Slayt 1

22.3.2016
• Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
(DNA’nın in vitro çoğaltılması)
Moleküler Biyolojide Kullanılan
Yöntemler-5
2
• Hücrede doğal olarak (in vivo)gerçekleşen replikasyon, in vitro
koşullarda da (hücre dışında) yapılabilmektedir.
• PCR ile istenilen genlerin ya da DNA dizilerinin
replikasyonu hızlandırılmış bir şekilde gerçekleştirilir.
• Doğal hücre bölünmesinde olduğu gibi, PCR
replikasyon sürecini taklit ederek yaklaşık 30
jenerasyon sonra seçilmiş bir DNA dizisinin yaklaşık
milyar katını elde edebilir.
İn vitro koşullarda DNA çoğaltılmasının nedenlerinden
başlıcaları:
- özgün bir DNA parçasının bol miktarda elde edilmesi,
moleküler analizinin yapılması
-Genetik mühendisliği amaçları doğrultusunda rekombinant
organizmalar elde etmek üzere gen aktarımı için
3
• Polimeraz zincir reaksiyonu spesifik bir DNA parçasının
kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek, enzimatik
olarak sentezlenmesine dayanan in vitro bir yöntemdir.
• 1980 yılında Cetus (Kary Millus) firması araştırıcıları tarafından
geliştirilmiş;
ardından
temel
moleküler
biyolojik
araştırmalarda (klonlama, dizi analizi, DNA haritalaması gibi)
ve birçok hastalığın (orak hücre anemisi, kistik fibrosis, AIDS,
lösemi vb) DNA temeline dayalı tanısı için de klinik tıpta hızla
kullanılmaya başlanmıştır.
• PCR ile insan genomik DNA’sı gibi kompleks DNA kalıplarından
spesifik DNA parçalarının sentezinin birkaç saat içinde
gerçekleştirilebilir
hale
gelmesi,
bu
teknolojinin
yaygınlaşmasında başlıca neden olmuştur.
5
4
Polimeraz zincir reaksiyonunun oluşum mekanizması
• PCR, çift iplikli bir DNA molekülünde hedef zincirlere iki oligonükleotit
primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır.
• Kalıp DNA molekülleri yüksek sıcaklıklarda denatüre edildikten sonra,
primerler tek iplikli DNA molekülleri üzerinde kendilerine tamamlayıcı olan
bölgelerle düşük sıcaklıklarda birleşir.
• DNA polimeraz enzimi, uygun tampon ve 4 çeşit deoksiribonükleotit
trifosfat (dNTP) varlığında primerin 3’OH ucundan uzamasını sağlar.
• Böylece kalıp DNA ipliğine tamamlayıcı olan yeni DNA molekülü
sentezlenmiş olur.
6
1
22.3.2016
Bir PCR döngüsü;
PCR’ın temel bileşenleri
•Denatürasyon
•Primerlerim bağlanması (annealing)
•Uzama (extention)
Olarak adlandırılan 3 aşamadan oluşur.
Ardarda tekrarlanan bu aşamalarla DNA
parçaları üssel olarak artar. n döngü sonrasında
2n ürün oluşur.
Kalıp DNA olarak kullanılan DNA molekülü
DNA polimeraz enzimi
Primerler
dNTP karışımı
Tampon ve MgCl2
8
Kalıp DNA
Hücre membranının
parçalanması
Çoğaltılacak olan DNA saf bir şekilde hücreden izole edilir:
1) Hücrenin parçalanması ile yüksek molekül ağırlıklı DNA’nın
açığa çıkması,
2-Denatürasyon veya proteoliz ile DNA-protein kompleksinin
ayrılması ve DNA’nın çözünür duruma getirilmesi,
3-DNA’nın basit enzimatik ve/veya kimyasal yöntemlerle
proteinler, RNA ve diğer makromoleküllerden ayrılması,
Membran lipitlerinin
ayrılması
Hücre içi ve DNA’ya bağlı
proteinlerin uzaklaştırılması
DNA’nın çöktürülmesi
Fiziksel, kimyasal ve enzimatik yolla
SDS (sodium dodesil sülfat) CTAB (setiltrimetil bromid gibi
deterjanlar ile
Proteinaz
Soğuk etanol veya isopropanol
ile
9
10
Polimerazlar
• DNA polimeraz enzimleri, kalıp ipliğe
tamamlayıcı bir DNA ipliği meydana
getirmek üzere, orijinal kalıp iplikteki
baz bilgisini kullanarak 4 çeşit dNTP’
den uzun polinükleotit zincirinin
sentezini kataliz ederler.
