∆A= am .∆C.1 formülüne göre
dakika baĢına okside olan nmol NADPH hesaplandı. Süpernatandan da
Lowry Metodu ile protein tayini yapılarak glutatyon peroksidaz aktivitesi
IÜ/mg protein olarak verildi.
3.3.5. Kalp Dokularında Glutatyon-S-Transferaz Aktivitesinin Ölçümü
Glutatyon-S-transferaz aktivitesi, Habig ve arkadaĢlarının,
GSH ile 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB)‘nin 340 nm‘de absorbans artıĢı
ile izlenebilen bir konjugasyonla tioeter bağı oluĢturmasına dayanan
metodu ile çalıĢıldı.146
64
Kullanılan Reaktifler:
Tris-HCl Tamponu (homojenizasyon tamponu): 0.05 M pH:7.4
CDNB: 25 mM (saf etanolde çözülür)
GSH: 50 mM (tamponda çözülür)
Fosfat Tamponu:100 mM pH:6 Na2HPO4/KH2PO4
Deneyin Yapılışı: (Tablo 5)
Dokular tartılarak 1/10 oranında (w/v)
0.05 M Tris-HCl
(pH:7.4) tamponunda buzlu su banyosu içinde teflon uçlu homojenizatör
ile homojenize edildi, elde edilen homojenat +4°C‘de 15000 rpm‘de 15
dakika santrifüjlenip. süpernatandan GST aktivitesi çalıĢıldı.
Tablo 5. Doku GST Tayini
Reaktifler
Numune
Fosfat Tamponu
1850 µl
CDNB
50 µl
GSH
50 µl
Numune
50 µl
65
Spektrofotometre 340 nm‘de distile su ile sıfırlandı. Numune
tüplerine Fosfat Tamponu +CDNB +GSH eklenerek okunan absorbans kör
olarak alındı. Daha sonra tüp üzerine numune eklenerek 1., 2. ve 3.
dakikalardaki absobans değiĢimi takip edildi. Absorbans artıĢı köre karĢı
25°C‘de 3 dakika boyunca izlendi.
Hesaplama:
CDNB için molar absorbsiyon katsayısı olan ε = 9,6 M-1cm-1
kullanılarak hesap yapıldı. 1 Ünite GST aktivitesi 25°C‘de ve pH=6‘de
dakikada 1 µmol ürün oluĢturan enzim miktarı olarak tanımlandı.
Süpernatanda Lowry yöntemi ile protein tayini yapıldı.
Sonuçlar nmol/ dakika/ mg protein olarak verildi.
3.3.6. Kalp Dokusunda Katalaz Aktivitesi Ölçümü:
Doku katalaz aktivitesi Aebi ve arkadaĢlarının metoduna göre
çalıĢıldı. Metod;240nm dalga Boyunda hidrojen peroksidin katalaz
tarafından parçalanmasına bağlı olarak değiĢen absorbans miktarının
spektrofotometrik yöntem ile tespiti esasına dayanır.147
Kullanılan Reaktifler:
Tris-HCl Tamponu (homojenizasyon tamponu): 0.05 M pH:7.4
Fosfat Tamponu: 50 mM pH:7 Na2HPO4/KH2PO4
H2O2 Çözeltisi: %30 luk H2O2
Tamponlanmış H2O2 Çözeltisi: 50 mM pH:7 fosfat tamponunun içine
çözelti absorbansı ortalama 0.500 olacak Ģekilde %30 luk H2O2 ‗ den
katılarak hazırlandı.
66
Deneyin Yapılışı: (Tablo 6)
Dokular tartılarak 1/10 oranında (w/v)
0,05 M Tris-HCl
(pH:7.4) tamponunda buzlu su banyosu içinde teflon uçlu homojenizatör
ile homojenize edilip. Elde edilen homojenat +4°C‘de 15000 rpm‘de 15
dakika santrifüjlenip, süpernatandan katalaz aktivitesi çalıĢıldı.
Tablo 6. Doku Katalaz Tayini
Reaktifler
Numune
Tamponlanmış H2O2
2990 µl
Çözeltisi
Numune
10µl
Kör olarak, içinde H2O2 olmayan fosfat tamponu kullanıldı.
Numune tüpüne tamponlanmıĢ H2O2 çözeltisi konup üzerine numune
eklenir eklenmez küvet alt üst edilip absorbans değiĢimi 240 nm ‗ de 5 dk
takip edildi. Dakikadaki absorbans azalması hesaplandı. H2O2 için molar
absorbsiyon katsayısı olan ε = 0.040 mM-1cm-1 kullanılarak hesap yapıldı.
Süpernatandan da Lowry Metodu ile protein tayini yapılarak
sonuçlar IU/mg protein olarak verildi.
3.3.7. Kalp Dokusunda Süperoksid Dismutaz (SOD) Ölçümü:
Doku SOD aktivitesi, Yi-Sun‘un tanımladığı, ksantinin ksantin
oksidaz ile O2˙- oluĢturması ve bunun da NBT ile renkli bir bileĢik
oluĢturarak bu renk Ģiddetinin spektrofotometrik olarak ölçülmesi esasına
dayanır. Ortamdaki SOD aktivitesi ne kadar fazla ise O 2˙-‗yi ortadan
kaldıracağı için oluĢan rengin Ģiddeti o kadar az olacaktır.148
67
ksantin oksidaz
Ksantin
O2˙- + NBT
O2˙Renkli BileĢik
Kullanılan Reaktifler:
Stok ksantin: 3 mmol/L
NBT: 150 μmol/L
Na2CO3: 400 mmol/L
BSA: 1mg/mL
CuCl2: 0.8 mmol/L
EDTA: 0.6 mmol/L
Ksantin oksidaz (XO) enzim çözeltisi: 25 Ü ‗lik enzim 1/100 (v/v) 2 M‘lık
amonyum sülfat çözeltisi ile dilüe edilir.
Kloroform/etanol: 3/5 (v/v)
Reaktif karışımı: 80 ml 10 kat dilüe edilmiĢ stok ksantin çözeltisi + 40 ml
EDTA + 40 ml NBT + 24 ml Na2CO3 + 12 ml BSA karıĢtırılır.
Deneyin Yapılışı: (Tablo 7)
100 mg doku 1/10 oranında (w/v) 0.05 M Tris-HCl (pH:7.4)
tamponunda buzlu su banyosu içinde teflon metal uçlu homojenizatör ile
homojenize edildi. 15000 x g‘de +4°C‘de 15 dakika santrifüj edildi.
Süpernatan, kloroform/etanol karıĢımı ile 1/1 (v/v) oranında karıĢtırıldı.
5000 x g‘de +4°C‘de 30 dakika santrifüj edildi. Enzim aktivitesi tayini ve
protein tayini bu süpernatandan yapıldı. Protein miktarları Lowry Metodu
ile ölçüldü.
68
Tablo 7. Doku SOD Tayini
Kör
Numune
Reaktif Karışımı
2900μl
2850 μl
Numune
--
100μl
Distile su
50μl
--
XO çözeltisi
50μl
50 μl
Vortekslendi 20 dakika oda ısısında inkübasyon edilip
1000 μl
CuCl2
1000 μl
Sonra tüplere 0.8 mM CuCl2‘den eklenip ve 560 nm‘de distile
suya karĢı okundu.
Hesaplama:
% inhibisyon =
(Kör abs - Numune abs ) x 100
Kör abs.
Metodun prensibine göre; % 50 inhibisyon 1 Ü aktiviteye
karĢılık gelir. SOD enzim tayini sonucu elde edilen sonuçlar protein
miktarlarına bölünerek Ü/mg protein olarak verildi.
3.3. İstatistiksel Değerlendirme
Elde edilen verilerin istatistiksel analizi SPSS 15.0 (Statistical
Package for the Social Sciences Program, for windows 15.0) ve Microsoft
69
Excel (for windows XP) programları ile yapılmıĢtır. Değerlendirmede
Kruskal-Wallis varyans analizi ve gruplar arasındaki farklılığı tespit etmek
için Mann-Whitney U testi ve spearman korelasyon testi kullanılmıĢtır.
Ayrıca gruplar spearman korelasyon analizine tabi tutulmuĢtur. p<0.05
istatiksel olarak anlamlı kabul edilmiĢtir.
70
4. BULGULAR
Sonuçlar tüm tablo ve grafiklerde ortalama ± standart hata olarak
verilmiĢtir.
p<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiĢtir.
Kalp dokularına ait malondialdehit (nmol/gr.doku), glutatyon
aktivitesi (nmol/mg prot), glutatyon peroksidaz aktivitesi (IU/mg.prot),
glutatyon-S-transferaz
aktivitesi
(nmol/dk/mg.prot),
katalaz
aktivesi
(IU/mg.prot.) ve superoksit dismutaz aktivitesi (U/mg.prot) düzeylerinin
istatistiksel sonucları (ortalama ±standart hata) tablo 8 ‗ de sunulmuĢtur.
Tablo 8. Kalp dokularına ait istatistiksel sonuçlar ortalama ± standart hata
olarak verilmiĢtir, p değerleri verilmiĢtir.
MDA
Glutatyon
GSH-Px
GST
Katalaz
SOD
nmol/gr.doku
nmol/mg.pro.
IU/mg.prot
nmol/dk/mg.
IU/mg.prot
U/mgr.prot
prot
Grup I
(Kontrol
Grubu)
115.36±14.97
0.05±0.01
1.49±0.15
76.56±8,02
11.00±1.48
4.06±0.70
195.86±12.39
0.09±0.01
2.89±0.40
65.31±5.82
9.20±1.06
12.50±2.12
0.001
0.364
0.597
0.005
N=10
GrupII
(karbon
tetraklorür
Grubu) N=10
p
0.002
0.034
71
4.1. Kalp Dokusu MDA Düzeyleri
Kalp dokusu MDA düzeyleri için kontrol grubu ( grup I ) ile
karbon tetraklorür grubu (grup II) karĢılaĢtırıldığında aralarında istatistiksel
olarak anlamlı fark bulundu (p=0.002; p<0.05).
Tablo 9: Kalp MDA düzeyleri (Ortalama ± Standart Hata)
MDA (nmol/g doku)
(1) Kontrol
115.36±14.97
n=10
(2)Karbontetraklorür 195.86±12.39
n=10
P=0.002
250
200
KALP MDA(nm ol./gr.doku)
150
100
50
0
Grup I
Grup II
Grafik 4: Kalp MDA düzeyleri (Ortalama ± Standart Hata)
72
4.2. Kalp Dokusu Glutatyon Düzeyleri
Kalp dokusu glutatyon düzeyleri için kontrol grubu (grup I ) ile
karbon tetraklorür grubu (grup II) karĢılaĢtırıldığında aralarında istatistiksel
olarak anlamlı fark bulundu. (p=0.034; p<0.05).
Tablo 10: Kalp Glutatyon düzeyleri (Ortalama ± Standart Hata)
Glutatyon
(nmol/mg.prot)
(1) Kontrol
(2)
Karbontetraklorür
0.05±0.01
n=10
0.09 ±0.01
n=10
p=0.034
0,12
0,1
KALP GLUTATYON
(nm ol/m gr.prot.)
0,08
0,06
0,04
0,02
0
Grup ı
Grup II
Grafik 5: Kalp Glutatyon düzeyleri (Ortalama ± Standart Hata)
73
4.3. Kalp Dokusu Glutatyon Peroksidaz Aktivitesi
Kalp dokusu Glutatyon Peroksidaz Aktivite düzeyleri için
kontrol
grubu
(grup
I
)
ile
karbon
tetraklorür
grubu
(grup
II)
karĢılaĢtırıldığında aralarında istatistiksel olarak anlamlı fark bulundu.
(p=0.001; p<0.05).
Tablo 11: Kalp Glutatyon Peroksidaz Aktivitesi (Ortalama ± Standart Hata)
Glutatyon Peroksidaz
(IU/mg protein)
(1) Kontrol
(2)
Karbontetraklorür
1.49±0.15
n=10
2.89±0.04
n=10
p= 0.001
3,5
3
2,5
KALP GPX
(nmol/dk/mgr.prot)
2
1,5
1
0,5
0
Grup I
Grup II
Grafik 6: Kalp Glutatyon Peroksidaz Aktivitesi (Ortalama ± Standart Hata)
74
4.4. Kalp Dokusu Glutatyon-S-Transferaz Aktivitesi
Kalp dokusu Glutatyon S Transferaz Aktivite düzeyleri için
kontrol grubu ( grup I ) ile karbon tetraklorür grubu ( grup II )
karĢılaĢtırıldığında aralarında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunamadı.
p=0.364; p>0.05).
Tablo 12: Kalp Glutatyon-S-Transferaz Aktivitesi (Ortalama ± Standart
Hata)
Glutatyon-S-Transferaz
(nmol/dk/mgr. protein)
(1) Kontrol
76.56 ± 8.02
n=10
p= 0.364
(2)
Karbontetraklorür
65.31 ± 5.82
n=10
90
KALP GST
(nmol/dk/mgr.prot)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Grup I
Grup II
Grafik 7: Kalp Glutatyon-S-Transferaz Aktivitesi (Ortalama ± Standart Hata)
75
4.5. Kalp Dokusu Katalaz Aktivitesi
Kalp dokusu Katalaz Aktivite düzeyleri için kontrol grubu
(grup I ) ile karbon tetraklorür grubu (grup II) karĢılaĢtırıldığında aralarında
istatistiksel olarak anlamlı fark bulunamadı. (p=0.597; p>0.05).
