22.3.2016 • Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) (DNA’nın in vitro çoğaltılması) Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler-5 2 • Hücrede doğal olarak (in vivo)gerçekleşen replikasyon, in vitro koşullarda da (hücre dışında) yapılabilmektedir. • PCR ile istenilen genlerin ya da DNA dizilerinin replikasyonu hızlandırılmış bir şekilde gerçekleştirilir. • Doğal hücre bölünmesinde olduğu gibi, PCR replikasyon sürecini taklit ederek yaklaşık 30 jenerasyon sonra seçilmiş bir DNA dizisinin yaklaşık milyar katını elde edebilir. İn vitro koşullarda DNA çoğaltılmasının nedenlerinden başlıcaları: - özgün bir DNA parçasının bol miktarda elde edilmesi, moleküler analizinin yapılması -Genetik mühendisliği amaçları doğrultusunda rekombinant organizmalar elde etmek üzere gen aktarımı için 3 • Polimeraz zincir reaksiyonu spesifik bir DNA parçasının kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek, enzimatik olarak sentezlenmesine dayanan in vitro bir yöntemdir. • 1980 yılında Cetus (Kary Millus) firması araştırıcıları tarafından geliştirilmiş; ardından temel moleküler biyolojik araştırmalarda (klonlama, dizi analizi, DNA haritalaması gibi) ve birçok hastalığın (orak hücre anemisi, kistik fibrosis, AIDS, lösemi vb) DNA temeline dayalı tanısı için de klinik tıpta hızla kullanılmaya başlanmıştır. • PCR ile insan genomik DNA’sı gibi kompleks DNA kalıplarından spesifik DNA parçalarının sentezinin birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir hale gelmesi, bu teknolojinin yaygınlaşmasında başlıca neden olmuştur. 5 4 Polimeraz zincir reaksiyonunun oluşum mekanizması • PCR, çift iplikli bir DNA molekülünde hedef zincirlere iki oligonükleotit primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır. • Kalıp DNA molekülleri yüksek sıcaklıklarda denatüre edildikten sonra, primerler tek iplikli DNA molekülleri üzerinde kendilerine tamamlayıcı olan bölgelerle düşük sıcaklıklarda birleşir. • DNA polimeraz enzimi, uygun tampon ve 4 çeşit deoksiribonükleotit trifosfat (dNTP) varlığında primerin 3’OH ucundan uzamasını sağlar. • Böylece kalıp DNA ipliğine tamamlayıcı olan yeni DNA molekülü sentezlenmiş olur. 6 1 22.3.2016 Bir PCR döngüsü; PCR’ın temel bileşenleri •Denatürasyon •Primerlerim bağlanması (annealing) •Uzama (extention) Olarak adlandırılan 3 aşamadan oluşur. Ardarda tekrarlanan bu aşamalarla DNA parçaları üssel olarak artar. n döngü sonrasında 2n ürün oluşur. Kalıp DNA olarak kullanılan DNA molekülü DNA polimeraz enzimi Primerler dNTP karışımı Tampon ve MgCl2 8 Kalıp DNA Hücre membranının parçalanması Çoğaltılacak olan DNA saf bir şekilde hücreden izole edilir: 1) Hücrenin parçalanması ile yüksek molekül ağırlıklı DNA’nın açığa çıkması, 2-Denatürasyon veya proteoliz ile DNA-protein kompleksinin ayrılması ve DNA’nın çözünür duruma getirilmesi, 3-DNA’nın basit enzimatik ve/veya kimyasal yöntemlerle proteinler, RNA ve diğer makromoleküllerden ayrılması, Membran lipitlerinin ayrılması Hücre içi ve DNA’ya bağlı proteinlerin uzaklaştırılması DNA’nın çöktürülmesi Fiziksel, kimyasal ve enzimatik yolla SDS (sodium dodesil sülfat) CTAB (setiltrimetil bromid gibi deterjanlar ile Proteinaz Soğuk etanol veya isopropanol ile 9 10 Polimerazlar • DNA polimeraz enzimleri, kalıp ipliğe tamamlayıcı bir DNA ipliği meydana getirmek üzere, orijinal kalıp iplikteki baz bilgisini kullanarak 4 çeşit dNTP’ den uzun