MBKY II-2. Hibridizasyon Yöntemleri
advertisement
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II NÜKLEİK ASİTLERİN İŞARETLENMESİ VE HİBRİDİZASYON (MELEZLEME) YÖNTEMLERİ NÜKLEİK ASİTLERİN İŞARETLENMESİ VE HİBRİDİZASYON (MELEZLEME) YÖNTEMLERİ İstenilen nükleik asit dizisinin n. asit molekülü içinde bulunması; • Moleküler biyoloji ve • Rekombinant DNA çalışmalarının vazgeçilmez işlemlerinden biridir. NÜKLEİK ASİTLERİN İŞARETLENMESİ VE HİBRİDİZASYON (MELEZLEME) YÖNTEMLERİ • • • • Gen yapısı incelemeleri Gen anlatımı analizi Haritalama Gen aktarımı çalışmalarında transformantların analizi çalışmalarında kullanılır. NÜKLEİK ASİTLERİN İŞARETLENMESİ VE HİBRİDİZASYON (MELEZLEME) YÖNTEMLERİ • MELEZLEME’nin esası, Tek iplikli nükleik asitlerin tamamlayıcı nükleik asitlerle (PROB) eşleşerek melez moleküller oluşturmalarına dayanır. • Melezlemeler: DNA/DNA, RNA/RNA, RNA/DNA arasında olabilir. • Melezlemeler; DNA ya da moleküller üzerinde belli bölgeleri belirlemek için gerçekleşebilir. NÜKLEİK ASİTLERİN İŞARETLENMESİ VE HİBRİDİZASYON (MELEZLEME) YÖNTEMLERİ • Melezleme için PROB kullanımına gereksinim vardır. PROB: Araştırılan nükleik asit dizisine tamamlayıcı, radyoaktif ya da radyoaktif olmayan bir belirleyici ile işaretli, tek iplikli nükleik asitlerdir. Bu dizilerin radyoaktif veya radyoaktif olmayan bir belirleyici ile işaretlenmesi neticesinde hibridizasyon reaksiyonu sonucu oluşan çift iplikli molekül görülebilir hale gelir. PROBUN HAZIRLANMASI VE İŞARETLENMESİ • Prob hazırlamak, istenilen DNA fragmentinin kalıp olarak kullanılması ve ona tamamlayıcı DNA zincirinin in vitro sentez edilmesi demektir. • Probların işaretlenmesi, probun cinsine göre farklı şekillerde yapılır. Radyoaktif olmayan işaretleme ve belirleme sistemi • Digoksigenin-­‐ anti-­‐ digoksigenin sistemi • Yabanturpu (Armoracia lapathifolia) peroksidaz sistemi ve • Biotin-­‐streptavidin Melezlenmiş probun belirlenmesi • Kromogenik (kolorimetrik) • Kemoluminogenik IŞIK substratlar kullanılarak gerçekleştirilir. Digoksigenin (DIG) sistemi • Digoksigenin; prob sentezi sırasında işaretleyici olarak kullanılır. • Prob hazırlama in vitro DNA sentezidir. Sentez sırasında – dATP – dTTP – dGTP – dCTP – Digoksigenin-­‐11-­‐dUTP (DIG-­‐11-­‐dUTP) kullanılır SONUÇ: Kalıptaki her A’ya karşılık ya dTTP ya da DIG-­‐11-­‐ dUTP prob yapısına girer İŞARETLİ PROB SENTEZLENİR. Digoksigenin-­‐ anti-­‐ digoksigenin sistemi • İşaretleme için kimyasal bir madde=bir bitkisel sekonder metabolit (Digitalis lanata’dan elde edilen digoksigenin) kullanılır. • Prensibi otoradyografi • Radyoaktivite kullanılmaz. • Kolay uygulanabilirlik • Hızlı • Özgül ve duyarlı • Probların uzun zaman kullanılabilmesi (1 yıl kadar) Probların hazırlanması-­‐işaretlenmesi • DNA probları; aşağıdaki yöntemlerle işaretlenir. 1. ‘Random primed’ işaretleme: In vitro DNA sentezi sırasında yeni sentez edilen probun yapısına rastgele biçimde DIG-­‐11-­‐ dUTP’ler girer. 