Tablo 13: Kalp Katalaz Aktivitesi (Ortalama ± Standart Hata)
Katalaz
(IU/mg protein)
(1) Kontrol
11.00±1.48
n=10
p=0.597
(2)
Karbontetraklorür
9.20±1.06
n=10
14
KALP KATALAZ
(IU/mg.prot)
12
10
8
6
4
2
0
Grup I
Grup II
Grafik 8: Kalp Katalaz Aktivitesi (Ortalama ± Standart Hata)
76
4.6. Kalp Dokusu SOD Aktivitesi
Kalp dokusu SOD Aktivite düzeyleri için kontrol grubu (grup I)
ile karbon tetraklorür grubu (grup II) karĢılaĢtırıldığında aralarında
istatistiksel olarak anlamlı fark bulundu (p=0.005; p<0.05).
Tablo 14: Kalp SOD Aktivitesi (Ortalama ± Standart Hata)
SOD
( U/mg protein)
(1) Kontrol
4.06±0.70
n=10
p=0.005
(2) Karbontetraklorür 12.50±2.12
14
n=10
KALP SOD
(U/mgr.prot.)
12
10
8
6
4
2
0
Grup I
Grup II
Grafik 9: Kalp SOD Aktivitesi (Ortalama ± Standart Hata)
77
4.7. Spearman Korelasyon Analizi
Parametreler arasındaki korelasyonu incelemek amacıyla
yaptığımız spearman korelasyon analizi tablo 15‘de gösterilmiĢtir.
** güçlü korelasyon
*
zayıf korelasyon
Tablo 15: Spearman korelasyon analizi sonuçları
MDA
MDA
GSH
GPx
GST
CAT
SOD
--
r= 0.18
p= 0.447
GSH
GSH-Px
GST
CAT
SOD
r= 0.18
r= 0.681**
r= - 0.167
r= - 0.290
r= 0.585**
p= 0.447
p= 0.001
p= 0.482
p= 0.215
p= 0.007
r= 0.422
r= 0.087
r= - 0.077
r= 0.639**
p= 0.064
p= 0.715
p= 0.747
p= 0.002
r= - 0.350
r= - 0.482*
r= 0.675**
p= 0.131
p= 0.031
p= 0.001
r= 0.701**
r= - 0.208
p= 0.001
p= 0.380
--
r= 0.681**
r= 0.422
p= 0.001
p= 0.064
r= - 0.167
r= 0.087
r= - 0.350
p= 0.482
p= 0.715
p= 0.131
r= - 0.290
r= - 0.077
r= - 0.482*
r= 0.701**
p= 0.215
p= 0.747
p= 0.031
p= 0.001
r= 0.585**
r= 0.639**
r= 0.675**
r= - 0.208
r= - 0.329
p= 0.007
p= 0.002
p= 0.001
p= 0.380
p= 0.157
--
--
--
r= - 0.329
p= 0.157
--
78
Spearman korelasyon analizi sonuçlarına göre:
Doku MDA ile doku GSH-Px aktivitesi arasında güçlü pozitif korelasyon
bulunmuĢtur.(r=0.681** ; p=0.001) (Grafik 10)
250,00
MDA
200,00
150,00
100,00
50,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
GPX
Grafik 10: Doku MDA düzeyleri ile doku GSH-Px aktivitesi arasındaki
korelasyon
79
Doku MDA düzeyleri ile doku SOD aktivitesi arasında güçlü pozitif bir
korelasyon bulunmuĢtur.( r=0.585** ; p=0.007) (Grafik 11)
250,00
MDA
200,00
150,00
100,00
50,00
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
SOD
Grafik 11: Doku MDA düzeyleri ile doku SOD aktivitesi arasındaki
korelasyon
80
Doku GSH ile doku SOD aktivitesi arasında güçlü pozitif bir korelasyon
bulunmuĢtur. ( r=0.639**; p=0.002) ( Grafik 13.)
0,20
GSH
0,15
0,10
0,05
0,00
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
SOD
Grafik 12: Doku GSH düzeyleri ile doku SOD aktivitesi arasındaki
korelasyon
81
Doku GSH-Px ile doku Katalaz aktiviteleri arasında zayıf negatif bir
korelasyon bulunmuĢtur. (r= - 0.482* ; p=0.031) ( Grafik 12)
Grafik 13: Doku GSH-Px aktivitesi ile doku Katalaz aktivitesi arasındaki
korelasyon
82
Doku GSH-Px ile doku SOD aktivitesi arasında güçlü pozitif bir
korelasyon bulunmuĢtur.( r=0.675** ; p=0.001) (Grafik 14)
6,00
5,00
GPX
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
SOD
Grafik 14: Doku GSH-Px düzeyleri ile doku SOD aktivitesi arasındaki
korelasyon
83
Doku GST ile doku Katalaz aktivitesi arasında güçlü pozitif bir
korelasyon bulunmuĢtur.( r=0.701** ; p=0.001) (Grafik 15)
120,00
GST
100,00
80,00
60,00
40,00
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
KATALAZ
Grafik 15: Doku GST düzeyleri ile doku Katalaz aktivitesi arasındaki
korelasyon.
84
4.8.Histopatolojik Bulgular:
4.8.1. Ġmmünhistokimyasal Yöntem
Tespit edilen dokular alıĢılagelmiĢ ıĢık mikroskop izleme
yönteminden geçirilerek parafin bloklar elde edildi. Hazırlanan parafin
bloklardan polilizinli lamlara 4-5 m kalınlığında kesitler alındı.
Camlar öncelikle deparafinize edilebilmek amacıyla15‘X 2
ksilol‘e etkin bırakıldı. Daha sonra 10‘ar dakika sırasıyla %100, %96 ve
%80‘lik alkol serilerinden geçirildi.
Dehidrate edilen dokular alkolden arındırılmak amacıyla 5‘X2
kez distile sudan geçirildikten sonra, doku içerisinde formaldehitin
kapattığı reseptör bölgelerinin açığa çıkarılmasını sağlamak amacıyla 1M
citrate tamponu (Lab Vision, USA) ile mikrodalga fırında retriver iĢlemi
gerçekleĢtirildi.
Daha sonra, 15 dakika %3‘lük hidrojen peroksit (TA-015-HP,
Lab Vision, USA) ile etkin bırakılan dokulardan endojen peroksidaz
aktivitesi bloke edildi. ĠĢlem sonrasında PBS (phosphate buffer saline)
(LabVision) (pH7.4) ile camlar yıkandı.
Yıkanan camlara 5 dakika UltraV block (TA-015-UB, Lab
Vision, USA) uygulanarak özgün olmayan bağlanmaların engellenmesi
sağlandı. Bu iĢlemden sonra dokular yıkanmadan primer antikor
aĢamasına geçildi. Bu amaçla kesitler caspase-3 primer antikoru
(poliklonal anti-rabbit), (Lab Vision, USA) 1 saat bekletildi.
85
Daha sonra PBS ile yıkanan camlara 20 dakika biyotinli
sekonder antikor (TR-015-BN, Lab Vision, USA) uygulanarak primer
antikora bağlanması sağlandı. PBS ile yıkanan camlar 20 dakika
streptavidin peroksidaz enzim kompleksine (TS-015-HR, Lab Vision, USA)
etkin bırakıldı, böylece camlarda enzimin biyotine bağlanması sağlandı.
Son olarak ortama kromojen AEC (3-amino-9-ethylcarbazole)
(TA-015-HAS, Lab Vision, USA) eklenerek yaklaĢık 10 dakika bekletildi ve
gözle görülebilir ürünün ortaya çıkması sağlandı.
Zemin boyası olarak Mayer‘in hematoksilen‘i (0B524092,
Merck) kullanıldı. Negatif boyama primer antikor aĢamasında yapıldı. Bu
Ģekilde boyanan camlar ultramount ile lamelle kapatılıp, bilgisayar
donanımlı fotoıĢık mikroskopta (DM 4000M, Leica, Wetzlar, Germany)
değerlendirildi.
4.8.2.Bulgular:
Hematoksilen ve eozinle boyanmıĢ, kontrol grubuna ait
kesitlerde normal myokardiyal yapı izlendi (resim1). CCl4 grubunda ait
kesitlerde myokardiyal kas lifleri arasında ve damar çevresinde orta
dereceli ödem ve bazı kas liflerinde dalgalanmalar saptandı (Resim 2,3).
Caspase-3 primer antikoruyla indirek immünohistokimyasal yöntemle
yapılan boyamada kontrol grubunda eser miktarda tutulum izlenirken
(Resim 4), CCl4 grubunda orta dereceli tutulum saptandı (Resim 5).
CCI4 tipik bir toksik ajandır ve toksik etkisi serbest radikal
üretimi ile olmaktadır.CCI4 yağda çözünebildiği için hücre membranından
geçebilir.CCI4 verildiğinde karaciğer, böbrek ve kalp dokusu gibi organlara
dağılır ve depo edilir.36
86
CCI4 ‗den
karaciğerde
sitokrom
P450
aktivasyonu
ile
triklorometil(CCI3-) radikali oluĢur. Bu da, hemen hücre zarı ile reaksiyona
girer.27 DoymamıĢ yağ asitleri ile kovalent bağ oluĢturarak oksijen
varlığında hızla triklorometil peroksite(CCI3O2-) veya hidrojen atomlarını
kaybetmiĢ olan kloroform formuna dönüĢür.28,29
Bu radikaller çoklu doymamıĢ yağ asitlerinden hidrojen
alarak lipit peroksidasyon zincirini baĢlatırlar. Lipit peroksidasyonu biyolojik
membranların
yapısını
dramatik
olarak
değiĢtirir,
patogenezinde rol oynayan Ģiddetli hücre hasarına neden olur.
hastalıkların
30,31
Sonuç olarak CCl4 kalp kası hücrelerinde bir takım
değiĢikliklere neden olmaktadır. Bu değiĢiklikler sonucunda caspase-3
yolağı aktive olarak apoptotik süreç baĢlar ve kalp kası hücrelerinin
ölümüne neden olur.
87
Resim 1: Kontrol grubuna ait kalp kası dokusu enine kesiti izleniyor. Kalp
kası
hücreleri
(↑),
kan
damarları (KD)
normal
yapıda
izleniyor.
(x100büyültme,Hematoksilen&Eozin)
88
Resim 2: CCl4 grubuna ait kesitte, normal histolojik yapının bozulduğu,
özellikle perivasküler bölgelerde orta dereceli ödem izleniyor (↑). Kalp kası
hücreleri (KK) bağ dokusu (BD) ve adipoz dokuda (AD) morfolojik
değiĢiklikler dikkati çekiyor. (x100 büyültme, Hematoksilen&Eozin)
89
Resim 3: CCl4 grubuna ait büyük büyültmede hücreler arasında ödem (↑)
ve damar dıĢına çıkmıĢ lökositler (*) izleniyor. Arada bağ doku (BD), kan
damarları
(KD)
ve
fibroblastlar
(F)
izleniyor.
(x400
büyültme,
Hematoksilen&Eozin)
90
Resim 4: Kontrol grubuna ait resimde kalp kası hücrelerinde caspase-3
immünreaktivitesi eser miktarda (↑) izleniyor. (x400, Anti-caspase-3,
immünperoksidaz)
91
Resim 5: CCl4 grubuna ait kesitte orta dereceli ve yaygın caspase-3
immünreaktivitesi (↑) izleniyor (x400, Anti-caspase-3, immünperoksidaz).
92
5. TARTIŞMA ve SONUÇ
Ġlaç ve ksenobiotiklerin zehirlemesi veya iyonize radyasyon
gibi çeĢitli faktörler tarafından, oksidatif stres ve serbest radikallerin üretimi
artar.Tiyobarbütirik
reaktif
madde
konsantrasyonlarının
artması
ve
antioksidan enzim mekanizmasında defekt olması, bu dokularda oksidatif
stres parametrelerinin görülmesine neden olur.8
Ksenobiyotik olan karbon tetraklorür (CCI4 ) renksiz, berrak
ve uçucu bir sıvıdır.20 Önceleri kuru temizleme, yangın söndürme, tahıl
dezenfeksiyonu ve böceklerle mücadelede yararlanılan bu kimyasal
bileĢik; günümüzde petrol ürünleri, çeĢitli yağlar, vernik, cila, reçine
çözücüsü ve organik bileĢiklerin imalatında kullanılmaktadır.20,23
Çevreden insan vücuduna günlük ortalama 0,1µg CCI4 giriĢi
olduğu tahmin edilmektedir. BirleĢik Devletler Çevre Koruma Dairesi(EPA)
hayvan deneylerinden elde edilen sonuçlara dayanarak CCI4‘ü insan için
olası kanserojen sınıfına(Grup B2) dahil etmiĢtir.20,23
CCI4 solunan hava, su, gıda alımı ve deriden temas yoluyla
vücuda girer. Karaciğer, beyin, böbrek, kaslar, yağ dokusu ve kanda daha
yüksek
konsantrasyonlarda olmak üzere tüm dokulara dağılır.
20,24,149
Vücuttan atılımı baĢta solunum yoluyla ve çok az miktarda dıĢkı ve idrar
yoluyladır.
