KROMOZOMLAR

KOÜ TIP FAKÜLTESİ
TIBBİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
DÖNEM I ÖĞRENCİ LABORATUVARI / 1
Kromozomlar, karyotipleme, CGH ve FISH
1
KROMOZOMLAR
Her hücrede genom, genomik DNA’nın çeşitli gruplara ait kromozomal proteinlerle
birleşmesinden oluşan kromatin halinde paketlenir. Kromatinde bulunan proteinlerin
bazıları yapısal rol oynarken diğer bir kısmı gen ekspresyonunu düzenler. Hücre
bölünmesi sırasındaki hariç, kromatin hücre çekirdeği içinde dağılmış vaziyettedir ve
mikroskop altında oldukça homojen bir görünüme sahiptir. Bununla birlikte, hücre
bölünürken çekirdek materyali yoğunlaşır mikroskobik olarak görülen kromozomlar belirir.
Kromozomlar sadece bölünme sırasında görülen özel yapılar olmasına rağmen
bütünlüklerini bölünmeler esnasında korurlar.
Figür 1: DNA’nın bazik histon proteinleri ile kendi üzerine katlanarak metefaz safhasındaki
kromozomlara dönüşmesi.
2
Her tür kendine özgü sayı ve morfolojiye sahip karakteristik kromozom yapısına
(karyotip) sahiptir.
Türler
Homo sapiens (İnsan)
Pan troglodytes (Şempanze)
Canis familiaris (Köpek)
Felis cattus (Kedi)
Equus caballus (At)
Equus asinus (Eşek)
Gallus domesticus (Horoz)
Rana pipiens (Kurbağa)
Cyprinus carpio (Balık)
Drosophila melanogaster (Meyve sineği)
Zea mays (Mısır)
Pisum sativum (Bezelye)
Pinus (Çam)
Danaus plexippus (Kelebek)
Cyathea dealbata (Eğrelti otu)
Ovis canadensis (Koyun)
Diploid Kromozom Sayısı
46
48
78
38
64
62
78
26
104
8
20
14
24
~380
~1200
54
Tablo 1: Farklı türlere ait diploid kromozom sayıları.
Kromozomların yapı ve kalıtımlarının çalışılması sitogenetik olarak adlandırılır.
Modern anlamda insan sitogenetiği, Tijo ve Levan tarafından kromozomları analiz edecek
etkin tekniklerin geliştirilmesi ve normal insan kromozom sayısının 46 olduğunun ortaya
koyduğu 1956 yılında başlar.
Sitogenetik uygulamalar günümüzde başta klinik tanı, gen haritalaması, kanser
sitogenetiği ve prenatal tanı gibi pek çok alanda sıklıkla kullanılmaktadır. Bir kromozom
raporunu yorumlamak, metodoliji ile ilgili bazı bilgilere sahip olmak, kromozom çalışmaları
ve onların sınırları hakkında görüşü olmak bugün bu konu ile ilgili araştırmacıların,
hekimlerin ve doğumsal anomalileri olan, mental retarde, cinsel gelişim bozuklukları ayrıca
çeşitli kanserli kişilerle çalışanlar için temel beceridir.
Kromozomlar özel bazı bölgelerden oluşmaktadır:
Kromatid- Kromatinlerin protein iskelete sarılması ile ortaya çıkan yapılara denir ve
kromozomun kolları gibi görülürler. Sentromerin her iki tarafındaki kromatidler kromozom
kolu olarak adlandırılırlar. Sentromerin ikiye ayırdığı kromatidler kromozomun kısa kolu (p
kolu) ve uzun kolu (q kolu) olarak adlandırılırlar. Kardeş kromatidler (sister chromatids)
birbiriyle tamamen aynı olan genetik bilgiyi taşırlar ( Mayoz I’in krossover’na kadar).
Sentromer- Sentromerler aslında spesifik proteinlerin bağlandığı DNA dizileridir. Bu
proteinler arasındaki kinetokor proteinleri, mayoz ve mitoz bölünmelerin anafaz safhaları
esnasında kromozomların iğ ipliklerine tutunarak hücrenin kutuplarına doğru hareket
etmelerini sağlarlar. Sentromer kromozomu p ve q olarak iki kola ayıran ve sitogenetik bir
belirleyici olarak görünen primer konstriksiyon (boğum) olarak tanımlanır.
