5, Sayı: 44, Nisan 2017, s. 538-551 Yayın Geliş Tarihi / Article Arrival

_____________________________________________________________________________________
Akademik Sosyal Araştırmalar Dergisi, Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s. 538-551
Yayın Geliş Tarihi / Article Arrival Date
25.11.2016
Yayınlanma Tarihi / The Publication Date
12.04.2017
Evrim TEKELİ
Ankara Üniversitesi, Sosyal Bilimler Enstitüsü, Paleoantropoloji Anabilim Dalı
Doktora Öğrencisi
tevrim@gmail.com
Prof.Dr. Timur GÜLTEKİN
Ankara Üniversitesi, Dil ve Tarih- Coğrafya Fakültesi, Antropoloji Bölümü, Fiziki Antropoloji
Anabilim Dalı
tgultekin@ankara.edu.tr
GİRESUN/KHALKERİTİS ADASI BİZANS DÖNEMİ
BİREYLERİNDE MORFOLOJİK VE GENETİK ÇALIŞMALAR İLE
CİNSİYETİN BELİRLENMESİ1
Öz
Antropoloji, insanı ve günümüz toplumları ile geçmiş toplumların biyolojik ve sosyo-kültürel benzerliklerini ve farklılıklarını inceler. İnsanı biyolojik olarak inceleyen bu bilim dalı ile arkeolojik ve antropolojik kazılardan çıkartılan biyoarkeolojik
materyallerin genetik çalışmalarda kullanılması ile antik DNA (aDNA) çalışmaları
başlamıştır. Özelliklede antropoloji alanı içerisinde aDNA çalışmalarının yer alması ile insan tarihine ait merak edilen sorular cevaplanmaya başlanmıştır. Genetik
alanında teknolojinin gelişmesiyle birlikte moeküler biyoloji gibi fen bilimleri ile
antropoloji gibi sosyal bilimler arasında multidisipliner çalışmalar ortaya çıkmıştır.
Bu çalışmalar içerisinde kimliklendirmenin temelini oluşturan cinsiyet belirleme,
antropoloji için oldukça önemlidir. Bu çalışmada Giresun Adası/Khalkeritis Kazısı
nekropol alanından çıkartılmış olan ve Bizans Dönemi olarak tarihlendirilmiş olan
insan iskeletlerinden 10 birey üzerinde morfolojik incelemeler ve genetik analizler
yapılarak bireylerin cinsiyeti araştırılmıştır. Morfolojik incelemeler sonucunda 5
birey erkek 5 birey dişi olarak belirlenmiştir. Genetik analizler sonucunda ise 4 biBu makale, Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından desteklenen ve yürütücülüğünü Prof.Dr.
Timur Gültekin’in yaptığı, 15L0649002 kodlu “Arkeolojik Kazılardan Çıkarılan Kemiklerden Antik DNA Çalışması”
başlıklı projeden üretilmiştir. Çalışmada kullanılan materyaller, Evrim Tekeli’nin doktora tezinde kullanılmıştır.
1
Giresun/Khalkeritis Adası Bizans Dönemi Bireylerinde Morfolojik Ve Genetik Çalışmalar İle
Cinsiyetin Belirlenmesi
reyde amplifikasyon oluşmadığı için cinsiyet belirlenememiştir. DNA analizleri ile
morfolojik incelemeler karşılaştırıldığında ise %50 oranında bir uyum olduğu bulunmuştur.
Anahtar kelimeler: antik DNA, antropoloji, Bizans Dönemi, cinsiyet
belirleme, Giresun Adası
THE DETERMINATION OF SEX WITH THE MORPHOLOGICAL AND
GENETIC STUDIES ON INDIVIDUALS OF GIRESUN/KHALKERITIS
ISLAND DURING THE BYZANTINE PERIOD
Abstract
Anthropology examines the biological and socio-cultural similarities and differences of mankind and today's and past's societies. The ancient DNA (aDNA) studies
started with the use of bio-archeological materials being taken out in the archeological and anthropological excavations in the genetic studies with this science which
examines people biologically. Especially, the questions which are wondered on the
people history started to be answered as aDNA studies took the place in the field of
anthropology. The multi-disciplinary studies have occurred between the sciences such as biyolog and social sciences such as anthropology with the development of technology in the field of genetic. The determination of sex which is
the base for the identification in these studies is very important for anthropology.
The gender of persons were searched as the examinations and genetic analyses were done on 10 persons from the people's skeletons which were taken out of the Giresun Island/ Khalkeritis Excavation necropolis area and which were dated as Byzantine Period in this study. As a result of morphological examinations, 5 individuals were determined as male and 5 of them were determined as female. As a result of genetic analyses, the sex couldn't be determined as the amplification didn't
occur in 4 individuals. When DNA analyses and morphological examinations were
compared, it was found that there was a conformity at 50%.
Keywords: ancient DNA, anthropology, Byzantine Period, sex determination,
Giresun Island
1.GİRİŞ
Türkiye’de yapılan arkeolojik ve antropolojik kazılardan çıkartılan insan ve hayvana ait iskeletler ile bitki kalıntılarının materyal olarak kullanılması ile fen bilimleri ve sosyal bilimler arasında koordinasyonlu bir çalışma yapılmaya başlanmıştır. Yapılan bu çalışmalarda arkeologlar için
kazılardan çıkarılan materyaller geçmişin aydınlatılması için önemli olurken, antropologlar için
de kazıdan çıkarılan iskelet örnekleri üzerinde yapılan morfolojik çalışmalar merak edilen birçok soruyu cevaplamaktadır. Kazılardan çıkartılan iskeletler üzerinde antropologlar morfolojik
inceleme yaparak bireyin cinsiyetini, yaşını, tahmini boy uzunluğu belirlenebildikleri gibi (Ubelekar, 2008), iskelet ve diş üzerinde bırakılan işaretlerden yola çıkılarak tarih öncesi hastalıklar
hakkında da bilgi elde edebilmektedirler (Ortner ve Putschar, 1981). Bunun dışında kemik örneklerinden kimyasal analizler yapılarak geçmişte yaşamış insanların beslenme şeklilleri belirlenebilmektedir (Kaestleve Horsburg, 2002).
