PowerPoint Sunusu - mikrobiyoloji.org

Gıda Mikrobiyolojisi Eğitimi
04 Kasım 2014, Kuşadası
Prof. Dr. Kadir HALKMAN
Ankara Üniversitesi
Gıda Mühendisliği Bölümü
05; Beklenmedik Sonuçlar
01a. Genel Yaklaşım
• Mikrobiyolojik analizler, fiziksel ve kimyasal
analizlerden farklıdır. Fiziksel ve kimyasal analizlerde
aynı örnekte aynı operatör tarafından aynı zamanda
yapılan analizlerde farklı sonuçlar alınırsa bu
rahatsızlık vericidir.
• Mikrobiyolojik analizlerde ise aynı örnekte aynı
operatör tarafından aynı zamanda yapılan analizlerde
yakın sonuçlar alınırsa bu rahatsızlık vericidir.
• Analizde tekrar edilebilirlik (aynı örnekte aynı operatör
tarafından aynı zamanda yapılan analizde), farklı
disiplinlerde farklı değerlendirilir. Bunlar, uluslararası
kabul görmüş standartlarda, kodekslerde, komitelerde
böyle kabul edilmiştir.
01b. Genel Yaklaşım
• Aynı seyreltiden 2 Petri kutusuna ekim yapıldığında
%10 fark mükemmel bir ekim sonucudur. 2 Petri
kutusu arasındaki sayım sonucu farkı %20’ye kadar
kabul edilebilir.
• Aynı kuru gıdadan farklı zamanlarda yapılan
mikrobiyolojik analizlerde Petri kutusundaki koloni
sayım sonuçlarının logaritmaları alınır, ortalamanın
standart sapması 0,10-0,15 arasında olmalıdır. Daha
yüksek sapmalarda düzeltici uygulama yapılır. Daha
düşük sapmalarda ise operatör izlemeye alınır.
• Fiziksel ve kimyasal analizlerde bu değerler ve
yaklaşımlar çok farklıdır.
02a. ISO 19036
Gıda ve yem; Mikrobiyolojik analizler için ölçüm belirsizliği
• Belirsizlik Kaynakları: Örnekleme, Gıda, Kalıcı hata,
Analizi yapan, Sapanlar, Ekipmanlar
• Her bir matris için ayrı ayrı belirsizliğin hesaplanması
gerekir. Matris Grupları: Sıvı ve toz halindeki gıdalar, İyi
karıştırılmış katı gıdalar, Doğranmış katı gıdalar, Diğer
katı gıdalar
• Analizi Yapan Bireylerden Gelen Belirsizlik Bileşenleri:
Alt örnekleme, Dilüsyon, Muamele süresi, Petri
kutularına ekim, Petri kutularının değerlendirilmesi,
Biyokimyasal doğrulama, Sonuçların yorumlanması,
Sonuçların hesaplanması.
02b. ISO 19036
Gıda ve yem; Mikrobiyolojik analizler için ölçüm belirsizliği
• Ekipmandan Gelen Belirsizlik Bileşenleri: Teraziler,
Termometreler, Seyrelticiler, Karıştırıcılar, Termostatlar,
Hacim ölçen ekipmanlar, Otoklavlar
• Diğer Belirsizlik Bileşenleri: Besiyeri kalitesi, Cam
aparatların temizliği, Su kalitesi, Kullanımdan evvel ve
kullanım esnasında besiyerinin saklanması.
02c. ISO 19036
Gıda ve yem; Mikrobiyolojik analizler için ölçüm belirsizliği
• Tekrarlanabilirlik: Aynı koşullar altında yapılan analizler
arasındaki farklılığın ölçümü; Aynı metot, Aynı örnek,
Aynı kişi, Aynı ekipman, Aynı koşullar, Aynı zaman
• İzleme: Ekipman, Metodoloji, Personel
• Belirsizliği Azaltmak İçin Yapılması Gerekenler:
Operatörlerin eğitimi, Performanslarının test edilmesi,
Ekipmanın test edilmesi, Uygun yöntemlerin seçimi.
03a. Toplam Bakteri
• Toplam bakteri; bir kalite kavramıdır, bir simgedir.
Analiz edilen gıdadaki bütün canlı bakteriler değildir.
Gıdada mevcut tüm canlı bakterileri sayabilecek bir
yöntem bugün için yoktur.
• Basit olarak, PCA besiyerinde 28 oC’da 48 saat aerobik
inkübasyon sonunda oluşan koloniler sayılır. Bazı maya
hücreleri de bu koşullarda koloni oluşturabilir ama
bunlar da “toplam bakteri” içinde değerlendirilir.
• Küfler bu süre içinde gelişerek koloni oluşturamazlar.
• Toplam bakteri yerine “Aerobik Mezofil Koloni Sayısı”
daha anlamlı bir ifadedir.
03b. Toplam Bakteri
• Bir gıda analizinde “Toplam Laktobasil” sayısı >
“Toplam bakteri” sayısı olabilir mi?