• Bu enzimler, sentezi başlatmak için kalıp
DNA’daki tamamlayıcı diziye bağlanan
kısa DNA parçalarına (primer) gerek
duyarlar. Sentezin yönü 5’ uçtan 3’ uca
doğru olup, primerin serbest 3’ OH
ucuna ortamdaki dNTP’ler eklenir.
Günümüzde yaygın olarak termostabil DNA polimerazlar
kullanılmaktadır:
• Taq
• Amplitaq
• Hot tub
• Pyrostase
• Vent
• pfu
Genellikle Thermoccus aquaticus’tan izole edilen Taq DNA
polimeraz kullanılır.
Bu enzim DNA’nın denatürasyon sıcaklığında (95 °C) aktivitesini
koruyabilmektedir.
12
2
22.3.2016
Primerler
• DNA’nın çoğaltılması için kalıp DNA’ya tamamen
tamamlayıcı olan primere gereksinim vardır.
• Primerler laboratuvarlarda oluşturulan kısa zincirli
DNA molekülleridir
• 20-30 nükleotit uzunluğundadırlar.
• Primer tasarımı yaparken çoğaltılması istenen DNA dizisinin
iki ucundaki dizisi bilinen kısımlar dikkate alınır. Bu bölgelere
tamamlayıcı olan primerler tasarlanır.
• Primer tasarımını araştırıcı ilgilendiği gen veya DNA
parçalarına uygun olarak kendisi yapmak durumundadır.
• Tasarım yapılırken mümkün olduğunca 4 bazın eşit sayıda
kullanımına dikkat edilmeli.
• Primerler birbirlerine tamamlayıcı olmamalıdır
13
dNTP (deoksiribonükleotit trifosfat) karışımı
• dATP, dGTP, dTTP, dCTP
• Yüksek saflıkta ticari olarak tek tek veya karışım halinde
sağlanır.
• Normal koşullarda PCR 100 ɥM dNTP konsantrasyonu ile
gerçekleştirilir.
• Ayrıca optimal dNTP konsantrasyonu
 MgCl2 konsantrasyonuna
Reaksiyon koşullarına
Primer konsantrasyonuna
Çoğaltılmış ürünün boyuna
PCR döngü sayısına bağlıdır
Yapılacak PCR için en uygun dNTP konsantrasyonu deneysel olarak
belirlenmelidir.
Tamponlar ve MgCl2
• Enzime (Taq) özgü tamponlar kullanılır (Genellikle KCl
ve Tris HCl içeren tamponlar)
• Çoğunlukla satın alınan enzimle birlikte 10X
konsantrasyonda sağlanabilmektedir.
16
Genellikle optimum MgCl2 konsantrasyonu 1.0-1.5 mM
arasındadır.
MgCl2’ün PCR’ın verimi üzerine önemli etkisi
vardır:
• Mg+2 iyonları dNTP’ler ile çözünebilir
kompleksler oluşturur
• Polimeraz aktivitesini stimüle ederler,
• Primer/ kalıp etkileşimi sağlarlar
 Düşük MgCl2 konsantrasyonu, ürün oluşumunda
azalmaya;
 Yüksek MgCl2 konsantrasyonu ise spesifik olmayan
ürün birikimine yol açar.