CCI4 tipik bir toksik ajandır ve toksik etkisi serbest radikal
üretimi ile olmaktadır.CCI4 yağda çözünebildiği için hücre membranından
geçebilir.CCI4 verildiğinde karaciğer, böbrek ve kalp dokusu gibi organlara
dağılır ve depo edilir.CCI4‘ün alım ve eliminasyon süresi dokudaki yağ
oranına ve dokudaki kan perfüzyonuna bağlıdır.CCI4 beyin ve karaciğer
tarafından hızla alınır.36 CCI4‘ün deneysel çalıĢmalarda inhalasyon yoluyla
93
verilmesinin, oral verilmesine göre daha toksik etkili olduğu görülmüĢtür
Çünkü CCI4 ‗ün vücut içine giriĢinde asıl ana yol inhalasyondur.35,36
CCI4 ‗ün intraperitoneal olarak verilmesiyle oluĢan (%50-60)‘lık mortalite
oranı, subkutan olarak verildiğinde %20‘lere kadar inebilir.37
CCI4 ‗den
karaciğerde
sitokrom
P450
aktivasyonu
ile
triklorometil(CCI3-) radikali oluĢur. Bu da, hemen hücre zarı ile reaksiyona
girer.27DoymamıĢ yağ asitleri ile kovalent bağ oluĢturarak oksijen
varlığında hızla triklorometil peroksite(CCI3O2-) veya hidrojen atomlarını
kaybetmiĢ olan kloroform formuna dönüĢür.28,29
Bu radikaller çoklu doymamıĢ yağ asitlerinden hidrojen
alarak lipid peroksidasyon zincirini baĢlatırlar. Lipit peroksidasyonu
biyolojik membranların yapısını dramatik olarak değiĢtirir, hastalıkların
patogenezinde rol oynayan Ģiddetli hücre hasarına neden olur.30,31
Reaktif
oksijen
radikalleri
Alzheimer,
multiple
skleroz,
diyabet, karaciğer sirozu ve hepatosellüler karsinomanın patogenezinden
sorumlu tutulmaktadır.32-34
Hayvan dokularında birçok metabolik reaksiyon sırasında
süperoksit anyonu, hidroksil radikali, hidrojen peroksit ve oldukça yüksek
reaktiviteye
sahip
oksijen
radikalleri
oluĢur.150,151
Oksidatif
stres;
antioksidan mekanizmayı düĢürerek, lipit peroksidasyonunu artırır ve
karaciğerde fibrozise neden olur.
8
Bu nedenle lipit peroksidasyonu
fibrozisli inflamatuar hastalıklarda önemlidir.
152,153
. Oksidatif stresin birçok
hastalığın patolojisinin baĢlamasında ve ilerlemesinde önemli bir rol
oynadığı bilinmektedir. Miyokard enfarktüsü gibi kardiyolojik hastalıklar,
nörolojik hastalıklar, astım, diabetes mellitus, romatoid artrit gibi
romatolojik hastalıklar, kanser ve yaĢlanma dahil birçok hastalığın oksidatif
stresle iliĢkisi gösterilmiĢtir.2-7
94
Bazı çalıĢmalar CCI4‘ün hedef organının sadece karaciğer
olmadığını, kalp, böbrek ve beyin gibi diğer organlarda da lipit
peroksidasyonuna neden olduğunu göstermiĢtir.
Ġnsan ve rat karaciğerinin temel yapısı birbirine benzerdir.154
Bu nedenle CCI4‗e bağlı oksidatif etki ile oluĢan hepatik ve diğer
dokulardaki hasarın gösterilmesinde deneysel model olarak ratların
kullanımı kabul edilmiĢtir.44,155
Bizim çalıĢmamızda 250-300 gr ağırlığında wistar albino cinsi
yirmi adet erkek rat kullanılmıĢtır. Hayvanlar rastgele 2 eĢit gruba
ayrılmıĢtır. Grup I (Kontrol grubu) ratlara 8 hafta boyunca standart rat
diyeti verilmiĢtir. Grup II (CCl4 grubu) ratlara 8 hafta boyunca haftada 3
kez intraperitoneal olarak 1/10 (v/v) oranında zeytinyağı içinde çözülmüĢ
CCl4 verilmiĢtir. CCl4 1.hafta 0.3ml/kg, 2.hafta 0.7ml/kg, sonraki 6 hafta
boyunca 1ml/kg dozlarda kullanılmıĢtır.149 Son uygulamadan 24 saat
sonra ratlar genel anestezi ve kas gevĢetici uygulanarak feda edilmiĢ, kalp
dokuları çıkartılmıĢtır. Kalp dokularında lipit peroksidasyon ürünü olan
MDA düzeyleri ölçülmüĢtür. Ayrıca bu dokularda GSH seviyeleri, GSH-Px,
GST, CAT ve SOD aktiviteleri belirlenmiĢtir. Dokuların histopatolojik ve
immünhistokimyasal
boyama
teknikleriyle
değerlendirmesi
yapılarak
çalıĢma sonuçlarının görsel olarak ortaya konulması sağlanmıĢtır.
Fizyolojik Ģartlarda da organizmada radikaller oluĢtuğu
bilinmektedir. Oksijen türevi radikaller; süperoksit radikali ve hidroksil
radikaline kaynak sağlayan hidrojen peroksitin artıĢına neden olmaktadır.
Bunlara bağlı lipit peroksidasyonunun göstergesi olan MDA da artıĢ
beklenir.
N.Botsoglou
ve
ark.156
ratlar
üzerinde
yaptıkları
bir
çalıĢmada; CCI4‗ü 1ml/kg olacak Ģekilde %50 yağlı parafin içinde, tek doz
95
intraperitoneal olarak vererek ratların serum, kalp, karaciğer ve böbrek
dokularında MDA düzeylerinin anlamlı bir Ģekilde artıĢ gösterdiği
belirtilmiĢtir.
Güven ve ark.157 CCI4 ile oluĢturdukları oksidatif strese karĢı
kefirin anti-oksidan etkisini araĢtırdıkları çalıĢmada; swiss albino cinsi
farelere yedi gün süreyle, CCI4 1,5ml/kg olacak Ģekilde distile su içinde
çözdürülüp oral olarak verilmiĢtir. CCI4 verilen farelerin karaciğer ve
böbrek dokusunda MDA düzeyinin arttığı ifade edilmiĢtir.
Güven ve ark.158 CCI4 kullanarak kazlar üzerinde yaptığı
baĢka bir çalıĢmada; bir gruba 1ml/kg diğer gruba 1,5ml/kg olacak Ģekilde
haftada üç kez 12 hafta boyunca oral olarak CCI 4 verilmiĢ, CCI4‘ün
1,5ml/kg olarak verildiği grupta daha fazla olmak üzere CCI4 ‗ün her iki
dozunda da karaciğer ve böbrek dokusunda MDA düzeyinin arttığı
belirtilmiĢtir.
Karadeniz ve ark.159 CCI4‘ü wistar albino cinsi ratlara 10ml/kg
olacak Ģekilde intraperitoneal olarak 7 gün verdikten sonra karaciğer, kalp
ve böbrek dokularında MDA düzeyinin kontrol grubuna göre istatistiksel
olarak arttığını ifade etmiĢlerdir.
Özer ve ark.160 kardioprotektif etkili, genel anestestezik bir
ajan olan sevofluran ile ratlar üzerinde yaptıkları bir çalıĢmada; kalp
dokusunda MDA düzeyinin kontrol grubuna göre anlamlı bir artıĢ
gösterdiği söylenmiĢtir.
Konjestif kalp yetmezliğine neden olduğu için klinik kullanımı
sınırlı olan adriamycinle yapılan bir çalıĢmada; Dawley cinsi diĢi ratlara 2
hafta süresince total doz 15mg/kg olacak Ģekilde 6 doz intraperitoneal
96
adriamycin
verildiğinde,
lipit
peroksidasyon
ürünü
olan
TBARS
seviyelerinin kalp dokusunda arttığı rapor edilmiĢtir.161
Ratlarla yapılmıĢ diğer bir araĢtırmada 2 ay süresince
haftada 2 kez her 100gr vücut ağırlığı için 0,3ml CCI4 subkutan olarak
verilen ratların karaciğer ve böbrek dokularında TBARS ve konjuge
dienlerin(CD) arttığı ve bu artıĢın lipit peroksidasyonu için bir gösterge
olduğu ifade edilmiĢtir.162
Bizim çalıĢmamızda kalp dokusu MDA düzeyleri ölçülmüĢtür.
Kontrol grubu (grup I) ile CCl4 grubu (grup II) karĢılaĢtırıldığında, kontrole
göre CCI4 grubu MDA düzeylerinde anlamlı istatistiksel artıĢ bulunmuĢtur
(p=0.002; p<0,05). CCl4 ile yapılan diğer çalıĢmalar bizim çalıĢmamızı
destekler niteliktedir.
Glutatyon organizmada tiyol grubu içeren, düĢük molekül
ağırlıklı önemli bir tripeptitdir. DNA ve protein sentezleri, enzim aktivitesi
düzenlenmesi, hücre içi ve dıĢı transportlar gibi hücresel iĢlevlerin dıĢında
baĢlıca antioksidan olarak hücre savunmasında da rolü vardır. ĠndirgenmiĢ
glutatyon, içerdiği tiyol grubu aracılığı ile hücre içinde redoks potansiyeli
yüksek bir ortam sağlayarak oksidatif hasarlardan hücreyi koruduğu
bilinmektedir 163,164
CCI4
‗ün
içinde
yer
aldığı
ksenobiyotiklerin
detoksifikasyonunda GSH‘ın rolü önemlidir.157 Bu nedenle GSH‘ın en
önemli kaynağı karaciğerdir, ancak tüm memeli hücrelerinde sentezlenir.
Farklı uygulama yöntemi ve farklı dozlarda CCI4 verilerek
yapılan çeĢitli çalıĢmalarda; karaciğer ve böbrek dokularında lipit
peroksidasyon ürünlerinin arttığı, buna karĢılık GSH seviyesinin anlamlı bir
azalma gösterdiği rapor edilmiĢtir.157,165,162,166
97
Bizim çalıĢmamız gibi kalp dokusunda CCI4 verilerek doku
glutatyon
düzeyleri
çalıĢılmıĢ
bir
araĢtırmaya
rastlanmamıĢtır.
Sonuçlarımız diğer dokulardan farklı olarak kontrol grubu (grup I) ile
karbon tetraklorür grubu (grup II) GSH düzeyleri kıyaslandığında karbon
tetraklorür grubu GSH düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı bir artıĢ
göstermektedir (p=0,034; p<0,05).
Stanislawa Szymonik ve ark.167 yaptığı bir çalıĢmada CCI4
verilen ratların çeĢitli dokularındaki CAT, SOD ve GSH-Px aktivitesi
incelenmiĢtir. ÇalıĢmada Wistar cinsi erkek ratlar kullanılmıĢtır I.Grup:
Kontrol grubu olarak kullanılmıĢtır. II.grup: 1 gün 0,5ml/kg intrapertoneal (5
mmol/kg) CCI4 verilen, III.grup: 3 gün süreyle 0,5ml/kg intrapertoneal (5
mmol/kg) CCI4 verilen grup olarak belirtilmiĢtir. Ratlarların karaciğer, kalp,
beyin ve böbrek dokusunda CAT, SOD ve GSH-Px aktivitesi incelenmiĢtir.
Karaciğer dokusunda CCI4 verildikten 24 saat sonra ve tüm deney
süresince kontrole göre CCl4 verilen gruplarda SOD ve GSH-Px
aktivitesinde anlamlı bir değiĢiklik olmamıĢtır. Ancak CAT düzeyinde
önemli artıĢlar gözlenmiĢtir.167 Bu sonuçların karaciğerde SOD ve GSH-Px
gen
expresyonlarının
baskılanmıĢ
olacağını
akla
getirdiğini
ifade
etmiĢlerdir.167
Stanislawa Szymonik ve ark.167 yaptığı bu çalıĢmada beyin
dokusunda CCI4 verildikten 24 saat sonra ve deney süresince SOD ve
CAT aktivitesi önemli ölçüde azalırken GSH-Px aktivitesinin tüm çalıĢma
süresince istatistiksel olarak anlamlı bir artıĢ gösterdiği, beyin dokusunda
hidrojen peroksidin detoksifikasyonunda GSH-Px‘ın CAT‘dan daha önemli
olduğu, çünkü beyin dokusunda CAT miktarının az olup, GSH-Px‗ın lipit
peroksidasyonuyla doğrudan etkileĢime girebileceği rapor edilmiĢtir.168,169
Bu sonuçlara göre beyin dokusunda çoklu doymamıĢ yağ asitlerinin
konsantrasyonunun ve aerobik metabolik aktivitenin yüksek olmasının,
CCI4 verildikten sonra meydana gelen reaktif oksijen ürünlerinin
98
oluĢturduğu peroksidasyona karĢı, beyin dokusunu hassas bir organ
haline getirmiĢ olabileceği belirtilerek, oksidatif strese karĢı beyin
dokusunun karaciğerden daha farklı bir savunma mekanizması olduğu ileri
sürülmüĢtür.
Beyin
dokusunda
sitokrom
P450
ve
araĢidonik
asit
seviyelerinin karaciğer dokusuna göre çok düĢük olduğu rapor edilmiĢtir.
Beyindeki antioksidan sistem kapasitesi sınırlıdır.
168,170,171
Bazı çalıĢmalar
beyin dokusundaki doğal antioksidan defans sisteminin periferal dokulara
göre daha sınırlı olduğunu göstermiĢtir.
172,173
Yine aynı çalıĢmada kalp dokusunda CCI4 verildikten 24 saat
sonra GSH-Px, CAT ve SOD aktivitelerinde anlamlı bir artıĢ tespit edildiği,
CCI4 ‗ün oluĢturduğu oksidatif strese karĢı kalbi korumak için bu artıĢın
olduğu ifade edilmiĢtir.167 CAT ve GSH-Px aktivitesinin artması kalpte
hidrojen peroksitin arttığının göstergesi olarak kabul edilmiĢtir.