3
Telomerler- Telomerler kromozomların uc kısımlarında bulunan özel DNA dizileridir.
Kromozom uçlarında hem kendi üzerine katlanmasını hem de diğer kromozomlara
yapışmasını engelleyerek kromozomun bütünlüğünde büyük rol oynarlar. Yaşlanma ile
birlikte telomerik DNA dizileri kısalmaya başlar. Kanser hücrelerinin telomerik dizilerinde
kısalma gözlenmez.
Replikasyon başlangıç noktası (Origins of Replication, ORI)- Işık mikroskobu ile
görülememesine rağmen, bütün kromozomlar en az bir tane DNA sentezinin başladığı
bölge içerirler. Ökaryotik kromozomlarda birden fazla ORI bölgesi bulunur.
Figür 2: Mitoz esnasındaki bir insan kromozomunun şematik görünümü.
Kromozomlar sentromerlerinin konumlarına göre sınıflandırılırlar
Bölünen insan hücrelerinin kondanse kromozomaları en kolay metafaz veya
prometafazda analiz edilir. Bu evrede kromozomlar sentromerlerinden birleşmiş kardeş
kromatidlerden oluşur ve mikroskop altında kromozom yaymalarında görünür
durumdadırlar. Kromozomların çoğu sadece boyları ile değil, aynı zamanda sentromerlerin
kromozm üzerindeki yerleşimi ile de birbirlerinden ayrılırlar. Bir kromozom, sentromerinin
pozisyonuna göre submetasentrik, metasentrik, akrosentrik ve telosentrik olarak ayırt
edilebilir. Sentromer submetasentrik bir kromozomu kısa kol (p) ve uzun kol (q) olarak
böler. Metasentrik kromozomlarda kısa ve uzun kollar yaklaşık aynı uzunluktadır.
Akrosentrik kromozomlarda, kısa kol çok küçüktür ve kısa kolun ucunda satellit olarak
isimlendirilen (satellit DNA ile karıştırılmamalı) yoğun bir yapı bulunur. Satellit büyüklüğü,
bir bireyin her akrosentrik kromozomu için farklıdır (kromozomal polimorfizm). Telosentrik
kromozomlarda kısa kol ve satellit bulunmaz. İnsan kromozomları arasında telosentrik
kromozom bulunmazken ev faresinin (Mus musculus)
tüm kromozomları telosentrik
kromozomlardır.
4
Figür 3: Senromerin yerleşim bölgesine bağlı farklı kromozom tipleri.
Karyotip analizi
Karyotip, bir organizmaya ait kromozomların yapısal ve sayısal özellikleri dikkate
alınarak homolog çiftler şeklinde düzenlenmesi demektir. Karyotip her tür için
karakteristiktir. Bununla beraber karyotip terimi, bir birey için veya bir tek hücre içinde
kullanılabilir.
Eşey hücreleri hariç organizmayı oluşturan tüm hücrelere somatik hücreler adı
verilir. İnsan (Homo sapiens) somatik hücrelerindeki 46 kromozom 23 çift halindedir. Bu 23
çiftin 22’si dişi ve erkeklerde benzer olup otozom olarak adlandırılır, otozom
kromozomlarına ek olarak dişilerde iki X veya erkeklerde bir X ve bir Y kromozomu
bulunmaktadır (46,XX dişi, 46,XY erkek).
İnsandaki sitogenetik isimlendirme sistemi 1978 yılındaki uluslar arası komitenin
kararı ile standart hale getirilmiştir (An international system for human cytogenetic
nomenclature (1978): ISCN). Buna göre insan karyotip formülünde (örn; 46,XX), virgülden
önce mevcut kromozomların total sayısı, virgülden sonra seks kromozomlarının
kompozisyonu verilir. İnsanlarda 22 çift otozom kromozom yedi gruba ayrılır (A-G).
İnsan kromozom gruplarının genel karakteristikleri
Grup A: Kromozom 1–3. Bunlar insan karyotipinin en büyük kromozomlarıdır.
Kromozom 1 en büyük ,3 ise grubun en küçüğüdür bu iki kromozom metasentriktir.