2. ‘Nick translation’: DNaz I enzimi ile çift iplikli DNA’nın tek ipliğinde kesikler oluşturma esasına dayanır. E. coli DNA polimeraz I enziminin 5’-­‐3’ ekzonükleaz aktivitesi ile tek iplik üzerinde kesik noktalar genişletilir ve boşluklar aynı anda enzimin 5’-­‐3’ polimeraz aktivitesi ile ve DIG işaretli dNTP’lerle doldurulur. 3. Taq DNA polimeraz ile işaretleme: PCR ile prob DNA’sı çoğaltılırken Taq DNA polimeraz enziminin diğer dNTP’lerin yanısıra DIG işaretli dNTP’leri de kullanmasıyla işaretleme gerçekleştirilir. Random-­‐primed işaretleme Probların İşaretlenmesi • RNA probları; T3, T7 ve SP6 RNA polimerazları ile in vitro transkripsiyon reaksiyonu ile sentezlenirken ortama katılan DIG-­‐11-­‐dUTP ile işaretlenir. • Oligonükleotit problar; terminal transferaz enzimi ile ya 3’ uca bir DIG-­‐11-­‐dUTP veya DIG-­‐ 11-­‐dUTP’den oluşan bir kuyruk eklenmesi ile ya da digoksigeninNHS-­‐esterin 5’ uca eklenmesi ile işaretlenir. NÜKLEIK ASIT HIBRIDIZASYONU REAKSIYONUNUN TEMELLERI • Çift iplikli bir nükleik asitin dayanıklılığı onun erime(melting temperature=Tm) sıcaklığını hesaplayarak belirlenir. Bu değer her bir organizma için farklıdır. • Hibrid molekül ne kadar dayanıklı ise, Tm derecesi o kadar yüksektir, yani ipliklerin ayrılması için gereken enerji o oranda fazladır. HIBRID NÜKLEİK ASİTLERİN DAYANIKLILIĞI BİR TAKIM FAKTÖRLERE BAĞLIDIR. 1.Guanin-­‐sitozin oranı (%GC): GC çiftleri, 3 H bağı içerdiğinden, AT çiftlerine göre daha sağlamdır. Bu nedenle yüksek GC içeriğine sahip olan DNA, AT bakımından zengin olan DNA’ya nazaran daha dayanıklıdır ve iki ipliği ayırmak için daha çok enerji gereklidir. 2.Hibrid molekülün boyu: Genellikle uzun bir nükleik asit molekülü, kısa olana göre daha sağlamdır. Çünkü içerdiği hidrojen bağı sayısı daha fazladır. Böylece iki ipliği ayırmak için daha çok enerji gerekir. 3.Nükleik asitlerin içinde bulunduğu ortam: Hibridizasyon karışımı ve hibridizasyon sonrası yıkama solüsyonlarında, tek değerlikli katyonları içeren iyonik bir tuz tamponu içinde formamid bulunur. Formamid hidrojen bağlarını bozarak çift iplikli nükleik asitlerin çözülmesini kolaylaştırır. Bunun tersine Na+ gibi tek değerlikli katyonların konsantrasyonunu artırmak hibridleri sağlamlaştırır. Organik çözücülerin çift iplikli polinükleotitlerin ısıya dayanıklılığını azaltarak daha düşük sıcaklıklarda hibridizasyona olanak vermesi bu problemi çözümlemiştir. Formamid bu amaçla kullanılan organik bir çözücüdür; DNA/DNA ve DNA/RNA çift ipliklerinin ayrılma sıcaklığını azaltır. Böylece hibridizasyon, %50 formamid varlığında 30-­‐ 45°C’da gerçekleştirilebilir. • 4. Nükleik asit hibridinin çeşidi: RNA/RNA hibridleri DNA/DNA hibridlerine göre ısıya daha dayanıklıdır. DNA/RNA hibridleri ise orta dayanıklılıktadır. • 5. Yanlış eşleşen hibridlerin varlığı: Yanlış eşleşen nükleotitler (A-­‐T yerine T-­‐T vb.) hibridin dayanıklılığını azaltır. Çünkü bunlar arasında hidrojen bağları oluşamaz. Yanlış eşleşmenin dayanıklılığı azaltan etkisi, kısmen prob uzunluğuna bağlıdır. Çift iplikli hibrid ne kadar uzun ise yanlış eşleşmiş bir çiftin, hibrid dayanıklılığına etkisi o kadar azdır. Hibridizasyon ve Belirleme 1-­‐ Probların işaretlenmesi 2-­‐ Taranacak DNA büyük ise RE’leri ile kesilir (genomik/plazmit DNA’sı). 