• MgCl2 tamponla birlikte veya ayrı olarak sağlanabilir.
• MgCl2 içeren tamponlar kullanılıyorsa ayrıca MgCl 2
kullanıma gerek yoktur.
3
22.3.2016
PCR aletlerinde DNA’nın
çoğaltılması 3 aşamada
gerçekleşir
PCR’ın yapılışı
PCR aletleri (thermal cycler)
1) denatürasyon (92-95 C/1-2 dak)
2) primerlerin bağlanması (annealing)
(50-55 C/1-2 dak)
3) zincirin uzaması (72 C/1-2dak)
Bu süre ve sıcaklıklar peşpeşe
uygulanarak 25-35 döngü olarak
gerçekleştirilir
• PCR farklı sıcaklık derecelerini istenilen sürelerde otomatik
olarak ayarlayabilen özel aletlerde gerçekleştirilir.
• İşlem mikrotüpler içinde yapılır
Bu işlem 25-35 kez
tekrarlanır (döngü).
19
20
PCR ürünlerinin belirlenmesi ve
analizi
• PCR ürünleri boyları primerlerle sınırlandırılmış DNA
parçalarıdır. PCR ürünlerinin analizi ile genellikle 3 çeşit bilgi
edinilebilir;
1) hedef DNA dizisinin varlığının ve taşıdığı varyasyonun
belirlenmesi
2) Başlangıç materyali olarak kullanılan DNA yada RNA nın
kabaca yada kesin miktarının belirlenmesi için PCR ürününün
miktarının ölçülmesi.
3) Dizi analizi
21
PCR’da kontaminasyondan korunma
• Çoğaltılmış ürünlerin saptanması ve doğrulanması için çeşitli
yöntemler kullanılabilir.
• En basit ve genel olanı elektroforezdir. Böylece çoğaltılmış
ürünün boyutu belirlenebilir.
• Bir PCR ürününün tanımlanması ve doğrulanması için
Southern blot veya Dot blot melezlemesi yöntemleri
kullanılabilir. Burada radyoaktif veya radyoaktif olmayan
problarla ürün saptanır
PCR’da kontaminasyondan korunmak için alınabilecek çeşitli
önlemler:
 PCR çalışmasının steril kabinde veya özel bir laboratuvarda
yapılması
 Kullanılacak malzeme ve bileşenlerin genel laboratuvar
donanımından ayrılmaları gerekir
 Kullanılacak malzeme ve materyallerin, çözeltilerin steril
edilmeleri, sterilizasyon için otoklav kullanımının tercih
edilmesi
4
22.3.2016
 Araştırıcıların eldiven, önlük, korucuyu gözlük vb
kullanmaları
PCR’ın kullanım alanları
 Tampon ve dNTP’ler gibi PCR bileşenlerinin stok
çözeltilerinden kaynaklanabilecek kontaminasyonu
engelleyebilmek için uygun miktarda saklanabilecek
şekilde hazırlanmaları
 PCR için uygunluğu üretici firmanın garantisinde olan
bileşenlerin kullanılmaları
• PCR kullanımı kolay, oldukça duyarlı, özgün ve yüksek
derecede verimlidir.
• Koşullar iyi optimize edilmişse hemen hemen hiç yanlış baz
eşleşmesi olmaz.
• Gen klonlaması ve dizi analizleri için oldukça kullanışlıdır. Gen
bölgeleri bilindiğinde istenilen gen veya genler kolaylıkla
çoğlatılabilir.
• PCR aynı zamanda farklı kaynaklardan olan genleri çoğaltarak
karşılaştırmalı veya filogenetik çalışmalarda kullanılır.
 Kaliteli pipetler ve pipet uçlarının tercih edilmesi
26
DNA dizi analizi
• Çok duyarlı bir teknik olduğundan çok küçük miktarlardaki
DNA’yı çoğaltmak için de kullanılır. Örn: mumyalanmış insan
kalıntıları ve fosilleşmiş bitki ve hayvanlardan elde edilen
DNA’ları çoğaltmak için kullanılmaktadır.