Kromozom 2 submetasentriktir.
Grup B: Kromozom 4–5. A grubundan sonraki sub metasentrik olan diğer iki büyük
kromozomdur. Bu gruptaki kromozomların boyutları birbirine çok yakın olmasına rağmen
kromozom 4 kromozom 5’de biraz büyüktür.
Grup C: Kromozom 6–12. Orta büyüklükteki submetasentrik kromozomlardır. Bu grup
kromozomları büyüklüklerine bakarak birbirinden ayırmak oldukça güçtür. X kromozomu
bu grup kromozomlardandır.
Grup D: Kromozom 13–15. Orta büyüklükteki akrosentrik kromozomlardır. Büyüklükleri
ve şekilleri birbirine çok yakındır ve gözle ayırt edilmeleri zordur. Bu grup kromozomlar
incelenirken satellit yapıları görülebilir.
Grup E: Kromozom 16–18. 16. kromozom, küçük metasentriğe yakın ve grubun en kolay
ayırtedilir kromozomdur. Kromozom 17 ve 18 submetasentrik kromozomlardır ve
birbirlerinden ayırt edilmeleri güçtür.
Grup F: Kromozom 19–20. En küçük metasentrik kromozomlardır. Normal boyama ile
mikroskop altında ayırt edilmesi imkânsızdır.
Grup G: Kromozom 21–22. En küçük akrosentrik kromozomlardır. Birbirinden ayırt
edilmeleri çok güçtür. Y kromozomu bu gruba dâhildir, 21. ve 22. kromozomdan boyanma
şeklinin farklı olması ile ayrılır.
5
Figür 4: Normal bir erkek cinsiyete(46,XY) ait kromozomların (a) ışık mikroskobu altındaki
genel görünümü ve (b) karyotipi.
6
İnsanda kromozom anomalileri
İnsandaki normal 46 kromozom sayısındaki herhangi bir değişiklik kendini fenotipik
olarak gösterecektir. 46 dışındaki herhangi bir kromozom sayısına heteroploid adı verilir.
Haploid kromozm sayısının (n) tam katları şekilindeki anomalilere öploid (euploid) ve diğer
kromozom sayı farkı anomalilerinede anöploid (aneuploid) adı verilir.
Euploidi
Diploid
Triploidi
Tetraploidi
Pentaploidi
46
69
92
115
2n
3n
4n
5n
Poliploidi
Aneuploidi
2n-1
2n-2
2n-3
Hipoploidi
2n+1
2n+2
2n+3
Hiperploidi
Poliploidiler (3n, 4n) zaman zaman fetüslerde görülmüştür, ancak triploid bebekler
canlı doğabilseler bile uzun yaşayamazlar. Triploidilerin en sık olarak bir yumurtanın iki
spermle birden döllenmesine bağlı olarak görülür. Ayrıca mayoz bölünmelerden birindeki
diploid yumurta veya spermle sonuçlanan hatalarda vakaların bir kısmından sorumlu
tutulabilir.
Aneuploidi insan kromozom bozuklukları arasında en sık görüleni ve klinik olarak en
önemli tipidir. Klinik olarak teşhis edilen tüm gebeliklerin en az %3-4’ünde bulunur.
Somatik kromozomların aneuploidisi seks kromozomlarına göre çok daha nadirdir. Seks
kromozomlarında meydana gelen aneupoidiler organizma için daha tolere edilebilir
bozukluklardır. Aneuploid hastaların tümünde ya trizomi ( belirli bir kromozomun iki yerine
üç adet bulunması) veya daha nadiren monozomi ( belirli bir kromozomun tek bir
temsilcisinin bulunması) vardır. Trizomi genomun her bir parçasında oluşabilir ancak bir
kromozomun tümünün trizomisi yaşamla nadiren bağdaşır. Canlı doğan bebeklerde en sık
görülen trizomi tipi, Down sendromlu hastaların %95’inde gözlenen 21. kromozomun
trizomisidir (47, XX veya XY,+21). Bir kromozomun tümünün monozomisi ise hemen
hemen daima ölümcüldür. Önemli bir istisna Turner sendromlu hastalarda görülür, bu
hastalarda X kromozomunun monozomisi görülür (45,XO).