3-­‐ Kesilmiş parçalar agaroz jele yüklenir, parçalar ayrılır. 4-­‐ Nitroselüloz membrana aktarım yapılır (blotting). 5-­‐ DIG işaretli prob ile hibridizasyona bırakılır. 6-­‐ Prob tamamlayıcı bölge ile hibridlenir. 7-­‐ Anti-­‐ DIG ile (alkalen fosfataz bağlı DIG antikoru) muamele edilir. 8-­‐ dUTP’lere bağlı DIG ile anti-­‐DIG arasında antijen-­‐antikor kompleksi kurulur. 9-­‐ Alkalen fosfataz substratları olan NBT ve X-­‐fosfat eklenir. 10-­‐ Enzim aktivitesi sonucu mavi renkli ürün oluşumu hibridizasyon gösterir. Hibridizasyon ve Belirleme Belirleme MELEZLEME • İzole edilip, jel elektroforezi ile ayrılan ve nitrosellüloz/naylon membrana aktarılan; • DNA moleküllerinin (Southern blotting-­‐emdirim) veya • RNA dizilerinin (Nouthern blotting) veya • hücre ve dokulardaki DNA ya da RNA’nın belirlenmesinde (in situ melezleme) kullanılır. I. SOUTHERN BLOTTİNG (SOUTHERN EMDİRİMİ) • • • • E. Southern tarafından 1975’de tanımlandı. Southern blotting’in temeli, istenilen DNA fragmentinin problar ile melezlenmesi ve melezlemenin ardından belirleyicinin özelliğine göre radyoaktif, immünolojik, kimyasal yada fluoresan yöntemlerle görünür hale getirilmesidir. ELECTROBLOTTİNG İLE SOUTHERN AKTARIMI • DNA parçalarının, özellikle de restriksiyon enzim kesimi uygulaması ile oluşan, boyutları birbirine çok yakın ve çok sayıda olanların, agaroz jeldeki bantları kısa sürede difüzyonla kaybolabileceğinden ve/veya agaroz jel kolayca kırılıp parçalanabileceğinden hibridizasyon amacıyla jeli kullanmak uygun değildir. • Bu nedenle agaroz jeldeki DNA parçaları electroblotting ile bir membrana (örneğin nitroselüloz membrana) aktarılır. Böylece DNA parçaları membran üzerinde tutuklanmış (immobilize edilmiş) olur. BLOTTİNG MACHINE SOUTHERN BLOTTİNG (SOUTHERN EMDİRİMİ) • Probların işaretlenmesinde son yıllara kadar belirleyici olarak – P32 – S35 ve – H3 radyoizotopları yaygın bir biçimde kullanılmış ve bu nedenle de teknik, otoradyografi olarak adlandırılmıştır. • Otoradyografi – hızlı sonuç vermesi avantaj – güvenilirliği – radyoaktif maddelerle çalışma zorluğu dezavantaj – tehlikeler en önemli SOUTHERN BLOTTİNG -­‐ Otoradyografi-­‐ Southern blotting ile restriksiyon fragmenti analizi •Örn; üç farklı bireyden alınan DNA örneklerinin karşılaştırılmasında; a) Test edilecek DNA örnekleri uygun olan kaynaklardan elde edilir, DNA’dan restriksiyon fragmentleri oluşturulur. b) Her bir örneğe ait restriksiyon fragment karışımı elektroforezle ayrılır. Her bir örnek karakteristik bir bant modeli meydana getirir. c) Alkali bir solüsyon, jelin üst tarafına doğru kapiller etkiyle çekilir ve DNA denatüre halde jelin üstünde bulunan nitroselüloz kağıt tabaka üzerine aktarılır. Tek zincirli DNA’lar tamamen jeldeki konumlarında kağıt üzerine tutunurlar. d) Kağıt blot, radyoaktif olarak işaretlenmiş prob içeren bir solusyona maruz