Stanislawa Szymonik ve ark.167 yaptığı bu çalıĢma bizim
sonuçlarımızı desteklemektedir. Bizim araĢtırmamızda CCI4 verilen grupta
kalp dokularında kontrol grubuna kıyasla SOD ve GSH-Px enzim
aktivitelerinde anlamlı istatistiksel artıĢ tespit edilmiĢtir (sırayla p=0.005;
p˂0.05 ve p=0.001; p˂0.05). ÇalıĢmamızda CAT enzim aktivitesindeki
azalma istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıĢtır (p=0.597; p>0.05 )
Rajesh ve ark.162 yaptığı çalıĢmada ratlara 2 ay süresince
haftada 2 defa 0,3ml/100gram doku olacak Ģekilde CCI4 subkutan olarak
verilmiĢtir. Ratların 2 ay sonundaki vücut ağırlıkları takip edilmiĢ, karaciğer
ve böbrek dokusunda lipit peroksidasyon ürünlerinden TBARS ve konjuge
dien miktarı ile SOD, GSH-Px, CAT enzim aktivitelerine ve GSH
seviyelerine bakılmıĢtır. CCI4 verilen grupdaki ratların vücut ağırlığında
önemli kayıplar olduğu görülmüĢ, her iki dokuda da lipit peroksidasyon
ürünleri anlamlı bir Ģekilde artarken; SOD, GSH-Px, CAT enzim
aktivitelerine ve GSH seviyelerinde anlamlı bir azalma olduğu belirtilmiĢtir.
99
SOD, CAT ve peroksidaz enzimleri antioksidan enzimler olup reaktif
oksijen türlerine karĢı destekleyici bir savunma ekibi oluĢtururlar. 8,174
Karaciğerde malondialdehit ile çapraz bağlanmaya bağlı enzimlerin
inaktive olması ve karaciğerde lipit peroksidasyonunun artmasına bağlı
olarak CCI4 verilen grupda SOD aktivitesinin azaldığı ifade edilmiĢtir.162
Lipit peroksidasyonunun daha fazla artması süperoksit
radikallerinin daha fazla artarak birikmesine neden olur. GSH lipofilik
bağlanarak konjugasyon reaksiyonları için bir enzim görevi görür.CCI 4
toksisitesi sırasında ilaç metabolizmasının total bir inhibisyona uğradığı ve
bu nedenle de çalıĢmada GSH aktivitesinin azalmıĢ olduğu rapor
edilmiĢtir.162
Glutatyon-S-transferazlar,
hücresel
detoksifikasyon
ve
transporttan sorumlu iki protein alt birimden oluĢan multifonksiyonel
protein ailesidir. Genel olarak üç sitozolik ve bir de mikrozomal olmak
üzere dört ana gruba ayrılır. GST ailesi hepatositlerdeki baĢlıca detoksifiye
edici sistemdir.136
GST; ksenobiyotiklerin biyotransformasyonunda önemli rol
oynamaktadırlar.
konjugasyonunu
GST‘ler,
sağlayarak
glutatyonun
reaktif
organizmadan
metabolitlerle
uzaklaĢmasını
sağlamaktadır.175
Ġncelememizde kalp dokusu GST aktiviteleri için kontrol
grubu (grup I) ile CCl4 grubu (grup II) karĢılaĢtırıldığında CCl4 grubunda
GST aktiviteleri kontrol grubuna (grup I) göre azalmıĢ bulunmuĢtur, ancak
bu azalma istatistiksel olarak anlamlı değildir( p=0.364; p˂0.05).
Güven ve ark.157 yaptığı bir çalıĢmada; 7 gün boyunca 1,5
ml/kg oral CCI4 verilen farelerin karaciğer ve böbrek dokusunda MDA,
100
GSH, GSH-Px, GST ve CAT incelenmiĢtir. CCI4 verilen farelerin karaciğer
dokusunda MDA seviyeleri kontrol grubuna göre anlamlı bir artıĢ
gösterirken GSH, GSH-Px ve GST düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı
bir düĢüĢ gözlendiği, CAT düzeyindeki azalmanın istatistiksel olarak
anlamlı bulunmadığı belirtilmiĢtir. Bu çalıĢmada böbrek dokusunda; MDA
ve
GPH-Px
düzeyleri
kontrol
grubuna
göre
anlamlı
bir
artıĢ
gösterirken,GSH ve GST düzeylerinde anlamlı bir azalma görüldüğü, CAT
düzeyindeki artıĢın istatistiksel olarak anlamlı bulunmadığı belirtilmiĢtir.
CCI4 grubuna, 2 gün süresince, 1ml/kg vücut kitlesi olacak
Ģekilde sıvı parafin içinde (1:1 v/v ) oral olarak verilerek yapılan çalıĢmada,
farelerin karaciğer ve böbrek dokusunda TBARS, SOD, CAT, GST ve
GSH seviyelerine bakılmıĢ, karaciğer ve böbrek dokusunda; SOD, CAT,
GST ve GSH düzeyleri kontrol grubuna göre anlamlı bir Ģekilde azalırken,
TBARS düzeyleri anlamlı olarak arttığı rapor edilmiĢtir.165
Karadeniz ve ark.159 CCI4 verilerek hasar oluĢturulan ratların
karaciğer, kalp ve böbrek dokuları üzerine geleneksel Çin Tıbbında
kullanılan Ginsengin antioksidan etkisini araĢtırdıkları bir çalıĢmada;
Wistar Albino cinsi ratlar kullanılmıĢ, kontrol grubuna 7 gün süreyle i.p
serum fizyolojik uygulanırken, eĢ zamanlı olarak CCI4 grubuna 10ml/kg
olacak Ģekilde bir kez CCI4 enjekte edilmiĢtir. Gruplar 7 gün takip edilip
karaciğer, kalp ve böbrek dokularında MDA, NO, GSH, SOD ve GSH-Px
çalıĢılmıĢtır. Ġlk günden itibaren uygulanan ilaç ve yöntemler sonrası
ratlardaki ölüm oranlarına bakılmıĢ; kontrol grubunda ölüm yokken CCI4
grubunda dört ölüm tespit edilmiĢtir.
Karadeniz ve ark.159 yaptığı bu çalıĢmada CCI4 verilen
grupda karaciğer, kalp ve böbrek dokusunda güçlü bir oksidatif stres
oluĢtuğu, buna bağlı olarak oksidatif enzim (GSH-Px, SOD) aktivitesi ve
GSH
konsantrasyonunun
belirgin
olarak
azalırken,
MDA
ve
NO
101
seviyelerinin
arttığı
belirtilmiĢtir.
Antioksidan
olarak
kullandıkları
ginsenge+CCI4 grubunda, CCI4 verilen grupla kıyaslandığında kalp
dokusunda MDA ve NO düzeylerinde anlamlı bir azalma görülürken,
oksidatif
enzimler
konsantrasyonunun
olan
GSH-Px,
istatistiksel
SOD
olarak
anlamlı
aktivitesi
bir
ve
GSH
Ģekilde
arttığı
söylenmiĢtir. Bu sonuçlarda bizim çalıĢmamızı ve ulaĢılan sonuçları
doğrular nitelikteliktedir.
ÇalıĢmamızda
antioksidan
kullanılmadı,
ancak
kalp
dokusundaki doğal antioksidan savunma mekanizması güçlü bir Ģekilde
etkisini göstererek glutatyon düzeyi, GSH-Px ve SOD aktivitesi CCI4
verilen grupda artmıĢtır.
Konjestif
kalp
yetmezliğinin
geliĢmesine
neden
olan
adriamycin kullanılarak yapılan bir çalıĢmada Dawley cinsi diĢi ratlara 2
hafta süre ile 6 doz, toplam doz miktarı 15mg/kg olacak Ģekilde
intraperitoneal adriamycin verilmiĢ, kalp dokusunda kontrol grubuna
kıyasla TBARS seviyelerinin çok arttığı, SOD ve GSH-Px enzim
aktivitelerinin anlamlı Ģekilde azaldığı, CAT enzim aktivitesinde anlamlı bir
artıĢ olduğu ancak CAT protein düzeyindeki artıĢın önemli düzeyde
olmadığı belirtilmiĢtir.161
Güven ve ark.158 CCI4 kullanarak kazlar üzerinde yaptıkları
çalıĢmada karaciğer ve böbrek dokusunda MDA, CAT, GSH-Px ve G6PD
seviyelerine bakılmıĢ; MDA, CAT, GSH-Px ve G6PD seviyelerinde anlamlı
bir artıĢ olduğu rapor edilmiĢtir. Ksenobiotiklerin detoksifikasyonunda
karaciğerdeki CAT, GSH-Px, SOD ve G6PD ‗ın önemli rol oynadığı,
antioksidan enzim düzeyleri azalırsa karaciğerin zarar görebileceği
belirtilmiĢtir.
Kardiotoksik etkisi olan doxorubicin ile yapılan baĢka bir
çalıĢmada; doxorubicin verildikten sonraki 2. ve 14. Günlerde kalp
102
dokusunda SOD, CAT, GSH-Px ve glutatyon redüktaz (GR) düzeylerine
bakılmıĢ. SOD, CAT, GSH-Px ve (GR) düzeylerinin istatistiksel olarak
anlamlı bir artıĢ gösterdiği ifade ediliĢtir.176
Genel anestezik olan sevofluran kullanılarak yapılan baĢka
bir çalıĢmada MDA, SOD ve GSH-Px düzeylerinde anlamlı bir artıĢ varken
CAT düzeyindeki artıĢ istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıĢtır.160
Tarımda kullanılan ve bir insektisid olan endosülfan ile
yapılan baĢka bir çalıĢmada; kalp dokusunda endosülfan kullanılan grupda
GSH-Px, SOD ve CAT düzeylerinin arttığı gösterilmiĢtir.177
Kalp üzerine toksik etkili baĢka maddelerle yapılan bu
çalıĢmalarda lipit peroksidasyon düzeyi artarken SOD ve GSH-Px enzim
aktivitelerinin artması bizim çalıĢmamızda elde ettiğimiz sonuçlarla
uyumludur.
Antioksidan enzim aktivitelerinin karaciğerde kalpden daha
fazla olduğu bazı çalıĢmalarda kanıtlanmıĢtır.168 Ancak oksidatif stresden
sonraki patolojik değiĢiklikler kalp dokusunda karaciğerden daha fazla
olduğunun ifade edildiği çalıĢmalar vardır.178
SOD, CAT ve GSH-Px enzimleri antioksidan enzimler olup
reaktif oksijen türlerine karĢı destekleyici bir savunma ekibi oluĢtururlar.162
Antioksidan
enzimlerden
glutatyon
peroksidaz
(GSH-Px)
kalpde,
miyositlerin sitozolünde bulunur. GSH-Px hidrojen peroksit ve lipit
peroksitlerin indirgenmesini katalizler. Bu reaksiyon esnasında glutatyon
(GSH) okside olarak, glutatyon disülfid (GSSG) oluĢur.24 Daha sonra bu
glutatyon disülfid, glutatyon redüktaz ve kofaktör olarak NAPDH ile
katalizlenen bir reaksiyon ile yeniden glutatyona indirgenir. Ancak hidrojen
peroksit ve lipit peroksitlerinin ileri derecede arttığı durumlarda, glutatyon
rejenerasyonu ihtiyaca yetmez ve lipit peroksidasyonu önlenemez. 179
103
Myokardiyumda enzimatik ve non-enzimatik anti-oksidatif
sistem bulunmaktadır. Mitokondriyal CuZnSOD ve MnSOD tarafından
süperoksid anyonların hidrojen perokside dismutasyonu ve oluĢan bu
hidrojen peroksidin GSH-Px ve CAT tarafından degregasyonu ile fizyolojik
Ģartlarda oluĢan reaktif oksijen metabolitlerinin sitotoksik etkisi sınırlanmıĢ
olur. Serbest radikaller ile antioksidanlar arasındaki denge, patolojik
durumlarda oksidatif stresin artması ile göreceli olarak serbest radikallerin
artıĢı
lehine
kayabilir.180
SOD,
süperoksit
zincirleme
reaksiyonlarının güçlü bir baĢlatıcısı olduğundan,
radikal
serbest oksijen
radikallerini kullanarak süperoksit anyonunu hidrojen peroksit ve moleküler
oksijene dismute eden reaksiyon ‗‘oksidatif strese karĢı ilk savunma‘‘
olarak değerlendirilir.
Son yıllarda yapılan araĢtırmalarda kalp yetmezliğinin altında
yatan mekanizmalardan biri olarak oksidatif stresin artması ve antioksidan
enzim rezervinin azalması olduğu ileri sürülmektedir.181
Kalpdeki serbest radikallerin detoksifikasyonunda SOD ve
GSH-Px majör rol oynar.182 SOD hidrojen peroksidin miktarının dokuda
artmasına neden olur. Bu artıĢın dokuya en büyük zararı kendisi için hiçbir
fizyolojik savunma mekanizması bulunmayan ve çok reaktif olan hidroksil
radikalinin oluĢmasıdır.180 Hidrojen peroksidin detoksifikasyonunda CAT
ve GSH-Px rol aldığı için bu enzimler önemlidir. GSH-Px peroksitleri
temizlemek için hidrojen donörü olarak GSH‘a ihtiyaç duymaktadır. Okside
formu
olan
GSSG,
dönüĢmektedir.
glutatyon
Gerekli
olan
redüktaz
NADPH
ile
yeniden
pentoz
fosfat
glutatyona
yolundan
sağlanmaktadır.69
ÇalıĢmamızda CCI4 grubunda GSH-Px enzim aktivitesi ve
GSH düzeyleri kontrol grubuna göre yüksek bulunmuĢtur. Bu yüksekliğin
104
istatistiksel olarak anlamlı olduğu görülmüĢtür.(sırayla p=0.001; p<0.05 ve
p=0.034; p<0.05)
Kalp dokusundaki CAT miktarı çok azdır. Karaciğerdeki CAT
miktarının %2‘i kalpde bulunur.131,183 CAT‘ın hidrojen perokside afinitesi
düĢüktür. Bu nedenle kalpde hidrojen peroksidin detoksifikasyonunda CAT
önemsizdir, majör rolü glutatyon redox sistemi yapar.183
ÇalıĢmamızda kalp dokusu CAT aktivite düzeyleri CCl4
grubunda (grup II) kontrol grubuna (grup I) göre azalmıĢtır, ancak bu
azalma istatistiksel olarak anlamlı değildir. (p=0.597; p˂0.05). Kalp
dokusunda CAT aktivite düzeyinin düĢük olması kalp dokusunda hidrojen
peroksidin arttığını göstermez. Çünkü çalıĢmamızda GSH ve GSH-Px
düzeyi yüksek bulunmuĢtur.