Figür 5: Triploid karyotip örneği (69,XXX).
7
Figür 6: Turner sendromu karyotip örneği (45,X).
Figür 7: Klinefelter sendromu karyotip örneği (47,XXY).
Figür 8: Down sendromu karyotip örneği (47,XX,+21).
8
Figür 9: Trizomi 13 (Patau syndrome) karyotip örneği (47,XX,+13).
Figür 10: Trizomi 18 (Edwards syndrome) karyotip örneği (47, XY, +18)
Figür 11: Cri-du-chat sendromu karyotip örneği (46, XX, del(5p-))
9
Figür: Turner sendromu şüphesi olan kromozom örneği (46,X,i(Xq))
Figür: 22. kromozomun diğer 22. karomozoma translokasyonu (45,XX,t(22q;22q))
10
Figür: Kompleks translokasyon (46,XY;der(2)t(2;13)(pter;q13)t(2;18)(?;qter)
FISH (Fluorescent In-Situ Hybridization)
FISH moleküler ve sitogenetik yaklaşımların birleşimi olan moleküler sitogenetik bir analiz
yöntemidir. Bu yöntemde, klinik materyaldaki anormal bir kromozomun varlığını hızlıca
teşhis etmek veya kromozomların belirli yeniden düzenlenmelerini saptamak amacıyla
kromozomlar için, kromozom bölgeleri için veya genler için spesifik DNA probları kullanılır.
Gen veya lokusa özgü problar belirli bir genin varlığını, yokluğunu veya lokalizasyonunu
saptamak için hem metafaz kromozomlarında, hem de interfaz hücrelerinde kulanılabilir.
Figür 13: FISH mikroskop ve karyotip görüntüsü.
11
CGH (Comparative genomic hybridization)
CGH moleküler sitogenetik bir metoddur, bu yöntemle kromozomal dengesizlikler tespit
edilebilir. CGH’de iki genomik DNA örneği normal bir kişiye ait metefaz kromozomlarına in
situ olarak hibridlenir. Farklı florokrom boyalarla boyanarak (DAPI, FITC ve TRITC),
referans kromozom üzerindeki iki florosens sinyal arasındaki yoğunluk ölçülür. Bu orana
göre; kullanılan DNA örnekleri arasındaki kopya sayısı oranı elde edilir. Bu analizlerin
yapılabilmesi için quantitatif dijital floresans görüntü analizi gereklidir.
Karyotip analizinin yapılması
Pek çok insan dokusu kromozom elde etmek ve sitogenetik analiz için kullanılabilir.
Dokunun seçimi hasta tipine (prenatal veya postnatal), tanının amacına (doğumsal veya
sonradan kazanılmış) ve hastalığın klinik özelliklerine bağlı olarak değişebilir. Prenatal
tanılar için özellikle amniyotik hücreler, koryon villi hücreleri veya fetal kan lenfositleri
öncelik sırası ile tercih edilir. Bunlara ilaveten, test yapılacak dokunun ve yöntemin seçimi
hamilelik süresine, sitogenetik veya biyokimyasal/genetik testlerden hangisinin öncelikle
yapılacağına bağlı olarak test materyali değişebilir. İlaç kullanarak hamileliğin
sonlandırılması veya abortuslarda eğer gerekli ise fetüse ait plasenta, deri akciğer ve
böbreklerden elde edilen dokular test için kullanılabilir. Yeni doğan ve erişkinlerdeki
doğumsal rahatsızlıklar için öncelikle tercih edilen test materyali periferik kandır. Bununla
birlikte daha az sıklıkla olmak kaydıyla kemik iliği, deri ve diğer uygun dokular klinik
belirtilere ve sitogenetik teşhisin amacına göre kullanılabilir. Sıklıkla neoplazmalarla ilişkili
olan sonradan kazanılmış kromozom abnormalitelerinde malignansinin olduğu dokular
sitogenetik test için kullanılır (kemik iliği, pleural sıvı, spinal sıvı, lenf nodu ve diğer solid
tümörler gibi).