bırakılır. Prob, istenen DNA dizisine komplementer dizinin restriksiyon fragmentlerine baz eşleşmeleriyle bağlanır. c) Transfer Film e) Bir tabaka fotoğraf filmi kağıt üzerine yerleştirilir. Bağlanan probdaki radyoaktivite özgül DNA bantlarının karşısında görüntü oluşturmak üzere filmi ışınlar-­probla baz eşleşmesini yapan DNA’yı içeren bantlar. Örneğin 1 ve 2’nin band modelleri birbirinin aynısıdır, fakat 3 farklıdır. II. NORTHERN BLOTTİNG • İlgilenilen genin transkripsiyon ürünü olan RNA’nın analizinin yapılmasında kullanılan başlıca yöntemlerden biri DNA-­‐RNA hibridizasyonudur. • Northern hibridizasyonu olarak adlandırılan bu yöntemde önce total RNA agaroz jelde yürütülerek RNA moleküllerinin ayrılması sağlanır. Daha sonra jelde ayrılmış RNA molekülleri membrana aktarılır ve RNA’nın membran üzerine sabit şekilde bağlanması sağlandıktan sonra uygun problarla hibridizasyon işlemi gerçekleştirilir. Otoradyogram yoluyla ortaya çıkarılan bantlar ilgilenilen genin mRNA varlığı ve boyutu hakkında bilgi verir. NORTHERN BLOTTİNG • Membranlar; genellikle naylon veya nitroselüloz yapıdadır. • Nötr, negatif veya pozitif yüklü olabilirler. • Northern hibridizasyon için genellikle tercih edilen naylon membrandır, fakat organik çözücüler etkisinde bırakıldığında küçülebilir veya katlanabilir. • Nitroselüloz membranlar ise fiksasyon işlemindeki fırınlama sırasında yanabilir ve/veya yıkama sırasında kolayca yırtılabilir. YÖNTEM; GEREKLİ MALZEMELER 1. Denatürasyon çözeltisi: NaOH 50 mM, NaCl 10 mM 2. Nötralizasyon çözeltisi: Tris pH 7,5 100 mM 3. Melezleme öncesi çözelti: SDS %7’lik, Sodyumfosfat 50 mM pH 7, foramid %50, bloklama ajanı %2’lik, 5X SSC, laurilsarkosin, prob . YÖNTEM 1. RNA jelde yürütülür . 2. Bu jel alınır ve denatürasyon solüsyonuyla 30 dk muamele edilir. DEPC’li suyla yıkanır. 3. Nötralizasyon çözeltisiyle muamele edilir ve tekrar DEPC’li suyla yıkanır. 4. Membran alınır nitroselüloz veya naylon olabilir. (Naylon membran küçülebilir nitroselüloz membran ise yırtılabilir.) DEPC’li suyla yıkanır ve 10 X SSC’ de bekletilir. 5. Membranın görüntüsü alınır (blotlamadan sonra yorum yapılması için önemlidir). YÖNTEM 6. En alta filtre kağıdı onun üzerine membran onun üzerine de jel ve jelin üzerine de tekrar filtre kağıdı koyulur. Bunların üzerine ağırlık koyulur ve bir gece bekletilir. 7. Membran alınır. UV’de bakılır, önceden DEPC’li suyla yıkanmış streç dosyaya koyulur ve 4 derecede saklanır. 8. Melezleme tamponundan 1000 mikrolitre alınır ve bu streç dosyaya koyulur oluşan kabarcıklar yok edilir. 9. Melezleme fırınında 1 gece 50◦C’de bekletilir. 10. Hazırlanan prob 100◦C’de 10 dk denatüre edilir ve melezleme solusyonuyla karıştırılır. YÖNTEM 11. Streç dosyadan çıkarılan membran 6 ml melezleme tamponuyla muamele edilir ve tekrar streç dosyada 1 gece bekletilir. 12. Membran alınıp 2 kez 5’er dk. oda sıcaklığında 5’er dk. yıkanır. 13. 2 kez 15’er dk da %1’lik yıkama solüsyonuyla 68 ◦C’de çalkalanır. 