Daha önce yapılmıĢ bazı çalıĢmalarda; oksidatif stres
sırasında farklı dokulardaki antioksidan enzim sisteminin, farklı tepkiler
gösterdiği rapor edilmiĢtir.184 Enzimatik cevaplardaki bu farlılıklar özellikle
dokulardaki enzimlerin yapısının, aktivitelerinin ve miktarının farklı
olmasına bağlıdır. Bir enzimin ilgili subcellüler fraksiyonlarının farklı etki
gösterdiği Zhang ve arkadaĢları tarafından yapılan çalıĢmada rapor
edilmiĢtir. 32
Fizyolojik Ģartlarda da organizmada radikaller oluĢtuğu
bilinmektedir. Oksijen türevi radikaller; süperoksit radikali ve hidroksil
radikaline kaynak sağlayan hidrojen peroksitin artıĢına neden olmaktadır.
Bunlara bağlı lipit peroksidasyonunun göstergesi olan MDA da artıĢ
beklenir. ÇalıĢmamızda MDA düzeyinin artması; CCI4 bağlı olarak oluĢan
oksidatif stres sonucu baĢlayan lipit peroksidasyonunun göstergesidir.
105
ÇalıĢmamızda CCl4
kullanılan grupda GSH-Px ve SOD
düzeyinde anlamlı bir artıĢın olması aerobik metabolik fonksiyonların
ağırlıklı olduğu kalp dokusunda antioksidan savunma mekanizmasının
güçlü olduğunu düĢündürmektedir.
ÇalıĢmamızda aynı zamanda GSH düzeyi de CCl4
kullanılan
grupda anlamlı bir artıĢ göstermiĢtir. GSH-Px enzimi peroksitleri
temizlemek için hidrojen donörü olarak GSH‘a ihtiyaç duymaktadır.Hem
GSH‘ın hem de GSH-Px‘ın CCl4 kullanılan grupda artmıĢ olması,GSH
sentezinde rol alan ve (-) feedback ile GSH sentezini kontrol altında tutan
glutatyon
sentetaz
enziminin
aktivitesinin
artmıĢ
olabileceğini
düĢündürmektedir.
Kalp
dokusunda
antioksidan
sistemin
güçlü
olduğunu
yaptığımız çalıĢmadaki histopatolojik sonuçlar da desteklemektedir. Sekiz
hafta süresince CCI4 verilen ratların kalp dokusunda yapılan histopatolojik
incelemede Hematoksilen ve eozinle boyamada CCl4 grubuna ait
kesitlerde myokardiyal kas lifleri arasında ve damar çevresinde orta
dereceli ödem ve bazı kas liflerinde dalgalanmalar saptandı (Resim 2,3).
Caspase-3 primer antikoruyla indirekt immünohistokimyasal yöntemle
yapılan boyamada kontrol grubunda eser miktarda tutulum izlenirken
(Resim 4.), CCl4 grubunda orta dereceli tutulum saptanmıĢtır. (Resim 5.)
CCI4 ‗den
karaciğerde
sitokrom
P450
aktivasyonu
ile
triklorometil (CCI3-) radikali oluĢur. Bu da, hemen hücre zarı ile reaksiyona
girer.
27
DoymamıĢ yağ asitleri ile kovalent bağ oluĢturarak oksijen
varlığında hızla triklorometil peroksite(CCI3O2-) veya hidrojen atomlarını
kaybetmiĢ olan kloroform(HCHO) formuna dönüĢür.28,29
Bu radikaller çoklu doymamıĢ yağ asitlerinden hidrojen
alarak lipit peroksidasyon zincirini baĢlatırlar. Lipit peroksidasyonu biyolojik
106
membranların
yapısını
dramatik
olarak
değiĢtirir,
hastalıkların
patogenezinde rol oynayan Ģiddetli hücre hasarına neden olur.30,31
Sonuç olarak CCl4, kalp kası hücrelerinde bir takım
değiĢikliklere neden olmaktadır. Bu değiĢiklikler sonucunda caspase-3
yolağı aktive olarak apoptotik süreç baĢlar ve kalp kası hücrelerinin
ölümüne neden olur.
AraĢtırmamızın sonuçları ve destekleyen çalıĢmaların da
ıĢığında CCl4 ile yapılan çalıĢmalarda deney modellerindeki çeĢitlilik,
CCl4‘ün uygulama tarzı, doz ve süresinin farklı oluĢu ve antioksidan
sistemin
dokuya
spesifik
olması
nedeniyle
araĢtırmaların
farklı
sonuçlandığını düĢünmekteyiz. ÇalıĢmamızda kontrol grubuna göre CCl4
verilen grupta kalp dokusu MDA düzeylerindeki artıĢın, CCl 4 aracılı
oksidatif stres geliĢtiğinin bir göstergesi olduğunu düĢünmekteyiz.
Antioksidan enzim aktivitelerinin artmıĢ olması, histopatolojik incelemede
sadece
orta
dereceli
hasar
görülmesi;
kalp
dokusunun,CCI4 ‗ün
oluĢturduğu oksidatif strese karĢı oluĢan, güçlü ve etkili savunma
mekanizmaları
içerdiğini
düĢündürmektedir.
Antioksidan
enzimlerle
beraber hidrojen donörü olarak kullanılan GSH düzeyinin artmıĢ olması bu
düĢüncemizi desteklemektedir.
GSH düzeyindeki artıĢın mekanizmasını anlamak için
glutatyon sentetaz enzim aktivitesinin de beraber değerlendirildiği baĢka
çalıĢmalara ihtiyaç olduğunu düĢünmekteyiz.
107
6. ÖZET
KARBON TETRAKLORÜR (CCl4) VERİLEN RAT KALP
DOKULARINDA OKSİDAN / ANTİOKSİDAN SİSTEMLERİN
ARAŞTIRILMASI
CCI4 tipik bir toksik ajandır ve toksik etkisi serbest radikal
üretimi ile olmaktadır.
Bu çalıĢmada CCl4 verilen ratların kalp dokularında serbest
radikal metabolizmasında rol alan antioksidan enzimlerden süperoksit
dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPx), glutatyon-s-transferaz (GST)
ve katalaz (CAT) enzim aktiviteleri, kalp dokularındaki glutatyon (GSH)
seviyeleri ile lipit peroksidasyon ürünü olan malondialdehit düzeyleri
araĢtırılmıĢtır.
ÇalıĢmada 250-300 gr ağırlığında, wistar albino cinsi toplam
20 adet erkek rat kullanılmıĢ, ratlar rastgele iki eĢit gruba ayrılmıĢtır.Grup I
(Kontrol grubu) ratlara 8 hafta boyunca standart rat diyeti verilmiĢtir.
Grup II (CCl4 grubu) ratlara CCl4, haftada 3 kez olmak üzere ,8 hafta
boyunca 0.3ml/kg (1. hafta), 0.7ml/kg (2. hafta) ve 6 hafta boyunca da 1
ml/kg CCl4 artan dozlarda intraperitoneal olarak verilmiĢtir. Sekiz hafta
sonunda ratlar anestezi altında feda edilerek kalp dokuları çıkartılmıĢtır.
Kalp dokusu üzerine CCl4‘ün muhtemel oksidan etkisi ile kalp dokusunun
108
antioksidan savunma sistemi,
enzimatik ve histopatolojik olarak
incelenmiĢtir.
ÇalıĢmamızda CCl4 grubunda GPx ve SOD enzim aktiviteleri
kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı derecede artarken (p<0.05
ve p<0.05) , GST ve CAT enzim aktivitesi kontrol grubuna göre azalmıĢtır.
Ancak bu azalma istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıĢtır (p>0.05 ve
p>0.05). Kalp dokusu GSH ve MDA düzeylerinin CCI 4 grubunda kontrol
grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir Ģekilde arttığı gözlenmiĢtir
(p<0.05 ve p<0.05). Bu verilere paralel olarak CCl4 grubunda kontrol
grubuna göre histopatolojik olarak bazı değiĢiklikler gözlenmiĢtir.
Spearman korelasyon analizi sonuçlarına göre doku MDA
düzeyi artarken, GPx ve SOD aktivitesi artmıĢtır. Üçü arasında güçlü
pozitif korelasyon görülmüĢtür. Doku GSH düzeyi ile doku SOD aktivitesi
arasında güçlü pozitif korelasyon bulunmuĢtur. Doku GSH düzeyi
artarken, doku SOD aktivitesi artmıĢtır ve aralarında güçlü bir pozitif
korelasyon görülmüĢtür. Doku GPx aktivitesi ile doku CAT aktivitesi
arasında zayıf bir negatif korelasyon saptandı. Doku GPx aktivitesi
artarken doku CAT aktivitesi azalmıĢtır. Kalp dokusu GPx aktivitesi ile
doku SOD aktivitesi arasında güçlü bir pozitif korelasyon vardır.Yine doku
GST
ve doku CAT aktiviteleri arasında güçlü pozitif korelasyon
görülmüĢtür.Doku GST aktivitesi azalırken, doku CAT aktivitesi de
azalmıĢtır.
ÇalıĢmamızda kontrol grubuna göre CCl4 verilen grupta kalp
dokusu MDA düzeylerindeki artıĢın, CCl4 aracılı oksidatif stres geliĢtiğinin
bir göstergesi olduğunu düĢünmekteyiz. Kalp dokusunda CAT aktivite
109
düzeyinin düĢük olması, kalp dokusunda hidrojen peroksidin arttığını
göstermez.
Çünkü
çalıĢmamızda
GSH
ve
GPx
düzeyi
yüksek
bulunmuĢtur. GSH-Px enzimi peroksitleri temizlemek için hidrojen donörü
olarak GSH‘a ihtiyaç duymaktadır. Hem GSH‘ın hem de GSH-Px‘ın CCl4
kullanılan grupda artmıĢ olması, GSH sentezinde rol alan ve (-) feedback
ile GSH sentezini kontrol altında tutan glutatyon sentetaz enziminin
aktivitesinin artmıĢ olabileceğini düĢündürmektedir. Antioksidan enzim
aktivitelerinin artmıĢ olması, histopatolojik incelemede sadece orta
dereceli hasar görülmesi; kalp dokusunun CCI4 ‗ün oluĢturduğu oksidatif
strese
karĢı
oluĢan
güçlü
ve
etkili
mekanizmaları
içerdiğini
düĢündürmektedir.
Anahtar Kelimeler : Antioksidan enzimler, Karbon tetraklorür, kalp
110
7. SUMMARY
INVESTIGATION OF OXIDAN/ANTIOXIDANT STATUS
TREATED WITH CCl4 IN RAT HEART TISSUE
CCI4 is a typical toxic agent, and causes production of free-radical.
In this study, the heart tissues of rats given CCl4 in the metabolism
of free radical antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD),
glutathione peroxidase (GPx), glutathione-S-transferase (GST) and
catalase (CAT) enzyme activities, heart tissue glutathione (GSH) with
levels of lipid peroxidation product, malondialdehyde levels were
investigated.
Twenty male Wistar-Albino rats weighing approximately 250-300
grams were used in the study. Group–I Control, group-II Carbon
tetrachloride.
Group I (Control group) for 8 weeks, rats were given standard rat
chow. Group II (CCl4 group) rats were given intraperitoneally in increasing
doses 0.3ml/kg CCl4 for 8 weeks (1st week), 0.7ml/kg (2nd weeks) and 1
ml / kg for 6 weeks.
After eight weeks, the rats were sacrificed under anesthesia, heart
tissues were removed. We investigeted probably oxidant effects of CCl4
on heart tissue and antioxidant defense system of cardiac tissue, and
conducted enzymatic and histological examination.
In our study, GPx and SOD enzyme activities in CCl4 group were
significantly increased compared with control group (p <0.05 and p <0.05).
GST and CAT enzyme activity in CCl4 group decreased compared with
111
control group. However, this reduction was not statistically significant (p>
0.05 and p> 0.05) . GSH and MDA levels of heart tissue in CCI4 group, a
statistically significant increase was observed (p <0.05 and p <0.05). In
parallel to these data, CCl4 group according to the control group, some
histopathological changes were observed.
According to the results of our experiment of tissue MDA levels
increased in CCI4 group compared with control group, just as GPx and
SOD activity increased. According to the results of spearmann correlation
analyze strong positive correlation was found among the three of them.
GSH levels of heart tissue with a strong positive correlation was found
between SOD activity. GSH activity in the heart tissue with a strong
positive correlation was found between CAT activity. SOD activity of CCI4
group increased, while GSH levels increased and a strong positive
correlation was found between them. GPx activity in the heart and a weak
negative correlation was found between CAT activity in the heart. Tissue
GPx activity increased, while CAT activity decrease. GPx activity in the
heart tissue with a strong positive correlation was found between SOD
activity. SOD activity of CCI4 group increased, while GPx levels increased
and a strong positive correlation was found between them. GST levels of
heart tissue with a strong positive correlation was found between CAT
activity. Tissue GST activity decrease, while CAT activity decreased.