polinükleotit zincirinin sentezini kataliz ederler. • Bu enzimler, sentezi başlatmak için kalıp DNA’daki tamamlayıcı diziye bağlanan kısa DNA parçalarına (primer) gerek duyarlar. Sentezin yönü 5’ uçtan 3’ uca doğru olup, primerin serbest 3’ OH ucuna ortamdaki dNTP’ler eklenir. Günümüzde yaygın olarak termostabil DNA polimerazlar kullanılmaktadır: • Taq • Amplitaq • Hot tub • Pyrostase • Vent • pfu Genellikle Thermoccus aquaticus’tan izole edilen Taq DNA polimeraz kullanılır. Bu enzim DNA’nın denatürasyon sıcaklığında (95 °C) aktivitesini koruyabilmektedir. 12 2 22.3.2016 Primerler • DNA’nın çoğaltılması için kalıp DNA’ya tamamen tamamlayıcı olan primere gereksinim vardır. • Primerler laboratuvarlarda oluşturulan kısa zincirli DNA molekülleridir • 20-30 nükleotit uzunluğundadırlar. • Primer tasarımı yaparken çoğaltılması istenen DNA dizisinin iki ucundaki dizisi bilinen kısımlar dikkate alınır. Bu bölgelere tamamlayıcı olan primerler tasarlanır. • Primer tasarımını araştırıcı ilgilendiği gen veya DNA parçalarına uygun olarak kendisi yapmak durumundadır. • Tasarım yapılırken mümkün olduğunca 4 bazın eşit sayıda kullanımına dikkat edilmeli. • Primerler birbirlerine tamamlayıcı olmamalıdır 13 dNTP (deoksiribonükleotit trifosfat) karışımı • dATP, dGTP, dTTP, dCTP • Yüksek saflıkta ticari olarak tek tek veya karışım halinde sağlanır. • Normal koşullarda PCR 100 ɥM dNTP konsantrasyonu ile gerçekleştirilir. • Ayrıca optimal dNTP konsantrasyonu MgCl2 konsantrasyonuna Reaksiyon koşullarına Primer konsantrasyonuna Çoğaltılmış ürünün boyuna PCR döngü sayısına bağlıdır Yapılacak PCR için en uygun dNTP konsantrasyonu deneysel olarak belirlenmelidir. Tamponlar ve MgCl2 • Enzime (Taq) özgü tamponlar kullanılır (Genellikle KCl ve Tris HCl içeren tamponlar) • Çoğunlukla satın alınan enzimle birlikte 10X konsantrasyonda sağlanabilmektedir. 16 Genellikle optimum MgCl2 konsantrasyonu 1.0-1.5 mM arasındadır. MgCl2’ün PCR’ın verimi üzerine önemli etkisi vardır: • Mg+2 iyonları dNTP’ler ile çözünebilir kompleksler oluşturur • Polimeraz aktivitesini stimüle ederler, • Primer/ kalıp etkileşimi sağlarlar Düşük MgCl2 konsantrasyonu, ürün oluşumunda azalmaya; Yüksek MgCl2 konsantrasyonu ise spesifik olmayan ürün birikimine yol açar. • MgCl2 tamponla birlikte veya ayrı olarak sağlanabilir. • MgCl2 içeren tamponlar kullanılıyorsa ayrıca MgCl 2 kullanıma gerek yoktur. 3 22.3.2016 PCR aletlerinde DNA’nın çoğaltılması 3 aşamada gerçekleşir PCR’ın yapılışı PCR aletleri (thermal cycler) 1) denatürasyon (92-95 C/1-2 dak) 2) primerlerin bağlanması (annealing) (50-55 C/1-2 dak) 3) zincirin uzaması (72 C/1-2dak) Bu süre ve sıcaklıklar peşpeşe uygulanarak 25-35 döngü olarak gerçekleştirilir • PCR farklı sıcaklık derecelerini istenilen sürelerde otomatik olarak ayarlayabilen özel aletlerde gerçekleştirilir. • İşlem mikrotüpler içinde yapılır Bu işlem 25-35 kez tekrarlanır (döngü). 19 20 PCR ürünlerinin belirlenmesi ve analizi • PCR ürünleri boyları primerlerle sınırlandırılmış DNA parçalarıdır. PCR ürünlerinin analizi ile genellikle 3 çeşit bilgi edinilebilir; 1) hedef DNA dizisinin varlığının ve taşıdığı varyasyonun belirlenmesi 2) Başlangıç materyali olarak kullanılan DNA yada RNA nın kabaca yada kesin miktarının belirlenmesi için PCR ürününün miktarının ölçülmesi. 