14. Membran streç dosyaya tekrar alınır ve 5 ml CDP-­‐star ile muamele edilir, 1 gece karanlıkta röntgen filmi üzerine koyulmuş şekilde bekletilir. 15. Röntgen film 5’er dk 2 kez solüsyonda yıkanır. 16. Film görüntüsü alınır. III. IN SiTU HIBRIDIZASYON • In situ hibridizasyon (ISH), nükleik asit dizilerinin (DNA ve RNA) morfolojik olarak korunmuş kromozomlar, hücreler veya doku kesitlerinde saptanarak gösterilmesini sağlayan ve temel olarak çift iplikli nükleik asit oluşumu kinetiğini kullanan güçlü bir tekniktir. • In situ hibridizasyonun diğer hibridizasyon yöntemlerinden (Southern veya Northern Blotting) farkı nükleik asitlerin kendi hücresel ortamlarında tanınarak gösterilmesidir. Böylece hedef nükleik asit dizisinin hücredeki yeri belirlenmiş olur. IN SiTU HIBRIDIZASYON Nükleik asitlerin bulundukları yerde saptanması; • Kromozomların fiziksel haritalarının yapılmasında, • Kromozom yapı ve hatalarının analizinde, • Kromozomların ve genomun yapı, işlev ve evriminin araştırılmasında, • Gen anlatımının belirlenmesinde, • Eşey tayininde, • Dokudaki virüs ve bakterilerin tanısında, • Transformasyon dizilerinin ve onkogenlerin yerlerinin belirlenmesinde önemlidir. Kullanıldığı Yerler • İn situ melezleme belirli bir mRNA’nın doku içinde nerede bulunduğunu görmemize yarar. Bu metod inceleyenin ilgilendiği mRNA’nın normal yerini görmesine olanak sağlar. • In situ melezleme oldukca kolay bir tekniktir ve histolojik dokulardaki hedef mRNA’nın işaretlenmis nükleik asit probuna hibridizasyonunu sağlayarak dengeli hibridler oluşturur ve böylece probun yeri görülür. • Bu teknoloji ayrı türlerdeki hücre populasyonlarında gen anlatımı calısmak için kesin bir metoddur. Çünkü tek bir hücre çözünürlüğünde hedef mRNA’nın bulunmasına izin verir. Kullanılan prob tipleri • DNA probları: Yüksek spesifik aktivite gösterir. Prob olarak kullanılmadan önce denatüre edilmelidir. • RNA probları: RNA-­‐RNA hibridleri en stabil hibridlerdir. RNA probları düsük stabilite gösterir ve RNaz’larla kolaylıkla yok edilebilirler. • Oligonükleotid probları (15-­‐50 nükleotid): Dizi hedef diziye tamamlayıcı olarak tasarlanır. Problar çok stabildir. Küçuk̈ boyutundan dolayı hedefe kolayca girebilir. Prob işaretleri IN SiTU HIBRIDIZASYON • In situ hibridizasyonun anlaşılması moleküler biyoloji, genetik, immünokimya ve histokimya bilgilerini gerektirmektedir. • Yöntemin başlıca aşamaları; ü Biyolojik materyalin hazırlanması & Probun işaretlenmesi, ü Prob ve materyalin denatürasyonu, ü Hibridizasyon, ü Yıkama, ü Saptama, ü Görünür hale getirme. IN SiTU HIBRIDIZASYON • ISH yöntemi ilk kez 1969’da birbirinden bağımsız olarak çalışan iki grup araştırıcı tarafından (John ve ark., Pardue ve Gall) uygulandı. • İlk uygulamalarda nükleik asitleri işaretlemede radyoizotoplar kullanılmaktaydı; buna göre hibritleşmiş dizileri göstermek için başvurulan tek yöntem otoradyografiydi. • Ayrıca, o sıralarda moleküler klonlama mümkün olmadığından ISH sadece biyokimyasal metotlar ile saflaştırılabilen ve izole edilebilen dizilere (fare satellit DNA’sı, viral DNA, ribozomal RNA