Oxidative stress may be a major mechanism for the toxicity of
CCl4. In CCI4 group MDA level is higher than the control group supports
this opinion. The low level of CAT activity in heart tissue, heart tissue does
not show an increase of hydrogen peroxide. Because our study found high
levels of GSH and GPx levels. GSH-Px enzyme need to GSH as hydrogen
donor to clean peroxides . We think increased of glutathione synthetase
enzyme that involved in the synthesis of GSH and (-) feedback, which
controls the synthesis of GSH therfore Both GSH and GSH-Px increase in
112
the CCI4 group. Ġncreased antioxidant enzyme activities, only moderate
damage apparents in the histopathologic examination against oxidative
stress caused by CCI4 in heart tissue, suppose that there is a strong and
effective antioxidant system.
Keyword : Antioxidant enzymes, Carbon etrachloride, heart
113
8. KAYNAKLAR
1. Aktümsek A. Anatomi ve Fizyoloji, Ġnsan Biyolojisi. 3. Baskı. Ankara:
Nobel Yayınevi; 2006.
2. Engin A, Bozkurt BS, Altan N, MemiĢ L, Bukan N. Nitric oxide mediated
liver injury in presence of experimental bileduct obstruction. World journal
of Surgery 2003; 27(3): 253-255.
3. Engin A, Altan N, IĢık E. Erytrocyte glutathione levels in lithium- induced
hypothroidism. Drugs R D 2005; 6(1): 35-40.
4. Hasanoğlu E, Altan N, Sindel P, Ongun CÖ, Bali M, AltıntaĢ E. The
relationship between erythrocyte süperoxide dismutase activity and
plasma levels of some trace elements (Al,Cu,Zn) of dialysis patients.
General Pharmacology 1994; 25(1): 107-110.
5. Özenirler S, Tuncer C, Ongun CÖ, Altan N, Kandilci U. Activity of
süperoxide dismutase in erythrocyte of nonalcoholic chronic liver
diseases. General Pharmacology 1994; 25(7): 1349-1351.
6. Yılmaz E, Yılmaz S, Karakurt L, Serin E. Osteoartritde Nitrik Oksid ve
Malondialdehid Düzeyleri . Clinical Research 2004; 15(1): 7-11.
7. Yılmaz S, Bahçecioğlu IH. Karbon tetraklorür ile Siroz OluĢturulmuĢ
Ratlarda Lipid Peroksidasyonu, Antioksidan Enzim ve Piruvat Kinaz
Aktiviteleri. Turk. J. Vet. Anim. Sci. 2000; 24: 25–28.
8. Bandyopadhyay U, Das D, Banerjee R. Reactive oxygen species:
oxidative damage and pathogenesis. Curr. Sci. 1999; 77(5): 658-665.
9. Recknagel R, Glende EA, Dolak JA, Waller RL. Mechanisms of carbon
tetrachloride toxicity, Pharma Ther, 1989; 43: 139-154.
10. Snyder IR, Parke DV, Kocsis JJ, Jollow DJ, Gebson GG, Witmer CM
(Eds). Biological Reactive Intermediates II, Chemical Mechanisms and
Biological Effects. New York: Plenum Press; 1982.
11. Sies H. Oxidative stress: from basic research to clinical application.
Am. J. Med. 1991; 91: 31-38.
114
12. Cheeseman KH. General Mechanisms of toxic liver injury with special
reference to free radical reactions. Advances in Inflamation Research,
Eds; KD Rainsford and GP Velo 1984; 6: 179-188.
13. Dianzani MU. The role of free radicals in medicine and biology. Acta
Physiol, Scand 1980; 492: 153-168.
14. Esterbauer H. Aldehydic products of lipid peroxidation, Free radicals,
lipid peroxidation and cancer, Eds: DCH McBrien and TF Slater. London:
Academic Press ;1982.
15. Oberley LW. Free radicals and diabete. Free Rad. Biol. Med 1988;
5:113-124.
16. Pitkanen OM, Martin JM, Hallman M, Akerblom HK, Sariola H,
Anderson SM. Free radical activity during development of insulin
dependent diabetes mellitus in the rat. Life Sci 1991; 50: 335-339.
17. Sinclair AJ, Lunec J, Girling AJ. Barnett AH. Modulators of free radical
activity in diabetes mellitus, Role of ascorbic acid, Free Radicals and
Saging, Ed:I. Basel: Emirit and B Chance, Birkhauser Verlag; 1992.
18. Jerry
P, Liu
L,
Zeng
M, Stamler JS. An apoptotic model for
nitrosative stress. Biochemistry 2000; 39: 1040-1047.
19. MICROMEDEX (R) Healthcare Series Vol. 146 expires 12/2010.
20.
Agency
for
Toxic
Substances
and
Disease
Registry
(ATSDR).Toxicological Profile for Carbon Tetrachloride. Atlanta: U.S.
Department of Health and Human Services,Public Healt Service; 2005.
21. Canuto RA, Muzio G, Maggiora M, Biocca ME, Dianzani MU.
Glutathione S Transpherase, alcohol dehydrogenase and aldehyde
dehydrogenase activities during diethylnitrosamine carsinogenesis in rat
liver. Cancer Letters 1993; 68: 177-183.
22. Castilla CI, Garcia M, Muguerza B, Quiroga J, Perez R, Satidrian S, et
al. Hepatoprotective effects of insuline like growth factor I in rats with
carbon tetrachloride induced cirrhosis. Gastroenterology 1997; 113 (5):
1682-1691.
115
23. Thrall KD,
Vucelick ME,
Gies RA, Benson JM. Comparative
metabolism of carbon tetrachloride in rats, mice, and hamsters using gas
uptake and PBPK modeling. J Toxicol Environ Health A 2000; 60(8): 531548.
24.
Weber LW, Boll M, Stampfl A. Hepatotoxicity and mechanism of
action of haloalkanes: carbon tetrachloride as a toxicological model. Crit
Rev Toxicol 2003; 33: 105-136.
25. . Rao PS, Mangipudy RS, Mehendale HM. Tissue injury and repair as
parallel and opposing responses to CCI4 hepatotoxicity: a novel doseresponse. Toxicology 1997; 118: 181-193.
26. Sanzgir UY, Srivatson V, Muralidhara S, Dallas CE, Bruckner JV.
Uptake, distribution and elimination of carbon tetrachloride in rats tissues
following inhalation and ingestion exposures. Toxicol Appl Pharmacol.
1997; 134(1): 120-129.
27. Dashtı H, Jeppson B, Hagerstrandı
I,
Hultberg
B, Srınıvas U,
Abdulla M, Bengmark S. Thioactamide-and Carbon Tetrachloride-induced
liver cirrhosis. Eur. Surg. Res. 1989; 21: 83-91.
28. Kanter M, Meral I, Dede S, Gunduz H, Cemek M, Ozbek H, Uygan I.
Effects of Nigella sativa L. And Urtica dioica L. on lipid peroxidation,
antioksidant enzyme systems and some liver enzymes in CCI 4 –treated
rats. J. Vet. Med. A:Physiol. Pathol. Clin. Med. 2003; 50: 264-268.
29. Parola M, Leonarduzzi G, Biasi F, Albano E, Biocca ME, Poli G,
Dianzani MU. Vitamin E dietary supplementation protects against CCI 4
induced chronic liver damage and cirrhosis. Hepatology 1992; 16: 10141021.
30. Williams AT, Burk RF. Carbon tetrachloride hepatoxicity: an example
of free radical-mediated injury. Semin. Liver Dis. 1990; 10: 279-284.
31. Zhang D, Yasuda T, Yu Y, Zheng P, Kawabata T, Ma Y, Okada S.
Ginseng extract scavenges hydroxyl radical and protects unsaturated fatty
116
acids from decomposition caused by iron-mediated lipid peroxidation. Free
Rad. Biol. Med. 1996; 20: 145-150.
32. Cabre M, Comps J, Paternain JL, Ferre N, Joven J. Time course of
changes in hepatic lipid peroxidation and glutathione metabolism in rats
with carbon tetrachloride-induced cirrhosis. Clin Exp Pharmacol Physiol
2000; 27(9): 694-699.
33. Melin AM, Perromat A, Deleris G . Pharmacologic aplication of Fourier
transform IR spectroscopy : invivo toxicity of carbon tetrachloride on rat
liver. Biopolymers 2000; 57(3): 160-168.
34. Major GN, Collier JD. Repair of DNA lesion O6 -methylguanine in
hepatocellular carsinogenesis. J Hepatobiliary Pancreat Surg 1998; 5(4):
355-366.
35. Sanzgiri UY, Kim HJ, Muralidhara S, Dallas CE, Bruckner JV. Effect of
route and pattern of exposure
on the pharmacokinetics and acute
hepatotoxicity of carbon tetrachloride. Toxicol Appl Pharmacol 1995; 134:
148-154 .
36. Sanzgiri UY, Srivatsan V, Muralidhara S, Dallas CE , Bruckner JV.
Uptake, distribution, and elimination of carbon tetrachloride in rat tissues
following inhalation and ingestion exposure. Toxicol Appl Pharmacol 1997;
143: 120 - 129.
37. Mandal AK, Sinha J, Mandal S, Mukhopadhyay S, Das N. Targeting of
liposomsl flavonoid tol iver in combating hepatocellular oxidative damage.
Drug Deliv 2002; 9: 181-185.
38. Güven A, Erginsoy S, Kaya N. Kazlarda karbon tetraklorür
zehirlenmesinin biyokimyasal ve patolojik parametrelere etkisi. Kafkas Ü.
Vet. Fak.Derg. 2003; 9: 131-136.
39. McCay PB, Lai EK, Payer JL, Dubose CM, Janzen EG. Oxygen and
carbon centered radical formation during carbon tetrachloride metabolism.
J. Biol. Chem. 1984 ; 259: 2135-2143.
117
40. Erdoğan E, Kaya A, Rağbetli MÇ, Özbek H, Cengiz N. Anason
(Pimpinella anisum) Ekstresinin Deneysel Akut Karaciğer Hasarında
Karaciğer Koruyucu Etkisi Var mı? Van Tıp Dergisi 2004; 11 (3): 69-74.
41. Stombeck DR, Guilford WG. Small Animal Gastroenterology. 2nd edit.
California: Stongate publishing Co ; 1990.
42. Vural N. Toksikoloji. Ankara: A. Ü. Ecz. Fak. Yayınları. (No 56); 1984.
43. Nadkarni GD, Souza NB. Hepatic antioxidant enzymes and lipid
peroxidation in carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis in rats. Biochem
Med and Met Biol1988; 40: 42-5.
44. Gasso M, Rubio M, Varela G,Cabre M, Caballeria J, Alonso E, et al.
Effects of
S adenosylmethionine on lipid peroxidation and liver
fibrogenesis in carbon tetrachloride-induced cirrhosis. J Hepatol 1996; 25:
2000- 2005.
45.Liebert J, Matlawska I, Bylka W, Murias M. Protective effect of
aquilegia vulgaris on APAP induced oxidative stress in rats. J.
Ethnopharm 2005; 97: 351-358.
46. Sherlock S. The spectrum of hepatotoxicity due to drugs. Lancet 1986;
2: 440-444 .
47. Foulis PR, Sandford BH, Gottfried M. Drug induced morphologic
changes in the liver. Ann. Clin. Lab. Sci. 1988; 18: 215-228.
48. . Sancak B, Cumhur M, editörler. Fonksiyonel Anatomi, BaĢ-Boyun ve
iç organlar. 3.baskı. Ankara: ODTÜ Yayıncılık; 2004.
49. Kuzey GM, Özdamar ġO, Zergeroğlu S, editörler. Temel Pataloji .
Ankara: GüneĢ Kitapevi; 2007.
50.Floyd
RA, Davies KJA. Ed. DNA damage and repair in ―Oxidative
Damage and Repair‖. London: Pergamon Press; 1992
51. Halliwel B, Gutteridge J. The antioxidant of human extracellular fluids.
Archieves of Biochemistry and Biophysics 1990; 280: 1- 8.
52. Gutteridge J.Lipid peroxidation and antioxidants as biomarkers of
tissue damage. Clin Chem 1995; 41: 1819 – 1828.
118
53. Rao G. Glutathionyl hydroquinone: a potent pro-oxidant and a posible
toxic metabolite of benzene. Toxicology 1996; 106: 49- 54.
54. Manna C, Galletti P, Cucciolla V, Moltedo O, Leone A, Zappia V. The
protective effect of the olive oil polyphenol (3,4-Dihydroxyphnyl)-ethanol
counteracts reactive oxygen metabolite-induced cytotoxicity in caco-2
cells. American Socienty for Nutritional Sciences 1997; 22: 3166-3197.
55. Mc Cord JM. Oxygen-derived free radicals in postischemic tissue
injury. The New England J. Med. 1985; 312(3): 159-163.
56. Maher P, Schubert D. Signaling by reactive oxigen species in the
nervous system. Cell. Mol. Life Sci. 2000; 57: 1287-1305.
57. Basaga HS. Biochemical aspects of free radicals. Biochem. Cell Biol.
1990; 68(7-8): 989-998.
58. Gutteridge
J.M, Halliwell
B. Free
Radicals
in
Biology
and
Medicine. Oxford: Clerendon Press; 1991.
59. Halliwell B, Gutteridge JMC. Role of free radicals and catalytic metal
ions in human disease: An overview. Methods in enzymology 1989; 186 :
1-17.
60. Scandalios JG. The rise of ROS. TRENDS in Biochemical Sciences
2002; 27: 483-486.