The Journal of Academic Social Science Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s. 538-551
539
Giresun/Khalkeritis Adası Bizans Dönemi Bireylerinde Morfolojik Ve Genetik Çalışmalar İle
Cinsiyetin Belirlenmesi
Antropoloji alanında özelliklede kimliklendirmeye dayalı çalışmalarda cinsiyetin belirlenmesi
çok önemli bir kriterdir. Tarih öncesi dönemde yaşamış toplumların demografik yapısının belirlenmesi için öncelikle cinsiyet tespitinin yapılması gereklidir.
Kazıdan çıkarılan iskeletler üzerinde antropologlar tarafından yapılan morfolojik incelemeler ile
yaş ve cinsiyet belirlenmektedir (Çırak,2009). İskeletler üzerinde morfolojik incelemelerde kafatası ve pelvis ile birlikte cinsiyet farklılığı gösteren diğer kemiklerde kullanılarak cinsiyet
belirlenebilmektedir (Ubelekar,2008). Ancak bazı durumlarda özelliklede cinsiyetin belirlenmesi zor olmaktadır. Kazıdan çıkartılan iskeletin parçalanmış olması durumunda veya seksüel farklılıkların tam olarak belirmediği yaşlardaki bireylere ait iskeletlerde morfolojik ve metrik yöntemler ile cinsiyetin belirlenmesi mümkün olmamaktadır (Malaver ve Yunis, 2003).
Özelliklede toplu gömülerde birden fazla birey aynı mezar içerisinde yan yana gömüldüğü için
cinsiyet belirlemede sorunlar yaşanmaktadır. Bunun dışında bebek ve çocuklarda cinsiyetin
belirlenmesi zor olduğu için kesin bir tespit yapılamamaktadır (Stone, 1996). Morfolojik incelemeler ile cinsiyet tespiti yapılamayan antropolojik örneklerde DNA analizlerinin yapılması
önemli olmaktadır (O’Rourke ve ark., 2000; Pääbo ve ark., 2004).
Arkeolojik ve antropolojik materyallerin biyoloji alanında yapılan çalışmalar içine dahil edilmesiyle birlikte antik DNA (aDNA) çalışmaları ortaya çıkmıştır. Geçmişleri hakkında bilgi
sahibi olmak isteyen tarihçiler, arkeologlar, paleontologlar, antropologlar, biyologlar, dil bilimcileri aDNA çalışmaları ile tarih öncesi döneme ait bilgilere ulaşmaları mümkün hale gelmiştir.
1984 yılında California Üniversitesi’nden Higuchi ve arkadaşları, Güney Afrika’da yaşamış ve soyu tükenmiş olan bir zebraya ait (Equus quagga quagga) deri kalıntılarından
DNA elde ederek, dizileme yapmış ve modern zebra ile filogenetik yakınlığını belirlemişlerdir. Bu çalışma literatürde geçen ilk antik DNA çalışmasıdır (Higuchi ve ark.,
1984).Bu çalışmadan sonra, Pääbo ve arkadaşları tarafından 1985 yılında yaklaşık 2340 yıllık
bir çocuğa ait mumyadan DNA elde edilmiştir (Pääbo ve ark., 1985).Moleküler biyoloji ve genetik alanında teknolojinin ilerlemesi ile birlikte 1985 yılında Polimeraz Zincir Reaksiyonu’nun
(PZR) keşfedilmesi ile (Mullis ve ark., 1986) birlikte antik DNA alanında yapılan araştırmaların
kapsamı artmıştır ve çalışmalar daha hızlı bir şekilde yapılmaya başlanmıştır.
Antik DNA çalışmalarında materyal olarak saç, mumyalanmış deri kalıntısı, yumuşak doku,
bitki kalıntıları,hayvan ve insana ait kemik ile dişler kullanılmaktadır (Pääbo ve ark., 2004;
Singh ve Garg, 2014). Bu alanda yapılan çalışmalarda en çok kemik ve diş kullanılmaktadır.
Kazıdan çıkarılan iskelet buluntularından DNA analizi yapılacak ise örnek seçiminin iyi yapılması önemlidir. Kemik çalışılacak ise femur, tibia, humerus ve kafatası kemiği gibi kalın ve sert
olan kortikal kemiklerin seçilmesi çalışmanın başarısını artırmaktadır (O’Rourke ve
ark.;Daskalaki, 2004). Dişin mine tabakası, insan vücudundaki en sert dokudur ve doku; sıcaklık, UV, ışık, nem ve mikrop gibi çevresel şartlara karşı fiziksel bariyer oluşturarak diş hücrelerini korumaktadır. Ayrıca dişn mine tabakası kontaminatların içeri girmesine engel olduğu için,
kontaminasyon riski daha az olmaktadır (Higgins ve Austin, 2013).Antik DNA çalışmalarında
materyal olarak diş çalışılacak ise; morfolojik olarak iyi korunmuş, patolojik bulgusu olmayan,
aşırı derecede aşınmış ve çürük olmayan dişler tercih edilmelidir (Kemp ve Smith, 2005).