• Evet, peynir analizinde sıklıkla bu sonuç alınır. Peynir
üretiminde kullanılan laktobasiller PCA’da gelişemez
ama MRS Agar’da gelişir.
• Ama turşu analizinde bu sonuç alınırsa sorgulamakta
yarar var. Turşu üretiminde etken laktobasiller PCA’da
kolaylıkla gelişir ama gelişmeyenleri de olabilir. Sadece
sorgulamakta yarar var.
• Bir gıda analizinde “Toplam koliform bakteri” sayısı >
“Toplam bakteri” sayısı olabilir mi?
• Kesinlikle hayır. Koliform grup bakteriler PCA’da
kolaylıkla koloni oluştururlar.
04a. Koliformlar
• Bir gıda analizinde “E. coli” sayısı > “Toplam koliform
bakteri” sayısı olabilir mi?
• Evet, operatör mikrobiyolojik analizlerde temel bazı
ilkeleri bilmiyorsa, laboratuvarda bu sonuç alınabilir.
• Basit olarak, koliform bakteri ve E. coli, 2 farklı
yöntemle sayıldı ise bu sonuç doğru şekilde alınabilir.
• Oysa asıl olarak tek yöntem kullanılıp, önce koliform
bakteriler sayılmalı, devamında bunlardan hangilerinin
E. coli olduğu belirlenmelidir.
04b. Koliformlar
• Tipik bir örnek/ sorgulama CCA (Merck); Çok
abartılı bir örnek.
• Gıdada 104 kob/mL E. coli ve 107 kob/mL E. coli
olmayan toplam koliform (Citrobacter freundii vd.)
olduğunu varsayalım. CCA besiyeri kullanılıyor.
• Size kolay gelsin, iyi şanslar.
• Hiçbir koşulda E. coli belirleyemezsiniz/
sayamazsınız. Sadece 10–4 seyreltide toplam
koliform sayısını belirleyebilirsiniz. E. coli sayım
sonucunu <105 kob/mL olarak vermenizin kabul
edilebilir bir geçerli ifadesi yoktur.
04c. Koliformlar
• Detaylandıralım:
• Gıdada 104 kob/mL E. coli ve 107 kob/mL E. coli dışı
toplam koliform olduğuna göre koliformların sayımı için
10–4 seyreltiden CCA besiyerine ekim yapıldığında basit
olarak 100 adet pembe-kırmızı (E. coli dışı koliformlar)
kolonisi olacaktır.
• Basit matematiksel yaklaşım ile bu Petri kutusunda 1
adet koyu mavi-menekşe renkli E. coli kolonisi bulunma
olasılığı sadece %10’dur.
• Kuşkusuz, biyolojik bilimlerde bu kadar basit bir
matematik yoktur ama ana hatları ile budur. Analiz
edilen gıdada 104 kob/mL E. coli vardır ama aynı
besiyerinde gelişebilen E. coli dışındaki koliformlar,
hedef bakteriyi maskeleyecektir.
04d. Koliformlar
•
04e. Koliformlar
• Sonuçta, gıdada E. coli olmakla birlikte, analiz sonucu
%90 olasılıkla <105 kob/mL (doğru ama anlamsız
sonuç bildirimi), %10 olasılıkla ise 106 kob/mL (yanlış
sonuç bildirimi) olarak verilecektir.
• Ne yapmamız gerekli idi?
• Örneğin inkübasyonu 44 oC’da yapabilirdik.
• Ama E. coli olmayan koliformların tamamı fekal
Enterobacter aerogenes ise ne olacak? Fekal
koliformlar bu sıcaklıkta gelişir.
• Zaten E. coli analizini fekal kontaminasyon kontrolü
için yapıyoruz, sorun yok.
05. Benzer Örnekler
• Yukarıda verilen çok abartılı bir örnek gibi gelebilir.
Hele gıdada 104 E. coli, 107 E. coli olmayan fekal
koliform iyisinden abartıdır.
• Olmayacağına garanti verebilir misiniz? Sakın ola ki
bu garantiyi vermeyin. Avrupa’da ve özellikle
Almanya’daki son E. coli O104:H4 salgınını hiç
unutmayın. 3800’den fazla sebebi kanıtlanmış
hastalanma, 823 HUS ve 44 ölüm.
• Akademisyenler, gıda sanayisi çalışanları, araştırma
kuruluşları çalışanları bu gibi örneklerde çok ciddi
şekilde atlıyor, çok ciddi sorunlar ile karşılaşıyor.
• Örnek abartılı olsa bile benzeri örnekler çok fazla.
06a. EMS; Genel
• Tablo okuma önemlidir.
• Daha da önemli olan analiz yöntemi / tablo okumaktır.
3 tüplü ekim yöntemi sonucunu 5 tüplü ekim
tablosundan OKUMAMALISINIZ.
• EMS, sadece gerektiğinde kullanılacak analiz
yöntemidir.