Rutin laboratuvarlarda genel olarak karyotip analizinin (kromozom analizi)
yapılması; lenfosit kültürünün hazırlanması, hastadan alınan kanın kültüre ekilmesi,
harvest ve tripsin ile bantlama aşamalarından oluşur. Özellikle kültürün hazırlanma ve
kanın ekim aşamaları steril bir şekilde yapılmalı herhangi bir kontaminasyona karşı dikkatli
olunmalıdır.
Laboratuvarda sitogenetik olarak kullanılacak kan muhakkak heparinli enjektör veya
tüpe alınmalıdır ve kan dikkatlice karıştırılarak kanın pıhtılaşması önlenmelidir.
Alınan kan iki şekilde kültür edilebilir. İlk kültür yönteminde, alınan kan bekletilerek
sedimentasyona terk edilir ve elde edilen lökositçe zengin sıvı, standart teknik ya da makro
kültür tekniği denen periferik kan kültürü ortamına konur. Bu yöntemde alınan periferik kan
miktarı nispeten fazladır (10 ml kadar). İkinci kültür yöntemi olan mikrokültür veya tüm kan
kültürü adı verilen yöntemde ihtiyaç duyulan kan miktarı daha azdır. Mikro kültürde kanın
uzun süre bekletilmesi, santrifüj edilmesi, elle oynanması gibi sakıncalı olabilecek
durumları ortadan kaldırdığından, makro kültür yöntemine göre daha elverişlidir.
Fetus
Yenidoğan
Kord kanı
Çocuk (< 5 yaş)
Çocuk (> 5 yaş) ve erişkin
0.2 ml
0.1 ml
0.3 ml
0.5 ml
0.8 ml
Tablo 2: Genel olarak 10 ml’lik tüm kan kültürü için gerekli olan kan miktarları.
12
Mikro kültür için gerekli solüsyonlar
1. Besiyeri (Growth medium)




RPMI 1640- Temel besiyeridir. Ticari olarak satılan tüm besiyeriler (MEM, McCoy’s
5A, Ham’s F10 vb.) bu amaç için kullanılabilir. Bunlardan herhangi birisinin seçimi
kişisel deneyime kalmıştır. 100 ml.
Fetal calf serum (Fetal bovine serum)- Kültür ortamını zenginleştirmek ve
hücrelerin çoğalma oranını artırmak amacıyla kullanılır. 20 ml.
Penisilin ve streptomisin- İşlemler esnasında herhangi bir mikrobik
kontaminasyonu önlemek amacıyla kullanılır. 1.3 ml.
L-glutamin- L-glutamin stabil olmadığı için kültür kullanılmadan hemen önce
katılmalıdır. 1.3 ml.
2. Phytohemagglutinin- Periferik kandaki lenfositler interfazın G0 veya G1
dönemindedirler ve normal olarak periferik kanda mitoza girmezler. Lenfositleri kültürde
bölünmeye teşvik etmek için mitoz uyarıcısı (mitotic stimulant) kimyasallar kullanılır. En
çok tercih edilenleri EBV (Ebstein-Barr virus) ve Phaseolus vulgaris’den elde edilen
Phytohemagglutinin’dir.
Phytohemagglutinin iki formda bulunur M ve P. Kültürde
kullanılanı M formudur. 1.5 ml.
Mikro kültür yukarıda miktarları verilen solüsyon ve kimyasalların steril kabinde
karıştırılmaları ile hazırlanır. Kültürün pH’sı 7.2-7.4 arası olmalıdır. Bunu ayarlamak için
sodyum bikarbonat (NaHCO3) veya Hepes buffer kullanılır. Yine steril kabin içersinde
hazırlanan mikro kültür 10 ml olarak kültür flasklarına veya 15 ml’lik falkon tüplere bölünür.
Her bir hasta için bu 10 ml’lik bölünmüş mikro kültür kan ekimi için kullanılır. Bu aşamada
kullanılan tüm flask ve tüpler kesinlikle steril olmalıdır.
Hastadan alınan kan kültür flaskları içersine Tablo 2’de belirtildiği miktarlarda
eklenir. Daha sonra kan ekilmiş kültürler, memeli hücreleri için optimum üreme ısısı olan
37oC’lik etüv içersinde 72 saatlik inkübasyona alınırlar. 72 saatin sonunda harvest işlemine
geçilir.