vb.) uygulanabiliyordu. IN SiTU HIBRIDIZASYON • Nükleik asitlerin moleküler klonlaması ve radyoaktif işaretleme tekniklerindeki gelişmeler bu tabloyu önemli derecede değiştirdi. • Öte yandan, radyoaktif olmayan işaretleyici ile hazırlanmış nükleik asit problarının ISH’da kullanılması radyoaktif yöntemin getirdiği zorlukları ortadan kaldırdı. • Radyoaktif olmayan ISH ilk kez 1970’lerin sonunda uygulandı (Rudkin ve Stollar, 1977; Bauman ve ark., 1980). O günden beri radyoaktif olmayan in situ hibridizasyonun (NISH) biyomedikal araştırmalarda ve klinik tanıdaki uygulamaları büyük bir hız kazanmıştır. IN SiTU HIBRIDIZASYON • Son yıllarda nükleik asitleri işaretlemek için birçok yöntem geliştirilmiştir. Günümüzde, biotin, digoksigenin, dinitrofenil veya fluorokromlarla enzimatik olarak işaretleme genellikle tercih edilmektedir. Piyasada çeşitli prob işaretleme kitlerinin bulunması, bu işlemleri oldukça kolaylaştırmıştır. • Rekombinant DNA preparasyonları ile birlikte saf prob elde edilmesi sorunu çözülmüştür. Prob seçimine bağlı olarak, belirli genom ve kromozomlar, tekrarlanan DNA dizileri, tek kopyalı diziler, mRNA ve viral diziler gibi farklı hedefler saptanabilmektedir. IN SiTU HIBRIDIZASYON • Çeşitli sitokimyasal saptama yöntemlerinin geliştirilmesi de ISH tekniğinin başarısını arttırmıştır. Birden fazla prob işaretleme ve saptama yönteminin birlikte kullanılması aynı hücre preparatında iki veya daha çok nükleik asit dizisinin farklı renklerde gösterilmesini sağlamıştır. • Ayrıca radyoaktif olmayan ISH ile immünositokimyasal yöntemin birlikte kullanılması gen topografisi ile gen aktivitesi arasındaki ilişkinin DNA, mRNA ve protein düzeyinde ortaya konulmasına olanak vermiştir. Yöntemin Uygulanması • Problar hazırlandıktan sonra hibridizasyon için istenilen DNA parçası açısından taranacak DNA, eğer plazmid DNA’sı ya da genomik DNA gibi kompleks özellikte ise önce bir restriksiyon endonükleaz enzimi ile kesilerek daha küçük parçalara bölünmelidir. • DNA parçaları, agaroz jel elektroforezi ile birbirinden ayrıldıktan sonra nitroselüloz membrana aktarılır. • Daha sonra da hazırlanan DIG işaretli probla hibridizasyona bırakılır. • Probla nitroselüloz membran üzerindeki DNA parçalarından tamamlayıcısı olan arasında H bağları oluşumu ile çift zincirli DNA parçası meydana gelir. • Bundan sonraki aşamada prob ile hibritlenmiş DNA parçasının belirlenmesi gerekir. Yöntemin Uygulanması • Bir hapten olduğu daha önce belirtilen digoksigenine karşı özgül digoksigenin antikoru, alkalin fosfataz enzimi ile bağlı olarak bulunur. • Hibridizasyon işleminin ardından ortama eklenen antidigoksigenin (digoksigenin antikoru), probların yapısında bulunan dUTP’lere bağlı digoksigenin ile bir antijen-­‐antikor kompleksi oluşturur. • Bu kompleksin oluşumunu takiben ortama katılan ve alkalin fosfataz enziminin substratları olan ‘nitroblue tetrazolium’ tuzu (NBT) ve 5-­‐bromo-­‐4-­‐kloro-­‐3-­‐indolil fosfat (X-­‐fosfat) varlığında enzim aktivite gösterir. • Sonuçta mavi renkli bir ürün oluşumu