DNA molekülündeki bazların diziliminin belirlenmesinde
genel olarak iki yöntem vardır
• Bireylerin tanımlanmasını veya bireyler arasındaki ilişkiyi küçük
bir miktar DNA örneğinden belirlemede kullanılan güçlü bir adli
tıp aracı olan DNA parmak izinde de kullanılmaktadır.
1) Maxam Gilbert Yöntemi (kimyasal yöntem)
2) Sanger yöntemi (Enzimatik zincir sonlandırma yöntemi)
DNA dizi analizi ile:
• Proteinleri kodlayan gen bölgeleri belirlenebilir
• DNA tarafından kodlanan diğer RNA’ların dizileri
belirlenebilir (rRNA, tRNA)
• Bir organizmanın genomu belirlenebilir.
• Genetik hastalıkların teşhisi
• GDO’lu ürünlerin tespiti
27
• Her iki yöntemde de dizisi yapılacak olan DNA bölgesinin
fragmentlerine ihtiyaç vardır.
• Günümüzde Dizi analizlerinin çoğu Sanger yöntemi ile yapılmaktadır.
28
• Dideoksi nükleotitler (ddNTP) deoksinükleotitlerin 3’-OH
grubunun O atomunun uzaklaştırılması ile oluşturulmuş
nükleotitlerdir.
• Bu yöntem temel olarak PCR’a benzer:
 Dizisi belirlenecek bölgeye ait primerlere ihtiyaç vardır
 Zincir uzaması DNA polimeraz enzimi ile gerçekleştirilir.
 dNTP ‘ler (dATP, dGTP, dTTP,dCTP)
 Ayrıca dNTP’lerin dideoksi analoglarına ihtiyaç vardır
ddNTP’ler 3’ grubunda O olmadığı için fosfodiester bağı yapamazlar. Yani bu
gruba yeni bir nükleotit eklenemez. Sentez durur. Bunlar zincir sonlandırma
amacı ile kullanılır. BU SANGER YÖNTEMİNİN TEMELİNİ OLUŞTURUR.
29
30
5
22.3.2016
Analiz tüpüne
 dNTP’ler
 ddNTP’ler
 primerler
 ve DNA polimeraz eklenir
• ddNTP’lerin her biri farklı renklerde floresan
boyalarla işaretlenir
• A –yeşil
• G-siyah
• C-mavi
• T-kırmızı
•
•
•
dNTP’lerden daha az miktarlarda ddNTP
kullanılır (ddNTP/dNTP=1/300)
Reaksiyon devam ederken uygun dNTP
ve ddNTP’ler rastgele zincire eklenir.
dNTP’lerin sayısı fazla olduğu için
eklenme oranları daha fazla olacaktır
zincire ddNTP’ler geldiği zaman
reaksiyon duracaktır.
Bu şekilde milyarlarca farklı uzunlukta
DNA kopyası oluşur
31
• Sentezleme sırasında bütün zincirler aynı nükleotit
dizisi ile başlayacak ve sentez durduğu zaman bütün
zincirlerin sonunda bir ddNTP olacaktır. Ve bu oluşan
farklı uzunluktaki dizilerin her birinden milyonlarca
olacaktır.
32
• Oluşan fragmanların boyutlarını belirlemek için reaksiyon sonrası elde
edilen ürün poliakrilamid jel içeren kapiler kolona yüklenir. Poliakrilamit
Agaroz jelden daha iyi rezolüsyona sahiptir ve 1 baz faklı dizileri ayırabilir.
Örn 400 baz ve 401 baza sahip olan diziler ayrı bant verir.
• Elektroforezde elektrik akımı uygulanarak yük farklarına göre moleküller
ayrılır. Daha kısa zincirli moleküller daha hızlı ilerlerler ve boyutlarına göre
ayrılırlar.