3) Dizi analizi 21 PCR’da kontaminasyondan korunma • Çoğaltılmış ürünlerin saptanması ve doğrulanması için çeşitli yöntemler kullanılabilir. • En basit ve genel olanı elektroforezdir. Böylece çoğaltılmış ürünün boyutu belirlenebilir. • Bir PCR ürününün tanımlanması ve doğrulanması için Southern blot veya Dot blot melezlemesi yöntemleri kullanılabilir. Burada radyoaktif veya radyoaktif olmayan problarla ürün saptanır PCR’da kontaminasyondan korunmak için alınabilecek çeşitli önlemler: PCR çalışmasının steril kabinde veya özel bir laboratuvarda yapılması Kullanılacak malzeme ve bileşenlerin genel laboratuvar donanımından ayrılmaları gerekir Kullanılacak malzeme ve materyallerin, çözeltilerin steril edilmeleri, sterilizasyon için otoklav kullanımının tercih edilmesi 4 22.3.2016 Araştırıcıların eldiven, önlük, korucuyu gözlük vb kullanmaları PCR’ın kullanım alanları Tampon ve dNTP’ler gibi PCR bileşenlerinin stok çözeltilerinden kaynaklanabilecek kontaminasyonu engelleyebilmek için uygun miktarda saklanabilecek şekilde hazırlanmaları PCR için uygunluğu üretici firmanın garantisinde olan bileşenlerin kullanılmaları • PCR kullanımı kolay, oldukça duyarlı, özgün ve yüksek derecede verimlidir. • Koşullar iyi optimize edilmişse hemen hemen hiç yanlış baz eşleşmesi olmaz. • Gen klonlaması ve dizi analizleri için oldukça kullanışlıdır. Gen bölgeleri bilindiğinde istenilen gen veya genler kolaylıkla çoğlatılabilir. • PCR aynı zamanda farklı kaynaklardan olan genleri çoğaltarak karşılaştırmalı veya filogenetik çalışmalarda kullanılır. Kaliteli pipetler ve pipet uçlarının tercih edilmesi 26 DNA dizi analizi • Çok duyarlı bir teknik olduğundan çok küçük miktarlardaki DNA’yı çoğaltmak için de kullanılır. Örn: mumyalanmış insan kalıntıları ve fosilleşmiş bitki ve hayvanlardan elde edilen DNA’ları çoğaltmak için kullanılmaktadır. DNA molekülündeki bazların diziliminin belirlenmesinde genel olarak iki yöntem vardır • Bireylerin tanımlanmasını veya bireyler arasındaki ilişkiyi küçük bir miktar DNA örneğinden belirlemede kullanılan güçlü bir adli tıp aracı olan DNA parmak izinde de kullanılmaktadır. 1) Maxam Gilbert Yöntemi (kimyasal yöntem) 2) Sanger yöntemi (Enzimatik zincir sonlandırma yöntemi) DNA dizi analizi ile: • Proteinleri kodlayan gen bölgeleri belirlenebilir • DNA tarafından kodlanan diğer RNA’ların dizileri belirlenebilir (rRNA, tRNA) • Bir organizmanın genomu belirlenebilir. • Genetik hastalıkların teşhisi • GDO’lu ürünlerin tespiti 27 • Her iki yöntemde de dizisi yapılacak olan DNA bölgesinin fragmentlerine ihtiyaç vardır. • Günümüzde Dizi analizlerinin çoğu Sanger yöntemi ile yapılmaktadır. 28 • Dideoksi nükleotitler (ddNTP) deoksinükleotitlerin 3’-OH grubunun O atomunun uzaklaştırılması ile oluşturulmuş nükleotitlerdir. • Bu yöntem temel olarak PCR’a benzer: Dizisi belirlenecek bölgeye ait primerlere ihtiyaç vardır Zincir uzaması DNA polimeraz enzimi ile gerçekleştirilir. dNTP ‘ler (dATP, dGTP, dTTP,dCTP) Ayrıca dNTP’lerin dideoksi analoglarına ihtiyaç vardır ddNTP’ler 3’ grubunda O olmadığı için fosfodiester bağı yapamazlar. Yani bu gruba yeni bir nükleotit eklenemez. Sentez durur. Bunlar zincir sonlandırma amacı ile kullanılır. BU SANGER YÖNTEMİNİN TEMELİNİ OLUŞTURUR. 