Modern DNA çalışmaları ile aynı prosedüre sahip olmasına rağmen aDNA çalışmaları daha
dikkatli ve sabırlı bir şekilde yapılması gerekmektedir. Antik DNA çalışmalarında kontaminasyon ve degredasyon çok önemli bir problemdir (Daskalaki, 2004; Yang ve Watt, 2005). Konta-
The Journal of Academic Social Science Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s. 538-551
540
Giresun/Khalkeritis Adası Bizans Dönemi Bireylerinde Morfolojik Ve Genetik Çalışmalar İle
Cinsiyetin Belirlenmesi
minasyon riski sadece aDNA çalışmalarında değil, modern DNA çalışmalarında da görülmektedir. Ancak eski örneklerde degredasyondan dolayı çok az miktarda endojen DNA bulunduğu
için oluşabilecek kontaminasyon riski, sonuçların yanlış yorumlanmasına neden olmaktadır
(Kemp ve Smith, 2005). Kontaminasyon riski laboratuvar ortamında DNA izolasyonu veya PZR
aşamasında olabileceği gibi kazı alanında kazı ekibi tarafından da oluşabilmektedir (Akbaba,
2012). Bunun için aDNA çalışmalarının her aşaması çok dikkatli bir şekilde çalışılmalıdır. Kontaminasyon riskini en aza indirgemek için bazı önlemlerin uygulanması gereklidir. Kazı alanında kazıyı yapan arkeologlar ve kazı ekibine DNA çalışması yapılacak ise bu durum kazıya başlanmadan kazı başkanına bildirilmelidir. Kazı işlemleri sırasında mutlaka eldiven ve maske
kullanılmalıdır. Her bir örnek için kullanılan eldivenler ayrı olmalıdır. Kazı işlemleri olabildiğince hızlı bir şekilde yapılmalı ve örnekler güneş ışığına maruz bırakılmamalıdır. Toprak altından çıkartılan herbir örnek ayrı ayrı paketlenmelidir. Toprak altından çıkartılan iskeletler laboratuvar ortamına getirilinceye kadar kuru ve serin bir ortamda muhafaza edilmelidir (Burger ve
ark., 1999;Daskalaki, 2004; Bollongino, 2008).
2.MATERYAL VE METOT
Materyal
Giresun ili içinde yer alan ve Doğu Pontus Bölgesi’nin yerleşim alanlarından biri olan Giresun/Khalkeritis Adası’nda (Doksanaltı, 2011) 2011 yılında, Giresun Müze Başkanlığı ile Selçuk
Üniversitesi arkeoloji bölümü ile birlikte arkeolojik kazılar başlatılmıştır. Yapılan kazılarda ada
içerisinde bir kiliseye ait kalıntılar ve seramik parçaları, divit takımı, bronz sikke, pişmiş toprak
kapları bulunmuştur. Günümüze ulaşan bu kalıntılar M.S. 5-6.yüzyıl, Bizans Dönemi olarak
tarihlendirilmiştir. 2011 ve 2012 yıllarında yapılan bu arkeolojik kazı çalışmalarında nekropol
alandan 2011 yılında 83 adet mezar açılmış ve bu mezardan 72 adet iskelet çıkartılmıştır. 2012
yılında yapılan kazıdan ise 52 adet iskelet çıkarılmıştır (Acar,2015). Bu çalışmada kazılardan
çıkartılan iskeletlerden 10 farklı bireye ait femur ve diş morfolojik ve genetik çalışmalar yapılmıştır.Bu çalışmada materyal olarak Giresun Adası Kazısından 2011-2012 yıllarında çıkartılmış
olan iki farklı bireye ait femur kemiği ile mandibula üzerinde bulunan dişler ve 7 farklı bireye
ait diş, bir bireye ait femur kemiği çalışılmıştır (Tablo-1). DNA analizleri, Ankara Üniversitesi
Tıp Fakültesi Adli Tıp Anabilim Dalı’nda bulunan DNA Laboratuvarı’nda yapılmıştır.
Tablo-1 Giresun Adası Kazısından çıkartılmış olan iskelet buluntuları
Örneklerin Kazı Yılı
Dönemi
Buluntu Türü
Sıra Numarası
Bizans
2011
Femur, Mandibula
17
Bizans
2011
19
Bizans
2011
Bizans
Bizans
2011
2012
Bizans
Bizans
2012
2012
Femur, Maxilla
Mandibula
Maxilla
Mandibula
Mandibula
Maxilla
Mandibula
Diş
Diş
21
22
23
33
35
The Journal of Academic Social Science Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s. 538-551
541
Giresun/Khalkeritis Adası Bizans Dönemi Bireylerinde Morfolojik Ve Genetik Çalışmalar İle
Cinsiyetin Belirlenmesi
Bizans
Bizans
Bizans
2012
2012
2012
Diş
Femur, Diş
Femur
36
38
40
Metot
Giresun Adası bireylerinin cinsiyetleri hem moleküler yöntemler ile hem de morfolojik incelemeler ile belirlenmiştir. Morfolojik incelemelerde pelvis kemikleri ve kafatası kemiklerindeki
cinsiyet karakterlerinden yararlanılmıştır (WEA,1980; Krogman ve İşcan 1986; Buikstra ve
Ubelaker,1994).