• Kolon çıkışında herbir ddNTP’ın oluşturduğu florosan laser dedektörde
belirlenir ve kaydedici tarafından kaydedilir ve elektrofogramlar
oluşturulur.
• Daha sonra her sentezlenen dizinin boyutları
belirlenerek dizideki bazların yeri belirlenebilir.
33
34
Real time PCR (gerçek zamanlı PCR)
• Real time-PCR, reaksiyon oluşurken aynı zamanda monitörden
de izlenmesini de sağlamaktadır.
• Floresan yöntemler kullanılarak nükleik asit miktarları da
belirlenebilmektedir.
• PCR çoğaltımını görünür hale getiren ve monitörize edebilen
floresan işaretli prob ve boyalar kullanılır ve floresan oluşan
DNA ile doğru orantılı olarak artar.
• Aynı zamanda miktarda belirlendiği için kantitatif PCR
(quantitative-PCR; qPCR) da denir.
35
6
22.3.2016
• DNA standart PCR ile aynı prensibe göre çoğaltılır. Farkı
reaksiyon devam ederken oluşan ürün miktarı da belirlenir.
• Real time-PCR’da ürün miktarını belirmek için 2 genel yöntem
bulunmaktadır:
1) Çift zincirli DNA’ya bağlanan, spesifik olmayan floresan boya
kullanımı
2) Floresan haberci boya ile işaretlenmiş olan sekans spesifik
probların kullanımı
1) Çift zincirli DNA’ya bağlanan, spesifik
olmayan floresan boya kullanımı
Çift zincirli DNA’ya bağlandığında floresan özellik
gösteren bir boya kullanılır. Ortamdaki DNA
miktarı arttıkça floresan yoğunluğu da DNA
miktarı ile doğru orantılı olarak artar. Böylece
boyanın yaydığı ışığın ölçümüyle DNA miktarı
belirlenir.
Bu amaçla genellikle SYBR-Green kullanılır.
(SYBR-green 497 nm dalgaboyunda ışığı absobe
eder ve 522 nm’de emisyon yapar.
• Reaksiyon koşulları standart PCR ile aynıdır.
Tek farkı, ortama SYBR- Green ilave edilir.
• Reaksiyon qPCR cihazında gerçekleştirilir. Her
döngü sonrasında, cihazdaki dedektörle
floresan seviyesi ölçülür.
• Burada konsantrasyonu biline bir standart ta
kullanılarak buna göre oluşan DNA miktarı
belirlenir.
2) Floresan haberci boya ile işaretlenmiş olan
sekans spesifik probların kullanımı
• Floresan haberci problar ile sadece kullanılan prob ile
eşleşebilen DNA’ların analizi yapılabilir.
Reaksiyon sırasında polimeraz
ile prob nükleotitlerine ayrılır
ve böylece söndürücü etkisini
kaybederek haberci floresan
özellik gösterir.
• Bu nedenle bu yöntem daha spesifiktir.
• Bu yöntemde DNA bazlı bir prob kullanılır ve probun
bir ucu floresan boya ile işaretlenmiştir. Diğer ucu ise
söndürücü ile işaretlenmiştir. Probda haberci ile
söndürücü birbirine yakın olduğunda söndürücü
habercinin floresan etkisini engeller.
Bu emisyon dedektörde ölçülür.
Her döngü de emisyon miktarı
DNA miktarı ile orantılı olarak
artar ve böylece miktar
belirlenir.
7
22.3.2016
• PCR koşulları standart PCR’da olduğu gibidir. Ortama ayrıca
haberci prob ilave edilir.
• Reaksiyon başladığında hem prob hem de primerler kalıp DNA
ile eşleşir.
• Polimeraz primerlerden başlayarak yeni DNA sentezini
gerçekleştirir.
• Polimeraz enzimi probun olduğu bölgeye geldiğinde 5’-3’
ekzonükleaz aktivitesi ile probu nükleotitlerine ayırır. Böylece
floresan haberci söndürücüden ayrılarak floresan özellik
gösterir.