Harvest için gerekli solüsyonlar
1. Kolşisin (Colchicine) solüsyonu- Mitoz bölünmenin metafaz aşamasına gelmiş olan
hücrelerin bir sonraki evreye, yani anafaza geçmelerini engellemek için 72 saatini
dolduracak olan kültürlerin son 20. dakikasında eklenir. Bu madde etkisini kromozomları
hücre kutupkarına çekmekle görevli mitotik iğ iplikçiklerini parçalayarak gösterir. 20 μl.
2. Hipotonik solüsyon- Kültürdeki hücrelerin şişerek parçalanmalarını ve kromozomların
birbirlerinden iyice ayrılmalarını sağlar. En çok kullanılan hipotonik solüsyon 0.075 M’lık
KCl solüsyonudur.
3. Fiksatif- En sık kullanılan fiksatif metanol-asetikasit fiksatifidir (3/1 oranında). Fiksatif
her kullanım öncesi yeni olarak hazırlanır. Fiksatif hipotonik solüsyon muamelesi sonucu
açılmış olan metafaz plaklarının tespit edilmesini sağlar.
72 saatin sonunda (kolşisin eklenmiş olan) kültürler etüvden alınarak, dikkatlice
konik dipli santrifüj tüplerine aktarılır ve 1000 rpm’de 10 dk santrifüj edilir. Üstteki
süpernatant atıldıktan sonra tüpün dibindeki pellet üzerine 8ml hipotonik solüsyon eklenir
ve 5 dk 37oC’lik etüv içersinde bekletilir. Bekleme sonunda tüpler dikkatlice santrifüj
edilerek üstte kalan süpernatant atılır, kalan pellet üzerine fiksatif damla damla eklenmek
suretiyle 5 ml’ye kadar tamamlanır. Bu işlem esnasında fiksatif pellet ile iyice karışmalı
hatta düşük rpm’li bir vorteks mikser kullanılmalıdır. Bu ilk fiksatif muamelesinin ardından
15 dk oda ısısında bekletildikten sonra tüpler tekrar santrifüj edilir ve üstteki süpernatant
13
atılarak fiksatif işlemi en az iki defa daha tekrarlanır. Son fiksatiften sonra dipteki pelletin
yoğunluğuna dikkat edilerek 1 ml’ye kadar daha fiksatif eklenir, bu aşamada fiksatif
içersindeki hücreler artık lamlara yayılarak preparat haline gelecek son şekillerindedir.
Preparatların hazırlanması
Kromozom analizinin en önemli ve kritik aşamasındır. Bu aşamada yapılan yayma
kromozomların lam üzerinde düzgün açılmalarını ve kromozom kalitesini belirleyecektir.
Lamların önceden iyice temizlenmesi iyi ve temiz preparatlar için önemlidir. Bu aşamada
havanın bağıl nem oranı preparatın niteliğini etkilemektedir ve en iyi sonuçlar % 50-60’lık
bağıl nemde alınmaktadır. Bir diğer etkende ortam ısısıdır, ısının optimum olduğu değer
23–25 oC’dir. Nem ve ısı laboratuardan laboratuara değişebilmektedir. En uygun şartlar
zaman içersinde optimize edilebilir.
Preparatların tripsin ile bantlanarak boyanması
Bantlama yapılmadan önce yeni yayılmış olan preparatların 3 gün oda ısısında veya
bir gün 60 oC’lık etüvde bekletilerek yaşlanmaları sağlanmalıdır, bu süreç iyi bantlama için
gereklidir. Preparatların bantlanması özellikle grup içi kromozomların birbirinden ayrılması
ve yapısal kromozomal bozuklukların görülebilmesi için önemlidir. 32 oC’lik su banyosu
içersinde aktifleştirilen tripsin (bir tür proteaz) buffer içersine preparatlar 4sn-3dk kadar
olan zaman aralığında daldırılarak tripsinin etki etmesi sağlanır. En uygun tripsin süresi
deneme yoluyla bulunur. Tripsinden sonra preparatlar giemsa boyası içersinde 2 dk
boyanır. Boyama işleminden sonra preparatlar ışık mikroskobu altında incelemeye
hazırdır.
14
Figür 14: Kromozom analizinin aşamaları.
15
Figür 15: DNA’nın paketlenmesi.
16