29 30 5 22.3.2016 Analiz tüpüne dNTP’ler ddNTP’ler primerler ve DNA polimeraz eklenir • ddNTP’lerin her biri farklı renklerde floresan boyalarla işaretlenir • A –yeşil • G-siyah • C-mavi • T-kırmızı • • • dNTP’lerden daha az miktarlarda ddNTP kullanılır (ddNTP/dNTP=1/300) Reaksiyon devam ederken uygun dNTP ve ddNTP’ler rastgele zincire eklenir. dNTP’lerin sayısı fazla olduğu için eklenme oranları daha fazla olacaktır zincire ddNTP’ler geldiği zaman reaksiyon duracaktır. Bu şekilde milyarlarca farklı uzunlukta DNA kopyası oluşur 31 • Sentezleme sırasında bütün zincirler aynı nükleotit dizisi ile başlayacak ve sentez durduğu zaman bütün zincirlerin sonunda bir ddNTP olacaktır. Ve bu oluşan farklı uzunluktaki dizilerin her birinden milyonlarca olacaktır. 32 • Oluşan fragmanların boyutlarını belirlemek için reaksiyon sonrası elde edilen ürün poliakrilamid jel içeren kapiler kolona yüklenir. Poliakrilamit Agaroz jelden daha iyi rezolüsyona sahiptir ve 1 baz faklı dizileri ayırabilir. Örn 400 baz ve 401 baza sahip olan diziler ayrı bant verir. • Elektroforezde elektrik akımı uygulanarak yük farklarına göre moleküller ayrılır. Daha kısa zincirli moleküller daha hızlı ilerlerler ve boyutlarına göre ayrılırlar. • Kolon çıkışında herbir ddNTP’ın oluşturduğu florosan laser dedektörde belirlenir ve kaydedici tarafından kaydedilir ve elektrofogramlar oluşturulur. • Daha sonra her sentezlenen dizinin boyutları belirlenerek dizideki bazların yeri belirlenebilir. 33 34 Real time PCR (gerçek zamanlı PCR) • Real time-PCR, reaksiyon oluşurken aynı zamanda monitörden de izlenmesini de sağlamaktadır. • Floresan yöntemler kullanılarak nükleik asit miktarları da belirlenebilmektedir. • PCR çoğaltımını görünür hale getiren ve monitörize edebilen floresan işaretli prob ve boyalar kullanılır ve floresan oluşan DNA ile doğru orantılı olarak artar. • Aynı zamanda miktarda belirlendiği için kantitatif PCR (quantitative-PCR; qPCR) da denir. 35 6 22.3.2016 • DNA standart PCR ile aynı prensibe göre çoğaltılır. Farkı reaksiyon devam ederken oluşan ürün miktarı da belirlenir. • Real time-PCR’da ürün miktarını belirmek için 2 genel yöntem bulunmaktadır: 1) Çift zincirli DNA’ya bağlanan, spesifik olmayan floresan boya kullanımı 2) Floresan haberci boya ile işaretlenmiş olan sekans spesifik probların kullanımı 1) Çift zincirli DNA’ya bağlanan, spesifik olmayan floresan boya kullanımı Çift zincirli DNA’ya bağlandığında floresan özellik gösteren bir boya kullanılır. Ortamdaki DNA miktarı arttıkça floresan yoğunluğu da DNA miktarı ile doğru orantılı olarak artar. Böylece boyanın yaydığı ışığın ölçümüyle DNA miktarı belirlenir. Bu amaçla genellikle SYBR-Green kullanılır. (SYBR-green 497 nm dalgaboyunda ışığı absobe eder ve 522 nm’de emisyon yapar. • Reaksiyon koşulları standart PCR ile aynıdır. Tek farkı, ortama SYBR- Green ilave edilir. • Reaksiyon qPCR cihazında gerçekleştirilir. Her döngü sonrasında, cihazdaki dedektörle floresan seviyesi ölçülür. • Burada konsantrasyonu biline bir standart ta kullanılarak buna göre oluşan DNA miktarı belirlenir. 2) Floresan haberci boya ile işaretlenmiş olan sekans spesifik probların kullanımı • Floresan haberci problar ile sadece kullanılan prob ile eşleşebilen DNA’ların analizi yapılabilir. Reaksiyon sırasında polimeraz ile prob nükleotitlerine ayrılır ve böylece söndürücü etkisini kaybederek haberci floresan özellik gösterir. • Bu nedenle bu yöntem daha spesifiktir. • Bu yöntemde DNA bazlı bir prob kullanılır ve probun bir ucu floresan boya ile işaretlenmiştir. Diğer ucu ise söndürücü ile işaretlenmiştir. Probda haberci ile söndürücü birbirine yakın olduğunda söndürücü habercinin floresan etkisini engeller. Bu emisyon dedektörde ölçülür. Her döngü de emisyon miktarı DNA miktarı ile orantılı olarak artar ve böylece miktar belirlenir. 