• EMS Protokolü ciddi anlamda kavranılması gereken
bir konudur. En azından kategori kavramı tam olarak
kavranılmalıdır.
06b. EMS; Kategori
1
ml
0,1 0,01 EMS
ml ml
K
Alt
%95
Üst
%95
Alt
%99
Üst
%99
1
0,00
0,94
0,00
1,40
0,02
1,70
0,01
2,50
0
0
0
1
0
0
<0,3
0,36
1
1
1
1,10
3
0,40
3,50
0,20
4,60
2
1
1
2,00
2
0,50
4,00
0,20
5,60
3
2
1
15,00
1
3,00
38,00
2,00
52,00
07. “Yok” Ne demek?
• Gıda mikrobiyolojisi laboratuvarı açısından aranan
patojen gerçekten yoktur.
• Patojen gerçekte vardır ama sayısı, belirlenebilecek
standart olasılık altındadır, belirlenememe olasılığı
yüksektir (1 adet Salmonella/ 1 kg-L gıda; belirleme
şansı basit matematiksel yaklaşım ile sadece %4).
• Patojen gerçekte, belirlenebilecek sayıdadır,
laboratuvar hata yapar.
• En tipik örnek Salmonella analizidir. Hataya çok
açıktır. Laktoz Broth (FDA) kullanılmamalıdır.
08. Pseudomonas aeruginosa
• Açık bir özür: Cetrimide Agar hiç de öyle çok özel bir
örnek değilmiş. Selektif besiyeri konusunda hep
Cetrimide Agar’ı sadece Pseudomonas aeruginosa için
tam selektif besiyeri olarak örnek verirdik.
• P. fluorescens ve diğer Pseudomonas türleri ile yakın
akraba türler, bu besiyerinde çok kolay gelişebiliyor. P.
fluorescens bu besiyerinde ve diğer selektif
Pseudomonas besiyerlerinde P. aeruginosa‘ya çok yakın
morfolojik karakterli koloni oluşturur.
• Bu 2 bakterinin ayrılması için 42 oC’da inkübasyon
gereklidir. P. aeruginosa bu sıcaklıkta gelişebilir, P.
fluorescens gelişemez.
• İnkübasyon sıcaklığı kritiktir. P. fluorescens 25 adlı
bakteri her koşulda gelişiyor, moleküler yöntemlerle
ayılabilir.
09. Bacillus cereus
• Bu analizde pastörizasyon gerçekten gerekli mi?
• Pastörizasyon uygulanırsa o anda spor
oluşumunu tümüyle tamamlamış olanlar
sayılabilir. Vejetatif formdaki tüm B. cereus
hücreleri ölür.
• Basiller, sadece hayati bir tehlike olduğunda spor
oluştururlar. Normal koşullarda vejetatif formda
kalıp, çoğalma eğilimi gösterirler.
10a. Selektif Besiyerleri
• Selektivite arttıkça, hedef bakterinin gelişmesi zorlanır.
Sahte negatif sonuç alınma şansı artar.
• Selektivite azaldıkça, refakatçi floranın gelişmesi artar.
Hedef bakterinin gelişmesi kolaydır ama refakatçi flora
maskelemesi ile sonuç alınamayabilir.
• Numunede hasar görmüş olduğundan endişe edilen
mikroorganizma varsa, olabildiğince zayıf selektivitede
olan besiyerleri tercih edilmelidir.
• MRS, selektif besiyeri değildir. Sadece, laktobasillerin
gelişmesini destekleyen bileşenler içerir.
10b. Selektif Besiyerleri
• Problem çözüm örneği 01: Numunede E. coli aranacak.
Hasar görmüş olmasından şüphe ediliyor. Refakatçi
flora olarak yoğun koliform grup bakteri bekleniyor.
• E. coli zarar gördü ise, diğer koliformların da zarar
görmüş olması beklenir, zayıf selektivitede bir besiyeri
seçilir.
• Genel bir besiyerine (CASO Agar) yayma yöntemi ile
ekim yapılır. 37 oC’da 4 saat inkübe edilir (canlandırma).
Sonra üzerine dikkatlice ~40 oC’da tutulan selektif bir
besiyeri dökülür, 44 oC’da 20 saat inkübe edilir.
10c. Selektif Besiyerleri
• Problem çözüm örneği 02: Su numunesinde Membran
Filtrasyon yöntemi ile Salmonella aranacak. Hasar
görmüş olmasından şüphe ediliyor. Refakatçi flora
olarak yoğun E. coli olması bekleniyor. E. coli, çevresel
etkenlere karşı daha dayanıklıdır. Yukarıdaki örneğe
uygun olarak filtrenin CASO Agarda 37 oC’da 4 saat
inkübasyonu ve ardından üzerine selektif bir
Salmonella katı besiyeri dökülüp inkübasyona 42 oC’da
devam edilmesi olur mu?
• Salmonella izole ederseniz sorun yok. Salmonella izole
edemezseniz raporunuzda [yok] mu yazacaksınız? Yok
ne demek?