sayesinde istenilen DNA parçası belirlenmiş olur. ISH • FISH (Floresanlanmış nükleotid analoglarının direkt ve indirekt ISH (In Situ Hibridizasyon) yöntemlerinde kullanılması (1991), • GISH (Genomik İn situ Hibridizasyon) • CGH (Komparatif Genomik Hibridizasyon) • CISH (Kromogenik in situ hibridizasyon) FISH (Floresan In Situ Hibridizasyon) • Moleküler sito-­‐genetikteki hızlı ilerlemeler, bantlama ve boyama tekniklerinin hızlı gelişimiyle sağlanmıştır. • Standart bantlama teknikleri yalnızca bir denemede bir hücre için tüm genomu sorgulamada yetersiz kalmaktayken, Fluoresan in situ hibridizasyon (FISH), genleri ve kromozomları boyamada fluoresan moleküllerin kullanıldığı bir yöntem olarak bantlama teknikleriyle birlikte iyi bir değerlendirme aracıdır. A) Tanısal amaçlı kullanılan FISH 1. Klinik sitogenetik a. Prenatal tanı b. İnterfaz sitogenetiği c. Mikrodelesyon sendromlarının tanısı d. Kanser sitogenetiği 2. Dokuda enfeksiyon ajanlarının tanısı 3. Dokuda mRNA düzeyinde onkogenlerin değerlendirilmesi B) Araştırma amaçlı FISH 1. Gen haritalaması 2. Tümör biyolojisi 3. Mikrobiyoloji/viroloji 4. Gen ekspresyon analizi 5. Somatik hücre hibrit analizleri 6. Mayoz/mitoz analizleri 7. Hücre tanımlaması FISH FISH • FISH, Southern blot tekniğinin analogudur. • FISH, fluoresan işaretlerle etiketlenen, tamamlayıcı DNA’ya, bu DNA dizilerinin yerleşimini görebilmek için hibridizasyona uğrayan veya bağlanan tek zincirli DNA (prob) kısa dizilerini gerektiren bir yöntemdir. • Floresan in situ hibridizasyon çoklu, sayı, yapı ve mikrodelesyon gibi kromozom anomalilerini saptamak için kullanılan bir metodtur. Üstünlükleri • Sonuca hızlı ulaşılır. • Bütün doku tiplerine uygulanabilir (kan, ilik vb.) • Standart sitogenetik metodlarla saptanamayan delesyonları saptar. Olumsuz yönleri • Standart G-­‐bantlama çalışmalarının yerine geçemez, fakat yanında kullanılabilir. • Tüm kromozom için iyi olmasına rağ men sadece birkaç kromozomal segmentle sınırlıdır. • Kromozomların çalışılmasında kullanılan birçok teknik, aktif olarak bölünen hücreleri gerektirirken (metafaz kromozomları), FISH aynı zamanda bölünmeyen hücrelere de uygulanabilir (interfaz nukleusu). • Metafaz delesyonları belirlemede kullanılır. • Interfaz genelde kromozomların yeniden düzenlenmesinin ve kromozom sayılarının belirlenmesinde kullanılır. Bu teknolojide ilk aşama; floresan özelliği taşıyan bir kimyasalın spesifik DNA dizilerini tanıyabilecek bir molekülle (prob) bağlanmasıdır. Kromozoma bağlı olan işaretli DNA probu kromozomlar UV ışığa maruz bırakıldıklarında ışıma yaparlar. Eğer probda floresan ışıma olursa gen mevcuttur, floresan ışıma yok ise delesyona uğramıştır. Her prob kromozomun belli bir bölgesine ö zeldir ve floresan molekülle işaretlenmiştir. Her mikroskop lamı birçok metafaz içerir. Her metafaz kromozomun tam bir setinden oluşur ve bu setin küçuk̈ bir segmenti her bir prob tarafından aranır ve prob buraya baglanır. Prob hazırlama FISH • Lokusa özgü olan problar bir kromozomun belirli bölgeleriyle