• Ölçülen floresan, oluşan DNA miktarı ile orantılır.
Amplifikasyon eğrisi
Tipik bir PCR 2 fazdan oluşur:
-Eksponensiyel faz
-Eksponensiyel olmayan faz.
Cq değeri: Floresan
ölçümünün yapılabildiği
döngü sayısı
Başlangıçtaki DNA miktarı
fazla ise Cp değeri düşük; az
ise yüksektir.
Amplifikasyon eğrisi
Nükleik asit hibridizasyonu ve
Southern Blot
• Nükleik asit hibridizasyon (melezleme) yöntemleri; tek iplikli nükleik asit
moleküllerinin tamamlayıcı dizileri ile uygun koşullar altında kendiliğinden
eşleşerek çift iplikli melez moleküller oluşturmasıdır.
• Prob: tanımlanmak istenen nükleik asit
bölgesini tamamlayıcı olan ve belirleyici olarak
kullanılan tek iplikli nükleik asit parçalarıdır.
Problar 100-1000 nükleotitlerden
oluşur.
Hibridizasyonla oluşan çift zincirli
molekülü görünür hale getirilmesi
için probları radyoaktif veya
radyoaktif olmayan bir belirleyici ile
işaretlenmesi gerekir.
• Hibridizasyon reaksiyonları tamamlayıcı nükleotit dizileri içeren tüm tek
iplikli nükleik asit molekülleri (DNA/DNA, RNA/DNA) arasında
gerçekleşebilir.
• Bu yöntem hem DNA hem RNA üzerindeki belirli nükleotit dizilerinin
tanımlanmasında kullanılır.
• Bunun için araştırılan nükleik asit dizisini tamamlayıcı olan tek iplikli (dizisi
bilinen) nükleik asit dizilerine ihtiyaç vardır. Bunlara prob denir
47
48
8
22.3.2016
Southern blot
• Southern blot bir genomdaki spesifik genlerin
belirlenmesinde kullanılır.
• Hibridizasyon farklı genetik materyallerden
benzer dizileri veya özel bir genin bulunduğu
yeri bulmak için oldukça faydalı olabilir.
• RE ile kesilen DNA fragmentlerinin agaroz jel
elektroforezinde ayrılması ve ayrılan
fragmentlerin membran filtreye aktarıldıktan
sonra DNA problarıyla eşleştirilmesine dayanır.
• DNA, RE ile kesildikten sonra jel elektroforezi
ile ayrılarak DNA zincirlerini hibritleştirmek
için Southern blot tekniği kullanılır.
49
50
• Membrana DNA emdirilmiş ve prob olarak RNA veya DNA’nın
kullanıldığı hibridizasyon prosedürü Southern blottur
1- büyük molekül ağırlıklı DNA RE ile fragmentlere ayrılır
2- Agaroz jelde boyutlarına göre ayrılır.
• Eğer membrana RNA emdirilmiş ve prob olarak RNA veya DNA
kullanılıyorsa buna Northern blot denir
3- Jel üzerinde DNA’nın denatürasyonunu için NaOH
uygulanır
4. Ayrılan zincirler nitoselüloz membrana aktarılır. Zincirler
membrana fikse edildiklerinden kendi kendileriyle
yeniden eşleşmeleri önlenir
5- Membrana aktarılan DNA fragmentleri işaretlenmiş
Hibridizasyon probları ile muamele edilir
6- Hibridizasyondan sonra membran yıkanarak
eşleşmeyen DNA fragmentleri uzaklaştırılır.
Hibridizasyon membrana bağlanmış olan işaret
molekülünü araştırarak belirlenir
• Röntgen filmi ile görüntülenir
51
52
• Blotlama teknikleriyle bir genomda spesifik bir
genin olup olmadığı ve bu genden kaç tane
olduğu belirlenebilir.
53
9