Laboratuvara getirilen kemik ve diş örneklerine DNA izolasyonundan önce, kontaminasyonu
önlemek amacı ile dekontaminasyon işlemleri uygulanmıştır. Dekontaminasyon işlemleri fiziksel, kimyasal ve ultroviyole ışınına maruz bırakma aşamalarından oluşmaktadır. Dekontaminasyon işlemleri sonrasında örnekler toz haline getirilmiştir ve dekalsifikasyon işlemleri yapılmıştır. Dekalsifikasyon aşamasından sonra DNA izolasyonu yapımıştır. Elde edilen DNA’ların
miktar ve saflığını tespit edildikten sonra X-STR (Short Tandem Repeat) kiti kullanılarak PZR
yapılmıştır.
Dekontaminasyon İşlemleri
Çalışmada kullanılan dört farklı bireye ait femur kemiğinin dış kısmında bulunan kaba toprakları temizlemek amacıyla fiziksel dekontaminasyon işlemi uygulanmıştır. Çalışmaya başlamadan
önce temizliğin yapılacağı alan çamaşır suyu ile temizlenmiştir. Femur kemiklerinin dış kısmı
yumuşak diş fırçası kullanılarak kaba topraklar uzaklaştırılmıştır (Şekil-1). Her bir örnek için
ayrı diş fırçası kullanılmıştır. Daha sonra zımpara kullanılarak örneklerin dış yüzeyi temizlenmiştir (Şekil-2).
Şekil-1 Femur kemiklerinin dış yüzeyinde bulunan topraklar diş fırçası kullanılarak uzaklaştırılmıştır
The Journal of Academic Social Science Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s. 538-551
542
Giresun/Khalkeritis Adası Bizans Dönemi Bireylerinde Morfolojik Ve Genetik Çalışmalar İle
Cinsiyetin Belirlenmesi
Şekil-2 Giresun Adası Kazısından çıkartılmış olan femur kemiklerinin dış kısmı zımpara
kullanarak temizlenmiştir
Fiziksel olarak temizliği tamamlanan femur kemiklerine kimyasal dekontaminasyon işlemi
uygulanmıştır.Kimyasal dekontaminasyon işleminde tek kullanımlık diş fırçası ve Sodyum
Dodesil Sülfat (SDS) kullanılarak yapılan çözelti ile temizlenmiştir. Fiziksel ve kimyasal temizlik işlemleri tamamlanan örnekler ultroviyole ışını altında 5’er dakika bekletilmiştir. Diş
örneklerinde ise sadece kimyasal temizlik işlemi yapılmıştır (Şekil-3)
543
Şekil-3 Giresun Adası Kazısından çıkartılmış olan 23 numaralı bireye ait mandibula SDS çözeltisi kllanılarak kimyasal temizliği yapılmıştır
Pulverizasyon (Toz Haline Getirme)
Pulverizasyon işleminden önce femur kemiklerinin distal kısmından demir testeresi kullanılarak
kesit alınmıştır. Herbir örnek için demir testeresinin ucu değiştirilmiştir. Kesilmiş parçalar hassas terazide tartıldıktan sonra porselen havanda sıvı azot kullanılarak toz haline getirilmiştir
(Şekil-4).Toz haline getirilen örnekler 50 milimetrelik (ml) tüplere konulmuştur ve dekalsifikasyon işlemine geçilmiştir. Dişlerden DNA izolasyonu yapmak için ise diş hekimleri tarafından dişten pulpa çıkarılımıştır ve 2 ml’lik tüplere konulmuştur.
The Journal of Academic Social Science Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s. 538-551
Giresun/Khalkeritis Adası Bizans Dönemi Bireylerinde Morfolojik Ve Genetik Çalışmalar İle
Cinsiyetin Belirlenmesi
Şekil-4 Femur kemiklerinden kesit alındıktan sonra
sıvı azot kullanılarak toz haline getirilmiştir
Dekalsifikasyon Aşaması
Toz haline getirilmiş femur kemikleri 50 ml’lik tüplere koyulduktan sonra üzerine 30 ml. kadar
hazırlanmış olan 0,5 M (pH 7,5) Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) eklenmiştir. Tüpün
kapağı parafilm ile sarılarak,4(°)C de buzdolabında karıştırıcının içine konulmuştur ve 3 gün
boyunca dekalsifiye edilmiştir. Dekalsifikasyon işleminde ilk gün sonunda kemik tozunun olduğu tüp 3000 rpm de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Üst kısım pipet ile çekilerek atıldıktan sonra
30 ml EDTA eklenerek tekrardan inkübasyona bırakılmıştır.3.gün sonunda su ile yıkama işlemi
yapılarak dekalsifikasyon aşaması tamamlanmıştır. Pulpa elde edilen diş örneklerine ise 0,5 M
(pH 7,5)EDTA eklenerek 3000 rpm de 10 dakika santrifuj edilmiştir. Üst kısım atılarak, distile
su ile yıkama yapılmış ve dekalsifikasyon işlemi tamamlanmıştır.
DNA İzolasyonu
Dekalsifikasyonu tamamlanan örneklere fenol/kloroform DNA izolasyon yöntemi
uygulanmıştır.
1. Dekalsifikasyonu tamamlanan örnekler 2 ml.’lik ependorfa aktarılarak üzerine Tris
EDTA çözeltisi, Sodyum Klorür (Nacl) Triton X 100, Proteinase K eklendi.
2. Örnekler 1 gece 56°C’de bekletildi.
3. Ertesi gün çalışılacak örneklere Proteinase K ve DTT (Dithiothreitol) eklendi.
4. Örnekler 1 gece 56°C’de bekletildi.