61. Kılınç K, Kılınç A. Oksijen toksisitesinin aracı molekülleri olarak oksijen
radikalleri. Hacettepe Tıp Dergisi 2002; 33: 110- 118.
62. Akkus I. Serbest Radikaller ve Fizyopatolojik Etkileri. 1. Baskı. Konya:
Mimoza Yayınları ; 1995.
63. Gaetani P , Lombardi D. Brain damage following subarachnoid
hemorrhage: the imbalance between antioxidant systems and lipid
peroxidative processes. Journal of Neurosurgical Sciences 1992; 36: 1-10.
64. Deuticke B, Heller K, Haest M. Leak formation in human eryhrocytes
by the radical-forming oxidant t-butylhydroperoxide. Biochimica et
Biophysica Acta 1986; 854: 169-183.
65. La Cassa C, Villegas I, Lastra A, Motilva V, Calero M. Evidence for
protective and antioxidant properties of rutin, a natural flavone, against
119
ethanol induced gastric lesion. Journal of Ethnopharmacology 2000; 71:
45-53.
66. Fang YZ, Yang S, Wu G. Free Radicals, Antioxidants and Nutrition.
Nutrition 2002; 18: 872– 879 .
67. Cooper CE, Vollaard NBJ, Choueiri T, Wilson MT. Exercise, free
radicals and oxidative stress. Biochemical Society Transactions 2002; 30:
280-285 .
68. Kaneda H, Taguchi J, Ogasawara K, Aizawa T, Ohno M. Increased
level of advanced oxidation protein products in patients with coronary
artery disease. Atherosclerosis 2002; 162: 221-225.
69. Halliwell B, Gutteridge J.M. Free Radical in Biology and Medicine.
Third ed. Oxford: Oxford University Press; 2000.
70. Pouda M, Traber MG, Weber C, Yan LJ, Pakcer L. UV-irradiation
deplets antioxidants and causes, damage in a model human skin. Free
Radic. Biol. Med. 1998; 92: 5259-5265.
71. Baud L, Laurent L, Ardoillov R. Reactive oxygen species: production
and role in the kidney. Am. J. Of Physiol. 1986; 251: 765- 776.
72. Mc Cord J M, Fridovich I. The biology and pathology of oxygen
radicals.Annals of Inter. Med 1978; 89: 12-127.
73. Beckman KB, Ames BN. The free radical theory of aging matures,
Physiol. Rev. 1998; 78: 547-581.
74. Sodergen E. Lipid peroxidation in vivo. Uppsala: Uppsala University;
2000.
75. Nishiyama Y, Ikeda, H, Haramaki N. Oxidative stress is related to
exercise intolerance in patients with heart failure. Am Heart J 1998; 135:
115.
76. Yao T, Esposti SD, Huang L, Amon R, Spangenberger A, Zern MA.
Inhibition of carbon tetrachloride induced liver injury by liposomes
containing Vitamin E. Am J Physiol 1994; 30: 476-484.
77. Freidovich I. Fundamental aspects of reactive oxygen species, or
what‘s the matter with oxygen? Ann NY Acad Sci 1999; 893: 13 .
120
78. Gilbert D.L. Fifty years of radical ideas. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2000;
899: 1.
79. Pieper GM, Siebeneich W, More-Hilton M, Roza AM. Reversal by LArginin of a dysfunctional arginine/nitric oxide pathway in the endothelium
of the genetic diabetic rat. Diabetologia 1997; 40: 910-915.
80. Hubel C, Kozlov A, Kagan V, Evans R, Davidge S, McLaughlin M, et
al. Decreased transferin and increased transferin saturation in sera of
women with preeclampsia: implication for oxidative stres. Am J Gynecol
1996; 175: 692- 70
81. Demple B. Radical Ideas : genetic responses to oxidative stres.
Clinical and Expermental Pharmacology and Phsiology 1999; 26: 64-68.
82. Chen S, Schopfer P. Hydroxyl-radical production in physiological
reactions a novel function of peroxidase. Eur. J. Biochem. 1999; 260:
726-735.
83. Ekinci F, Linsley M, Shea T. Beta amyloid induced calcium influx
induces apoptosis in culture by oxidative stres rather than tau
phosphorylation. Molecular Brain Research 2000; 76: 389-395.
84. Cheeseman KH, Slater TF. An introduction to free radical
biochemistry. Brit. Med. Bulletin 1993; 149: 481-493.
85. Evans P, Halliwell B. Micronutrients: Oxidant/antioxidant status. Br. J.
Nutr. 2001; 85: 67.
86. Jensen SJK. Oxidative stress and free radicals. Journal of Molecular
Structure (Theochem) 2003; 666-667: 387-392.
87. Hawkins CL, Pattison DI, Davies MJ. Hypochlorite-induced oxidation of
amino acids, peptides and proteins. Amino Acids 2003; 25: 259-274.
88. Samokyszyn V, Marnett L. Hydroperoxide-dependent cooxidation of
13-cis-retinoic acid by prostoglandin H synthase. Journal of Biological
Chemistry 1987; 262: 14119-14133.
89. Mayer B, Hemmens B. Biosynthesis and action of nitric oxide in
mammalian cells. TIBS 1997; 22: 477-481.
121
90. Berlett BS, Stadtman ER. Protein oxidation in aging, disease and
oxidative stress. J. Biol. Chem. 1997; 272: 213-216.
91. Hausladen A, Stamler J.S. Nitrosative stres. Methods in Enzymology
1999; 300: 389-395.
92. Jong MK, Adham NF, Heng MCY, Costea NV, Heng MK. Trace
element metabolic alterations of zinc and prostoglandins in both human
and animal colonic tumor cells. J. Am. Coll. Nutr. 1995; 14: 473-479.
93. Haddad JJ. Oxygen sensing and oxidant/redox-related pathways.
Biochemical and Biophysical Research Communications 2004; 316:
969-977.
94. Boyunağa H, Çelik C. Serbest radikaller ve hücresel denge. Bilim
Teknik Dergisi 1996; 347: 98-100.
95. Powell SR. The antioxidant properties of zinc. J. Nutr. 2000; 130:
1447-1454.
96. De Zwart LL, Meerman JHN, Commandeur JNM, Vermeulen NPE.
Biomarkers of free radical damage aplications in experimental animals and
in humans. Free Radical Biology and Medicine 1999; 26: 202-226.
97. Uchida K. Role of reactive aldehyde in cardiovasculer diseases. Free
Radical Biology and Medicine 2000; 28: 1685-1696.
98. Uchida K. Role of reactive aldehyde in cardiovasculer diseases. Free
Radical Biology and Medicine 2000; 28: 1685-1696.
99. Kremer TM, Rinne ML, Xu Y, Chen XM, Kelley MR. Protection of
pulmonary epithelial cells from oxidative stress by hMYH adenine
glycosylase. Respiratory Research 2004; 5:16.
100. Cross CE, Halliwell B, Borish ET, Pryor WA, Ames BN, Saul RL,
McCord JM, Harman D. Oxygen radicals and human disease. Ann Intern
Med. 1987; 107(4): 526-45.
101. Bird RP, Draper HH. Comparative studies on different methods of
malonaldehyde determination. Methods Enzymol. 1994; 105: 299-305.
122
102. Esterbauer H, Cheeseman KH. Determination of aldehid lipid
peroxidation
products:
Malonaldehyde
in
biological
samples.
J.
Chromatogr. B. 2002; 775: 121-126.
103.
Chirico
S.
High
Performance
liquid
chromatography based
thiobarbituric acid tests. Methods Enzymol. 1994; 234: 314-318.
104. Carbonneau MA, Peuchant E, Sess D, Canioni P, Clerc M. Free and
bound malondialdehyde measured as thiobarbituric acid adduct by HPLC
in serum and plasma. Clin. Chem. 1991; 37:1423-1429.
105. Agarwal R, Chase SD. Rapid fluorimetric-liquid chromatographic
determination of malonaldehyde in biological samples. J. Chromatogr. B.
2002; 775: 121-126.
106. Pilz J, Meineke I, Gleiter CH. Measurement of free and bound
malondialdehyde in plasma by high-performance liquid chromatography as
the 2,4 dinitrophenylhydrazine derivative. J. Choromatogr. B. 2000; 742:
315-325.
107. Blake DR, Allen RE, Lunec J. Free radicals in biological systems—a
review orientated to inflammatory processes. British Medical bulletin 1987;
43(2) : 371-385.
108.
Reznick
AZ,
Packer
L.
Oxidative
damage
to
proteins:
Spectrophotometric method for carbonyl assay. Methods Enzymol. 1994;
233: 357-363.
109. Shacter E. Quantification and significance of protein oxidation in
biological samples. Drug Met. Rev. 2000; 32: 307-326.
110.
Hawkins CL, Davies MJ. Generation and propagation of radical
reactions on proteins. Biochem. Biophys. Acta 2001; 1504: 196-219.
111. Evans P, Lyras L, Halliwell B. Measurement of protein carbonyls in
human brain tissue. Methods Enzymol. 1999; 300: 145-156
112. Alderman C, Shan S, Foreman JC, Chain BM, Katz DR. The role of
advanced oxidation protein products in regulation of dentritic cell function.
Free Radic. Biol. Med. 2000; 32: 377-385.
123
113.Çakatay U, Telci A, Kayalı R, Tekeli F, Akcay T, Sivas A. Relation of
aging with oxidative protein damage parameters in the rat skeletal muscle.
Clin. Biochem. 2003; 36: 51-55.
114. Witko-Sarsat V, Descamps-Latscha B. Advanced oxidation protein
products: novel uraemic toxins and pro-inflammatory mediators in chronic
renal failure?, Nephrol. Dial. Transplant. 1997; 12: 1310-1312.
115. Witko-Sarsat V, Nguyen-Khoa T, Jungers P, Drueke T, DescampsLatscha B. Advanced oxidation protein products as a novel molecular
basis of oxidative stress in uremia. Nephrol. Dial. Transplant. 1999; 14:
76-78.
116. Otani K, Shimizu S, Chijiiwa K, Yamaquchi K, Kuroki S, Tanaka M.
Increased Urinary Excretion of Bilirubin Oxidative Metabolites in Septic
Patients: A New Marker for Oxidative Stress in Vivol. Journal of Surgical
Research 2001; 96: 44-49.
117. Minetti M, Mallozzi C, Michela AM, Stasi D, Pietraforte D. Bilirubin is
an effective antioxidant of peroxynitrite-mediated protein oxidation in
human blood plasma. Arch Biochem Biophys 1998; 352(2): 165-174.
118. Hegyi T, Goldie E, Hiatt M.The protective role of bilirubin in oxygenradical diseases of the preterm infant. J Perinatol 1994; 5: 247-256.
119. Stocker R, Yamamoto Y, McDonagh AF, Glazer AN, Ames BN.
Bilirubin is an antioxidant of possible physiological importance. Science
1987; 235 : 4792; 1043-1046.
120. Stocker R. Antioxidant activities of bile pigments. Antioxid Redox
Signal. 2004; 6(5): 841-849.
121. Gopinathan V, Miller NJ, Milner AD, Rice-Evans AC. Bilirubin and
ascorbate antioxidant activity in neonatal plasma . FEBS Letters 1994;
349: 197- 200.
122. Lindeman JH,Lentjes EG, Houdkamp E. Effect of an Exchange
transfusion on plasma antioxidants in the newborn. Pediatrics 1992; 90:
200 - 203.
124
123. Gutteridge JM, Halliwell B. Antioxidants in Nutrition, Health and
Disease. New York: Oxford University Pres; 1994 .
124. Splettstoesser WD, Werner SP. Oxidative Stress in Phagocytes
―The Enemy Within‖. Microscopy Research And Technique 2002; 57:
441–455.
125. Yesilkaya A, Altinayak R, Korgun DK. The antioxidant effect of free
bilirubin on cumene-hydroperoxide treated human leukocytes. Gen
Pharmacol. 2000; 35(1): 17-20.
126. Matsuo
M,
Kaneko
T. The
Chemistry of
Reactive
Oxygen
Species and Related Free Radicals. Edit.Zsolt Radak. (Free Radicals
in Exercise and Aging). Human Kinetics 2000: 1-33.
127. Rahman Q, Abidi P, Afaq F, Schiffman D,Mossman TB, Kamp WD,
Athar M. Glutathione Redox System in Oxidative Lung Injury. Crit.
Rev. in Toxicol. 1999; 29: 543-568.
128. Jacob R.A. Trace Elements in Textbook of Clinical Chemistry, (Tietz
N. W. ed.) Philadelphia: W.B. Saunders Company; 1986.
129. Meister A. Glutathione, ascorbate and cellular protection. Cancer
Res. Suppl. 1994; 954: 1969-1975.
130. Tofovic SP, Jackson EK. Effects of long-term caffeine consumption
on renal function in spontaneously hypertensive heart failure prone rats. J
Cardiovasc Pharmacol. 1999; 33(3): 360-366.
131. Lai C.C, Huang W, Askari A, Wang Y. Differantial regulation of
superoxide dismutase in copper deficient rat organs. Free Radic. Biol.
Med. 1994; 16: 613-620.
132. Zhao J, Liu XJ, Ma JW, Zhenq RL. DNA damage in healthy term
neonate. Early Human Development 2004; 77: 89-98.
134. Michiels C, Raes M, Toussaint O, Remacle J. Importance of Seglutathione peroxidase, catalase, Cu-Zn superoxide dismutase for cell
survival against oxidative stres. Free Radic. Biol. Med. 1994; 17: 235-248.
135. . Dringen R, Pawlowski PG, Hirrlinger J. Peroxide detoxification by
brain cells. J. Neurosci. Res. 2005; 79: 157-165.