7 22.3.2016 • PCR koşulları standart PCR’da olduğu gibidir. Ortama ayrıca haberci prob ilave edilir. • Reaksiyon başladığında hem prob hem de primerler kalıp DNA ile eşleşir. • Polimeraz primerlerden başlayarak yeni DNA sentezini gerçekleştirir. • Polimeraz enzimi probun olduğu bölgeye geldiğinde 5’-3’ ekzonükleaz aktivitesi ile probu nükleotitlerine ayırır. Böylece floresan haberci söndürücüden ayrılarak floresan özellik gösterir. • Ölçülen floresan, oluşan DNA miktarı ile orantılır. Amplifikasyon eğrisi Tipik bir PCR 2 fazdan oluşur: -Eksponensiyel faz -Eksponensiyel olmayan faz. Cq değeri: Floresan ölçümünün yapılabildiği döngü sayısı Başlangıçtaki DNA miktarı fazla ise Cp değeri düşük; az ise yüksektir. Amplifikasyon eğrisi Nükleik asit hibridizasyonu ve Southern Blot • Nükleik asit hibridizasyon (melezleme) yöntemleri; tek iplikli nükleik asit moleküllerinin tamamlayıcı dizileri ile uygun koşullar altında kendiliğinden eşleşerek çift iplikli melez moleküller oluşturmasıdır. • Prob: tanımlanmak istenen nükleik asit bölgesini tamamlayıcı olan ve belirleyici olarak kullanılan tek iplikli nükleik asit parçalarıdır. Problar 100-1000 nükleotitlerden oluşur. Hibridizasyonla oluşan çift zincirli molekülü görünür hale getirilmesi için probları radyoaktif veya radyoaktif olmayan bir belirleyici ile işaretlenmesi gerekir. • Hibridizasyon reaksiyonları tamamlayıcı nükleotit dizileri içeren tüm tek iplikli nükleik asit molekülleri (DNA/DNA, RNA/DNA) arasında gerçekleşebilir. • Bu yöntem hem DNA hem RNA üzerindeki belirli nükleotit dizilerinin tanımlanmasında kullanılır. • Bunun için araştırılan nükleik asit dizisini tamamlayıcı olan tek iplikli (dizisi bilinen) nükleik asit dizilerine ihtiyaç vardır. Bunlara prob denir 47 48 8 22.3.2016 Southern blot • Southern blot bir genomdaki spesifik genlerin belirlenmesinde kullanılır. • Hibridizasyon farklı genetik materyallerden benzer dizileri veya özel bir genin bulunduğu yeri bulmak için oldukça faydalı olabilir. • RE ile kesilen DNA fragmentlerinin agaroz jel elektroforezinde ayrılması ve ayrılan fragmentlerin membran filtreye aktarıldıktan sonra DNA problarıyla eşleştirilmesine dayanır. • DNA, RE ile kesildikten sonra jel elektroforezi ile ayrılarak DNA zincirlerini hibritleştirmek için Southern blot tekniği kullanılır. 49 50 • Membrana DNA emdirilmiş ve prob olarak RNA veya DNA’nın kullanıldığı hibridizasyon prosedürü Southern blottur 1- büyük molekül ağırlıklı DNA RE ile fragmentlere ayrılır 2- Agaroz jelde boyutlarına göre ayrılır. • Eğer membrana RNA emdirilmiş ve prob olarak RNA veya DNA kullanılıyorsa buna Northern blot denir 3- Jel üzerinde DNA’nın denatürasyonunu için NaOH uygulanır 4. Ayrılan zincirler nitoselüloz membrana aktarılır. Zincirler membrana fikse edildiklerinden kendi kendileriyle yeniden eşleşmeleri önlenir 5- Membrana aktarılan DNA fragmentleri işaretlenmiş Hibridizasyon probları ile muamele edilir 6- Hibridizasyondan sonra membran yıkanarak eşleşmeyen DNA fragmentleri uzaklaştırılır. Hibridizasyon membrana bağlanmış olan işaret molekülünü araştırarak belirlenir • Röntgen filmi ile görüntülenir 51 52 • Blotlama teknikleriyle bir genomda spesifik bir genin olup olmadığı ve bu genden kaç tane olduğu belirlenebilir. 53 9