5. Ertesi gün örnekler üzerine eşit hacimde fenol kloroform izoamilalkol eklenerek karıştırıldı.
6. 12500 rpm’de santrifüj edildi.
7. Üst kısım temiz bir ependorfa alınarak eşit hacimde soğuk isopropil alkol ve 1/10 oranında Na-Acetate eklendi.
8. -20 °C’de 5 saat bekletildi.
9. 14000 rpm’de 20 dakika santrifuj edildi ve üst kısım pipet ile atıldı.
10. Örnek üzerine soğuk etanol eklendi ve 14000 rpm’de santrifuj edildi.
11. Etanol pipet ile dikkatli bir şekilde atıldı.
The Journal of Academic Social Science Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s. 538-551
544
Giresun/Khalkeritis Adası Bizans Dönemi Bireylerinde Morfolojik Ve Genetik Çalışmalar İle
Cinsiyetin Belirlenmesi
12. 37 °C’de kurumaya bırakıldı. Kuruyan pellet su ile çözdürüldü ve -80(°)C’de muhafaza
edildi.
DNA’nın Miktar ve Kalitesinin Belirlenmesi
DNA’nın saflığı ve miktarı spektrofotometre kullanılarak değerlendirilir. Bu amaçla Nanodrop
ND–1000 spektrofotometre cihazı kullanılarak DNA izolasyonu yapılan örneklerin 230/260
nanometredeki (nm ) ve 260/280 nanometredeki ölçümleri yapılmıştır.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)
Kemik ve diş örneklerinden DNA izolasyonu yapıldıktan sonra QIAGEN Investigator Argus X12, X-STR kiti kullanılarak PZR mixi hazırlanmıştır ve PZR işlemi GeneAmp PZR Sistemi
9700 cihazında gerçekleştirilmiştir. 94(°) C’de 4 dakika denatürasyon aşamasından sonra 96
(°) C’de 30 sn.(saniye), 63 (°) C’de 120 sn., 72 (°) C’de 75 sn., 5 döngü, 94 (°) C’de, 30 sn,
60 (°)C’de, 120 sn, 72 (°) C’de 75 sn., 27 döngü ve 68 (°) C’de 65 sn. son uzama olacak şekilde
ayrlanarak yapılmıştır.PZR işleminden sonra elde edilen ürünler, kapiller elektroforez cihazı
(ABI Prism 310 Genetik Analizi) kullanılarak yürütme işlemi gerçekleştirilmiştir.
3.BULGULAR
Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Adli Tıp Anabilim Dalı DNA Laboratuvarın’a getirilen kemik ve diş örneklerine kontaminasyonu engellemek amacıyla öncelikle dekontaminasyon işlemleri uygulanmıştır. Fiziksel ve kimyasal dekontaminasyon işlemleri sırasında 19 numaralı femur
kemiğinin distal kısımında kırık olduğu gözlemlenmiştir (Şekil-5) ve bu kırık kısımda kontaminasyon riskinin olduğu düşünülerek, kırık olmayan kısımdan kesit alınmıştır. Diğer femur kemiklerinde kırık veya çatlak gözlenmemiştir.
Şekil-5 Fiziksel ve kimyasal dekontaminasyon işlemleri sırasında 19 numaralı femur kemiğinde
kırık olduğu gözlemlenmiştir
Femur kemikleri sıvı azot kullanılarak kolay bir şekilde toz haline getirilmiştir. Çalışma kapsamında materyal olarak kullanılan 4 farklı maxilla-mandibulada üzerinde bulunan diş örneklerinden pulpa çıkarılmadan önce örnek seçimi yapılmıştır. Mandibula üzerinde bulunan diş örenklerinin kullanımı tercih edilmiştir. Femur kemiği ve diş örneklerinden fenol/kloroform yöntemi ile
DNA izolasyonu yapılmıştır.DNA izolasyonundan sonra DNA miktar ve saflığı ölçülmüştür ve
elde edilen değerler ile kullanılan pulpa ve kemiklerin toz miktarı Tablo-2’de verilmiştir.
The Journal of Academic Social Science Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s. 538-551
545
Giresun/Khalkeritis Adası Bizans Dönemi Bireylerinde Morfolojik Ve Genetik Çalışmalar İle
Cinsiyetin Belirlenmesi
Tablo-2 DNA İzolasyonunda kullanılan kemik tozu ile pulpa miktarları ve DNA izolasyonu
sonucunda elde edilen DNA miktar ve saflık ölçümleri
Örnek
Numarası
Miktar
ng/ µl
260/280nm
260/230nm
17
17
19
19
21
22
23
33
35
36
38
38
40
5,4
17,4
56,7
37,9
44,9
17,6
77,7
66,0
46,1
18,5
5,09
46,1
8,5
1,22
1,56
1,42
1,45
1,56
1,45
1,34
1,39
1,29
1,33
2,09
1,29
1,41
0,45
0.06
0,12
0,52
0.09
0,08
0,27
0,45
0,33
0,10
0,10
0,33
0,05
DNA İzolasyonu
için Kullanılan Kemik Tozu (gr)
0.24
0.07
0,30
0,17
0.08
0,13
0,14
0,08
0,42
0,15
0,04
0,42
0,42
Buluntu Türü
Femur
Mandibula
Femur
Mandibula
Mandibula
Mandibula
Diş
Diş
Diş
Diş
Diş
Femur
Femur
DNA izolasyonundan sonra QIAGEN X-STR Kiti kullanılarak PZR mixi hazırlanmıştır. Çalışmada toplamda 4 adet femur,4 adet mandibula üzerinde bulunan diş örnekleri ve çene üzerinde
bulunmayan 5 adet diş örneği kullanılmıştır. Yapılan PZR sonrasında femur kemiklerinde ve
toplamda 5 adet diş örneğinin amelogenin gen bölgesinde amplifikasyon olduğu bulunmuştur ve
şekil-6’da erkek bir bireye ait, şekil-7’de dişi bir bireye ait X-STR PZR sonucunda oluşan elektroforez görüntüsü verilmiştir. Moleküler analizler ile antropolojik incelemeler sonucunda elde
edilen bulgular toblo-3’te verilmiştir).