125
136. Shidhu P. Protective role of zinc in nickel induced hepatotoxicity in
rats. Chemico-Biological Interactions 2004; 150: 199-209.
137. Liebert J, Matlawska I, Bylka W, Murias M. Protective effect of
aquilegia vulgaris on APAP induced oxidative stress in rats. J.
Ethnopharm. 2005; 97: 351-358.
138. Guemori L, Arthur Y, Herbeth B, Jeandel C, Cunny G, Siest G.
Biological variability of süperoxide dismutase, glutathione peroxidase and
catalase in blood. Clin Chem 1991; 37: 1932-1937.
139. Nordberg J, Arner ES. Reactive oxygen species; antioxidants and the
mammalian thioredoxin system. Free Radic Biol Med 2001; 31 (11):
1287-312 .
140. Felix K, Rockwood LD, Pretsch W, Nair J, Bartsch H, Bornkamm GV,
Janz S. Moderate G6PD deficiency increases mutation rates in the brain
on mice. Free Radic Biol Med 2002; 32(7): 663-673.
141. Rozga J. Animal models of liver regeneration, Ġn W.W. and
D.G.Souba (Eds.). Surgical Research. Wilmore California: Academic
Press; 2001.
142. Ġlhan A, Akyol O, Gurel A, Armutcu F, Iraz M, Oztas E. Protective
effects of caffeic acid phenethyl ester against experimental allergic
encephalomyelitis induced oxidative stress in rats. Free Radical Biology
and Medicine 2004; 37(3): 386-394.
143. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein
measurements with the folin phenol reagent. J. Biol Chem1951; 193: 265275.
144. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal
tissues by thiobarbituric acid reaction. Analytical Biochemistry 1979; 95:
351- 358.
145. Paglia DE, Valentina WN. Studies on quantitative and qualitative
characterization of erytrocte glutathione peroxidase. J. Lab. Clin. Med.
1967; 70: 158-169.
126
146. Habig WH, Pabst MJ, Jakoby WB. Glutathione-S-transferases: The
first enzymatic step in mercapturic acid formation. J. Biol. Chem. 1974;
249: 130-139.
147. .Aebi H. Catalase, In: H.U.Bergmeyer, (Ed): Methods of Enzymatic
Analysis. New York and London: Academic Press; 1974.
148. Yi-Sun S, Oberly LW, Li Y. A simple method for clinical assay of
superoxide dismutase. Clin. Chem. 1988; 34: 497-500.
149. Rao PS, Mangipudy RS, Mehendale HM. Tissue injury and repair as
parallel and opposing responses to CCI4 hepatotoxicity: a novel doseresponse. Toxicology 1997; 118: 181-193.
150. Castillo T, Koop DR, Kamimura S, Triadafilopoulos G,Tsukamodo H.
Role of cytochrome P-450 2E in ethanol-,carbon tetrachloride- and irondependent microsomal lipidperoxidation. Hepatology 1992; 16(4):
992–996.
151. Hartley DP, Kolaja KL, Reinchord J, Peterson DR .4-Hydroxynonenal
and malondialdehyde hepatic protein adducts in rats treated with carbon
tetrachloride: immunochemical detectionand lobular localization. Toxicol
Appl Pharmacol 1999; 161(1): 23–33.
152. Das S, Santra A, Lahiri S, Guhamazumder DN. Implications of
oxidative stress and hepatic cytokine (TNF-alpha and IL-6) response in the
pathogenesis of hepatic collagenesis in chronic arsenic toxicity. Toxicol.
Appl. Pharmacol. 2005; 204: 18-26.
153. - Naik SR. Antioxidants and their role in biological functions:
anoverview. Ind. Drugs 2003; 40: 501-516.
154. Kogure K, Ishizaki M, Nemoto M, Kuwano H,
Makuuchi M. A
comparative study of the anatomy of rat and human
livers. J Hepatobiliary Pancreat Surg 1999; 6(2): 171–175.
155. Halim AB, El-Ahmady O, Hassab-Allah S, Abdel-Galil F, Hafez Y,
Darwish A. Biochemical effect of antioxidants on lipids and liver function in
experimentally-induced liver damage. AnnuClin Biochem 1997; 34(6):
656–663.
127
156. Botsoglou N, Taitzoglou I, Zervos I, Botsoglou E, Tsantarliotou M,
Chatzopoulou PS. Potential of long-term dietary administration of
rosemary in improving
the antioxidant status of rat tissues following
carbon tetrachloride intoxication. Food and Chemical Toxicology 2010;
48:944-950.
157. Guven A, Guven A, Gulmez M. The Effect of Kefir on the Activities of
GSH-Px, GST, CAT, GSH and LPO Levels in Carbon TetrachlorideInduced Mice Tissues . J. Vet. Med. B 2003; 50: 412–416.
158. Güven A, Yılmaz S. The Effect of Carbon Tetrachloride (CCI 4 ) and
Ethanol ( C2H5OH ) on the Determination of Levels Glutathione
Peroxidase, Catalase, Glucose-6-Phosphate Dehidrogenase and Lipid
Peroxidation Liver and Kidney in the Goose . Kasfkas Üniv. Vet. Fak.
Derg. 2005; 11(2): 113-117.
159. Karadenız A, Yıldırım A, Karakoc A, Kalkan A, Kalkan Y, Celebi F.
Protective effect of Panax ginseng on carbon tetrachloride induced liver,
heart and kidney injury in rats. Revue Med. Vet. 2009; 160(5): 237-243.
160. Özer AB, Kaman D. Effects of Epigallocatechin 3- Gallate in Rat
Cardiac Tissue on Oxidant and Antioxidant System Exposed to
Sevoflurane Anesthesia. Fırat Tıp Dergisi 2007; 12(2): 93-96.
161. Li T, Singal PK. Adriamycin-Induced Early Changes in Myocardial
Antioxidant Enzymes and Their Modulation by Probucol . Circulation.
2000; 102: 2105-2110.
162. Rajesh MG, Latha MS. Protective activity of Glycyrrhiza glabra Linn.
on carbon tetrachloride-induced peroxidative damage. Indian J Pharmacol
2004; 36 : 284-287.
163. Rose WC. New aspects of glutathione biochemistry and transport
selective alteration of glutathione metabolism. Nutrition Rev 1984; 42 (12):
397-410.
164. Meister A. Selective moification of glutathione metabolism. Science
1983; 220: 472-477.
128
165. Manna P, Sinha M, Sil PC. Aqueous extract of Terminalia arjuna
prevents carbon tetrachloride induced hepatic and renal disorders. BMC
Complementary and Alternative Medicine 2006; 6: 33 .
166. Tirkey N, Pilkhwal S, Kuhad A, Chopra K. Hesperidin, a citrus
bioflavonoid, decreases the oxidative stress produced by carbon
tetrachloride in rat liver and kidney. BMC Pharmacology 2005; 5: 2.
167. Lesiuk SS, Czechowska
G, Zimmer
MS, Slomka M, Madro A,
Celinski K, et al. Catalase, superoxide dismutase, and glutathione
peroxidase activities in various rat tissues after carbon tetrachloride
intoxication. J Hepatobiliary Pancreat Surg 2003; 10: 309–315.
168. .
Adams JD, Klaindman LK, Odunze LN, Shen HC,
Miller CA.
Alzheimer‘s and Parkinson‘s dissease: Brain levels of glutathione,
glutathione disulfide and vitamin E. Mol Chem Neuropathol 1991; 14:
213–226.
169.
Jones, Eklow L, Thor H, Orrenius S. Metabolism of hydrogen
peroxide in isolated hepatocytes: Relative contribution of catalase and
glutathione peroxidase in decomposition of endogenously generated H 2O2.
Arch Biochem Biophys 1981; 210: 505-506.
170. Del Maestro R, Mc Donald W. Distribution of superoxide dismutase,
glutathione peroxidase and catalase in developing rat brain. Mech Ageing
Dev 1987;41: 29–38.
171. Somani SM, Ravi R, Rybak LP. Effect of exercise training on
antioxidant system in brain region of rat. Pharmacol Biochem Behav 1995;
50(4): 635–639.
172. Maestro RD, McDonald W. Distribution of superoxide dismutase,
glutathione peroxidase and catalase in developing rat brain. Mech Ageing
Dev 1987; 41: 29–38.
173. Kish SJ, Morito C, Hornykiewicz O. Glutathione peroxidase activity in
Parkinson‘s disease brain. Neurosci Lett 1985; 58: 343–346.
129
174. Tabatabaie T, Floyd RA. Susceptibility of glutathione peroxidase and
glutathione reductase to oxidative damage and the protective effect of spin
trapping agents. Arch Biochem Biophys 1994; 314: 112-119.
175. Liebert J, Matlawska I, Bylka W, Murias M. Protective effect of
aquilegia vulgaris on APAP induced oxidative stress in rats. J.
Ethnopharm. 2005; 97: 351-358.
176. Torres VM, Srdjenovic B, Jacevic V, Simic DV, Djordjevic A, Simplício
AS.
Fullerenol
C60(OH)24
prevents
doxorubicin-induced
acute
cardiotoxicity in rats. Pharmacological reports 2010; 62: 707-718.
177. Jalili S,Ilkhanipour M, Heydari R, Farshid AA, Salehi S. The Effects of
Vitamin E on Endosulfan-Induced Oxidative Stress in Rat Heart . Pakistan
Journal of Nutrition 2007; 6(4): 375-380.
178. Prohaska JR. Changes in Cu, Zn-superoxide dismutase, cytochrome
C oxidase, glutathione peroxidase and glutathione transferase activities in
copper deficient mice and rats. J Nutr 1991; 121: 355–363.
179. Blum J, Fridovich I. Inactivation of glutathione peroxidase by
superoxide radical. Arch. Biochem. Biophys. 1985; 240: 500-508.
180.
Hess ML, Manson NH. The oxygen free radical system and
myocardial dysfunction. Adv Myocardiol. 1985; 5: 177–181.
181. Dhalla AK, Hill MF, Singal PK. Role of oxidative stress in transition of
hypertrophy to heart failure. J Am Coll Cardiol. 1996; 28: 506–514.
182. Doroshow JH, Locker GY, Myers CE. Enzymatic defenses of the
mouse heart against reactive oxygen metabolites. J Clin Invest. 1980; 65:
128–135.
183. Marklund L, Westman G, Lundgren E, Roos G. CuZn superoxide
dismutase,
Mn
superoxide
dismutase,
catalase
and
glutathione
peroxidase in normal and neoplastic cell lines and normal human tissue.
Cancer Res. 1982; 42: 1955–1961.
183. Janssen M, Van DeMeer P, DeJong JW. Antioxidant defences in rat,
pig,
guinea
pig,
and
human
hearts:
comparison
with
xanthine
oxidoreductase activity. Cardiovasc Res. 1993; 27: 2052–2057.
130
184. Jones TW, Thor H, Orrenius S. Against toxic substances. Arch
Toxicol Suppl 1986; 9: 259–271.
131
9. ÖZGEÇMİŞ
Adı
: Tülay
Soyadı
: ġAHĠN
Doğum Yeri ve Tarihi
: Elazığ, 26.10.1972
Eğitimi:
2004-
: Gazi Üniversitesi Saglık Bilimler Enstitüsü Tıbbi
Biyokimya Anabilim Dalı Doktora Eğitimi / ANKARA
1990-1996: Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi / ANKARA
1987-1990:Malatya Lisesi/ MALATYA
1984-1987: Atatürk Ortaokulu/ MALATYA
1979-1984:Barbaros Ġlkokulu/MALATYA
Yabancı Dili : Ġngilizce
132
10. TEŞEKKÜR
Doktora eğitimim boyunca, her konuda yardım ve
desteğini esirgemeyen, tez çalıĢmalarım süresince bilgi ve deneyimleriyle
beni yetiĢtiren, sabır ve anlayıĢına hayran olduğum, öğrencisi olmaktan
Ģeref duyduğum değerli hocam, tez danıĢmanım Tıbbi Biyokimya Anabilim
Dalı Baskanı Sayın Prof. Dr. Hatice PAġAOĞLU‘ na sonsuz saygı ve
teĢekkürlerimi sunarım.
ÇalıĢmalarımda verdiği destek ve yardımdan dolayı
baĢta Prof. Dr. Mustafa KAVUTÇU olmak üzere tüm Biyokimya Anabilim
Dalı Öğretim Üyeleri‘ ne teĢekkürü bir borç bilirim.
Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyelerinden Prof.
Dr. Suna ÖMEROĞLU‘na, yardımlarını esirgemeyen Uzm. Dr. NeĢe
LORTLAR UÇANKUġ‘a; tez çalıĢmamda sonsuz yardımları ve desteği
olan, bilgi ve tecrübesine güvendiğim ve sürekli bu desteği bana
hissettiren arkadaĢım Uzm. Dr. Canan YILMAZ DEMĠRTAġ ‘a sonsuz
sevgilerimi ve teĢekkürlerimi sunarım. Tez çalıĢmam aĢamasında
yardımlarını esirgemeyen Uzm. Dr. Seda DUYGULU DEVAY ve Dr.
Ahmed HUSSEIN‘e teĢekkür ederim.
Tüm eğitim hayatım boyunca beraber yol aldığımız;
güleryüzlü, çalıĢkan ve hoĢgörülü canım arkadaĢım Dr.Bedriye KĠTĠZ‘e
teĢekkür ederim.
Bugünlere gelmemde büyük emekleri olan sevgili aileme; her
zaman yanımda olarak desteğini esirgemeyen eĢim Dr.Ġhsan ġahin‘e ve
canım çocuklarım; Sılanur ve Tarık ġamil‘e teĢekkür ederim.
Dr.Tülay ġAHĠN
133
134