Şekil-6 X-STR sonucunda 33 numaralı bireyin diş örneğinde amelogenin gen bölgesinin X
ve Y kromozomlarında amplifikasyon oluşmuştur ve cinsiyeti erkek olarak belirlenmiştir
The Journal of Academic Social Science Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s. 538-551
546
Giresun/Khalkeritis Adası Bizans Dönemi Bireylerinde Morfolojik Ve Genetik Çalışmalar İle
Cinsiyetin Belirlenmesi
Şekil-7 X-STR sonucunda 40 numaralı bireyin femur örneğinde amelogenin gen bölgesinin
sadece X kromozomunda am plifikasyon oluşmuştur ve cinsiyeti dişi olarak belirlenmiştir
Tablo-3 Kemik ve diş örneklerinden elde edilen moleküler ve antropolojik bulgular
Örnek Numarası
Antropolojik Bulgu
Moleküler Bulgu
17 Femur
17 Mandibula
19 Femur
19 Mandibula
21 Mandibula
22 Mandibula
23 Diş
33 Diş
35 Diş
36 Diş
38 Diş
38 Femur
Erkek
Erkek
Erkek
Erkek
Erkek
Dişi
Dişi
Erkek
Dişi
Dişi
Erkek
Erkek
40 Femur
Dişi
4.TARTIŞMA VE SONUÇ
Dişi
Dişi
Dişi
Dişi
Belirlenemedi
Belirlenemedi
Dişi
Erkek
Belirlenemedi
Belirlenemedi
Belirlenemedi
Dişi
Dişi
Bu çalışmada Giresun Adası Kazısından çıkartılan femur ve diş örnekleri aDNA çalışması
yapılması amacıyla Giresun Müze Müdürlüğü tarafından gerekli izin belgesi alındıktan sonra
laboratuvarda çalışmalara başlanmıştır. Antik DNA çalışmalarında uygulanması gereken
prosedürler modern DNA çalışmaları ile aynıdır,ancak çalışılan örnekler tarih öncesi döneme ait
olduğundan dolayı DNA degredasyonu meydana gelmektedir.Antik DNA çalışmalarında
oluşabilecek kontaminasyon riski yanlış sonuçlara neden olacağı için Yang ve Watt’ın (2005)
çalışmaları dikkate alınarak fiziksel,kimyasal dekontaminasyon ve ultroviyole ışını bütün
örneklere uygulanmıştır.
Uzun süre toprak altında kalmış olan kemik ve diş örneklerinde Ca ve Mg iyonunun
birikmesiyle kalsifikasyon oluşmaktadır ve bu durumda DNA elde etmeyi güçleştirmektedir
(Cemper-Kiesslich, 2014). Yapılan PZR sonuçlarına göre 4 adet femur kemiğinde amelogenin
gen bölgesinde amplifikasyon oluşmuştur,ancak çalışılan 9 adet diş örneğinin 5’inde
amplifikasyon oluşmamıştır. Dişlerde pulpa içerisinde DNA’nın çok iyi korunduğuna dair
The Journal of Academic Social Science Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s. 538-551
547
Giresun/Khalkeritis Adası Bizans Dönemi Bireylerinde Morfolojik Ve Genetik Çalışmalar İle
Cinsiyetin Belirlenmesi
çalışamalar mevcuttur (Pfeiffer, 1999; Alakoç 2007; Higgins ve Austin, 2013). Bu çalışmada
dişlerden elde edilen pulpa miktarı yeterli olmadığı için DNA izolasyonu tekrar edilememiştir.
Kemik ve diş örneklerine uygulan dekalsifikasyon işleminin dişlerde DNA kaybının olabileceğini düşündürmektedir.
Antik DNA çalışmalarında degredasyon ve kontaminasyon sorunu önemli olduğu kadar eski
örneklerden DNA elde edilmesinde uygulanan DNA izolasyon yöntemi de oldukça
önemlidir.Bu çalışmada kullanılan fenol/kloroform DNA izolasyon yöntemi sonucunda Bizans
döneminde yaşamış toplamda 13 örnek ile çalışılmıştır ve %61,5 oranında bir başarı
sağlanmıştır.DNA izolasyonu kadar kullanılan PZR kiti de bu çalışmada önemli
olmaktadır.Kullanılan PZR kitinde 1ng DNA yeterli olmaktadır,ancak eski örneklerde DNA
miktarı kadar DNA kaliteside önemli olmaktadır ve nanadrop ölçümünde insan ait saf DNA
dışında ekzojen DNA da ölçülmektedir. X-STR kiti ile ekzojen DNA veya kontaminasyonun
olup olmadığı belirlenmektedir.Özelliklede antik DNA çalışmalarında uygulanan protokoller bu
noktada çok önemlidir. Çünkü antik örneklerde az miktarda bulunan DNA, kontaminasyon
oluştuğu zaman PZR’da ekzojen DNA amplifiye olacaktır ve kapiller elektroforez yerine agaroz
jel kullanımında görülecek olan bantlar aslında kontamine DNA’ya ait olmaktadır ve bu
durumda bize yanlış sonuç verecektir. X-STR PZR kitinin ve kapiller elektroforez kullanımında
12 gen bölgesinden modern DNA örneklerinde tüm bölgelerde amplifikasyon oluşurken başarılı
bir DNA izolasyonu ve PZR sonucunda antik örneklerde amelogenin gen bölgesinde
amplifikasyon oluşmaktadır. Amelogenin gen bölgesinin bir alleli 106 bç., diğer alleli de 112
baz çifti uzunluğundadır (Sullivian ve ark., 1993; Faerman ve ark., 1997). Yapılan bu çalışmada
amplifikasyon oluşmayan diş örneklerinde hiçbir pik görülmemiştir ve amplifikasyon oluşan
bireylerde de sadece amelogenin bölgesinde amplifikasyon oluşmuştur. Bu durum laboratuvar
personelinden veya dış ortamdan kaynaklı ekzojen DNA’nın olmadığını göstermektedir.
Moleküler çalışmalar sonucunda elde edilen veriler, iskeletler üzerinde yapılan morfolojik
incelemeler sonucunda elde edilen cinsiyet sonuçları ile karşılaştırılmıştır.17 ve 19 numaralı
bireye ait femur kemiği ile diş örnekleri çalışılmıştır. Bu örneklerde amplifikasyon oluşmuştur
ve 17 ve 19 numaralı bireyin cinsiyeti moleküler çalışmalar sonucunda dişi, morfolojik incelemeler sonucunda ise cinsiyetin erkek olduğu belirlenmiştir. 38 numaralı bireye ait diş örneğinde
amplifikasyon oluşmadığı için cinsiyet belirlenememiştir, ama femur kemiğinde 106 baz çiftinde bir pik oluştuğu için cinsiyet dişi olarak belirlenmiştir. Bu üç bireya ait antropolojik ve moleküler cinsiyet sonuçları birbirini desteklememektedir. Bu örneklerin PZR sonucunda yapılan
elektroforez görüntülerinde sadece amelogenin gen bölgesinde amplifikasyonun oluşması, diğer
gen bölgelerinde hiçbir pik vermemesi kontaminasyondan dolayı yanlış sonuç ihtimalini ortadan
kaldırmaktadır. Toplu gömülerde bireylerin yan yana veya üst üste düzensiz bir şekilde gömülmüş olması morfolojik incelemeler ile cinsiyet belirlemede yaklaşık olarak %12 oranında bir
hataya neden olmasını belirten çalışmalar vardır (Kaestle ve Horsburgh, 2002). Morfolojik cinsiyet tayini ve DNA’ya göre yapılan cinsiyet tespiti farklılıklarının ortaya çıkması beklenmedik
bir bulgudur. Giresun Adası / Khalkeritis Nekropolü kazısından çıkartılan ve moleküler analizler için laboratuvara getirilen kemikler genel olarak iyi korunmuştur. Ancak, iskeletlerin yan
yana gömülü olması ve kemiklerin karışık durumda olması birey tayininin yapılmasını zorlaştırmıştır. Ayrıca kazılarda bazen iskelet materyalleri parçanmış şekilde ve bazen de bireylerin
kemiklerinin eksik olmasından cinsiyet tespitini zorlaştırmaktadır. Bu gibi durumlarda kimliklendirmenin temelini oluşturan cinsiyet tespitinde DNA analizlerinin önemini ortaya koymaktadır. Ayrıca fen bilimlerinde araştırma yapan moleküler biyologlar ile sosyal bilimlerde araştırma
The Journal of Academic Social Science Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s. 538-551
548
Giresun/Khalkeritis Adası Bizans Dönemi Bireylerinde Morfolojik Ve Genetik Çalışmalar İle
Cinsiyetin Belirlenmesi
yapan arkeolog ve antropologlar arasında kurulan iletişim ve yapılan ortak çalışmalar ile tarih
öncesi dönemde yaşayan insanlar hakkında ortak bir verini sağlanması açısından multidisipliner
çalışmaların önemli olduğu ortaya konulmuştur.
Teşekkürler
Giresun/Khalkeritis Adası Kazısından çıkartılan iskeletleri DNA analizleri için izin veren
Doç.Dr. Ertekin Doksanlatı’ya, iskeletlerin morfolojik incelemeleri ile ilgili bilgileri veren Yrd.
Doç.Dr. Seda Karaöz Arıhan’a ve arkeolog Emel ACAR’a teşekkürler. Ayrıca doktora tezi kapsamında yapılan bu çalışma Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından desteklenmiştir.(Proje Numarası: 15L0649002)
KAYNAKLAR
Akbaba, Ali, (2012),Moleküler Antropolojide Antik DNA (aDNA) Çalışmaları ve Kontaminasyon Problemleri, Yüksek Lisans Tezi, Ahi Evran Üniversitesi, Kırşehir.
Acar, E., (2015),Giresun/ Khalkeritis (Aretias) Adası Nekropolü ve İskeletlerin Paleoantropolojik Analizi, Yüksek Lisans Tezi, Selçuk Üniversitesi, Sosyal Bilimler Enstitüsü, Konya.
Bollongino,R., Vigne,JD.,(2008), ‘’Temperature monitoring in archaeological animal bone
samples in the Near East arid area, before, during and after excavation’’,Journal Archaeological Sciences, 34 (4), 873–881.
Buıkstra, JE., UBELAKER, DH., (1994). Standards for data collection from human skeletal
remains. Arkansas: Arkansas Archeological Survey Research Series No.4.
Burger,J., Hummel,S., Herrman,B., Henke,W., (1999), ‘’DNA preservation: A microsatelliteDNA study on ancient skeletal remains.Electrophoresis’’, 20, 1722–1728.
Cemper-Kiesslich,J., Coy,MR., Kanz,F.,(2014), ‘’Ancient DNA and Forensic Mutual Benefits:A Practical Sampling and Laboratory Guide Through a Virtual Ancient DNA
Study’’,Adli Tıp Bülteni,19(1)-14.
Çırak, Asuman, (2009), Kelenderis İskeletlerinin Paleoantropolojik Analizi ve Anadolu Toplumları Arasındaki Yeri, Doktora Tezi, Ankara Üniversitesi, Sosyal Bilimler Enstitüsü,
Antropoloji Anabilim Dalı, Ankara.
Daskalaki,E., (2004), Archaeological Genetic-Approaching Human History through DNA
Analysis, Digital Comprehensive Summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty
of Science and Technology 1101,Uppsala Univercity,Swedish.
Doksanaltı, EM.,Mimiroğlu,ĠM.,Güleç,H.,(2011),Giresun (Aretias-Khalkeritis) Adası Kazısı
Ön Rapor:Anadolu ve Çevresinde Ortaçağ, AKVAD, Ankara, s: 163- 184.
The Journal of Academic Social Science Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s. 538-551
549
Giresun/Khalkeritis Adası Bizans Dönemi Bireylerinde Morfolojik Ve Genetik Çalışmalar İle
Cinsiyetin Belirlenmesi
Faerman,M., Filon,D., Kahila,G., Greenblatt,CL.;Smith,P., Oppenheim,A., (1995), ‘’Sex identification of archaeological human remains basen on amplification of the X and Y amelogenin alleles’’,Genetics,29;167(1-2):327-32.
Higuchi, R., Bowman, B., Freiberger, M., Ryder, OA., Wilson, AC., (1984) ,‘’DNA sequences
from the quagga, an extinct member of the horse family’’,Nature. 312: 282–284.
Krogman, WM., İşcan, MY., (1986). The Human Skeleton in Forensic Medicine.Illionis,
Charles C. Thomas
Kaestle, FA.ve Horsburgh, KA., (2002).Ancient DNA in anthropology: Methods, applications, and ethics, American Journal Pysical Anthropology, Suppl. 35:92-130.
Kemp,BM.,Smith,DG., (2005), Use of eliminate contaminating DNA from the surface of bones
and teeth. Forensic Science İnternational, 154 s: 53-61.
Malaver,PC., Yunıs,JJ., (2003), Different dental tissues as a source of DNA for
human identification in forensic cases, Croatian medical Journal.44:306-309
Mullis,K.,Faloona,F.,Scharf,S.,Horn,G;Erlich,H.,(1986),‘’Spesificenzymatic amplification of
DNA in vitro: the polymerase chain reaction’’, Cold Spring Harbor Symp Quant Biol
51:263-271.
Ortner,DJ., Putschar,WGJ.,(1981), ‘’Identification of Pathological Conditions in Human Skeletal Remains’’,Washington.DC.,Smithsonian Institution Press.
Pääbo,S., (1985), ‘’Molecular cloning of Ancient Egyptian mummy DNA’’,Nature 314, 644 –
645,10,1038/314644a.
Pääbo,S., Poinar,H., Serre,D., JaenickeDespres,V., Hebler,J;,Rohland.,N.;Kuch,M., Krause,JVigilant,L., Hofreiter,M., (2004),‘’Genetic analyses from ancient DNA,Annual Review Genetics’’, 38: 645-679.
O’Rourke,DH.,Hayes,MG.,Carlyle,SW., (2000),‘’Ancient DNA studies in physical anthropology’’,Annual Review Anthropoogical 29.217–242.
Stone,A.;Milner,GR.;Pääbo,S.;Stoneking,M., (1996), ‘’Sex Determination of Ancient Human
Skeletons Using DNA’’,American Journal of Physical Anthropology 99:231-238.
Singh,J.;Garg,A., (2014), ‘’Ancient DNA Analysis And Its Probable Applications In Forensic
Anthropology’’,Journal Punjab Acad Forensic Medicine Toxicology, 14.
Tekeli,E.;Elma,C.,(2016), ‘’Antropolojik Kemik Örneklerinden Antik DNA Çalışması’’,Ankara
Üniversitesi Dil ve Tarih Coğrafya Fakültesi Antropoloji Dergisi,Sayı:2,s.23 41.
The Journal of Academic Social Science Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s. 538-551
550
Giresun/Khalkeritis Adası Bizans Dönemi Bireylerinde Morfolojik Ve Genetik Çalışmalar İle
Cinsiyetin Belirlenmesi
Ubelaker,DH., (2008), Biological Anthropology of the Human Skeleton.Second Edition, Edited
by M.Anne Katzenberg and Shelley R.Saunders, s: 41-61.
Yang,DY.,Watt,K. ,(2005),‘’Contamination controls when preparing archaeological remains for
ancient DNA analysis’’,Journal of Archaeological Science 32, 331–336.
Workshop of European Antropologists (WEA) (1980),Recommendations for Age and Sex Diagnoses of Skeletons, Journal of Human Evolution, 9 (7): 517-549.
551
The Journal of Academic Social Science Yıl: 5, Sayı: 44, Nisan 2017, s. 538-551