hibridizasyona girer. Bu tip problar ilgilenilen belirli bir genin hangi kromozom üzerinde yerleşmiş olduğunu belirlemede kullanılır. • Alfoid veya sentromerik tekrarlı problar, kromozomların sentromerlerinde bulunan tekrarlayan dizilerden elde edilir. Kromozomlar farklı renklerde boyanabildiği için, bu prob herhangi bir bireyin doğru sayıda kromozoma sahip olup olmadığının belirlenmesinde kullanılır. FISH • “ Whole chromosome ” probları, herbiri tüm bir kromozom boyunca farklı dizilerle hibridizasyona girebilen küçük probların kolleksiyonudur. Bu şekildeki bir prob kitaplığı taranarak tüm bir kromozom spektral bir karyotip oluşturmak üzere boyanabilir. Bu teknik kromozomal translokasyonların tanımlanmasında imkan sağlar. • FISH ile sitogenetik çalışmalara yardımcı olan ve iyi tanımlanmış uygulamalar geliştirilmiş olmasına rağmen, amaca uygun prob ve filtre seçimi doğru yapılmaz ise hatalı ve zaman alıcı denemeler ortaya çıkmaktadır. FISH-­‐ Uygulama • İlk aşama çift iplikli kromozom DNA’sını ve prob DNA’sını denatüre etmektir. • Böylece prob ve kromozom DNA’sı birbirine bağlanabilirler. • Bu iş lem DNA’nın yüksek sıcaklıkta ısınmasıyla gerçekleşir. FISH-­‐ Uygulama Prop lam üzerine konulduktan sonra üstüne buharlaşmayı engellemek için lamel örtülür ve lamelin kenarlari iyice kapatılır. Lamel 37oC lik inkübatöre koyulur ve bir gece boyunca bekletilir. Böylece prob hedef kromozomla hibridize olur. Gece boyunca prob DNA spesifik kromozom üzerinde hedef diziyi arar ve ona yapışır. FISH Prosedür • Metafaz kromozomları veya interfaz nukleusu kullanılarak preparatların hazırlanması • Etanol içinde dehidrasyon • DNA’yı 70oC’de denatüre etme • Etiketli probun denatürasyonu • Hibridizasyon için 37oC ’ de, 4-­‐16 saat inkübasyon FISH •FISH metodunu temel alan bazı uygulamalar geliştirilmiştir. • Multicolour-­‐FISH 1. Spectral Karyotyping 2. Multiplex FISH 3. Combined binary ratio FISH (COBRA-­‐FISH) • Cross-­‐species colour FISH (R x FISH) • Comparative Genomic Hibridizasyon • Kromozom ve Lokus Spesifik FISH FISH • Spektral Karyotipleme – Herbiri 5 florokromun farklı kombinasyonlarıyla hazırlanmış probların 24 kromozomla hibridizasyonu ve tek bir filtreye sahip flüoresans mikroskobu ile analizine dayalıdır. – Kansere neden olan genomik değişikliklerin standart bantlama yöntemlerinden daha iyi anlaşılmasını sağlar. FISH • M-­‐FISH (Multicolor FISH) –5 florokromun çeşitli kombinasyonlarıyla hazırlanmış probların hibridizasyonu ve farklı flouresans sinyalleri ile analizine dayalı bir yöntemdir. • COBRA-­‐FISH FISH – Diğer FISH yöntemlerine benzer. Ancak 4 florokrom kullanılır. 24 kromozomun 12si bir gruba diğer 12si diğer gruba ayrılır. İlk grup 3 florokromla hibridleştirilirken, 2. gruba ek olara dördüncü florokrom uygulanır. – Bu metod, 5. florokrom için, kollara özgü boyama veya M-­‐ FISH ile locus-­‐specific proba geçiş için kullanılmıştır. • R x FISH – Gibbon kromozomlarının prob olarak kullanılır. Gibbon ve insan kromozomlarının homolojisi yaklaşık % 98 dir. – RxFISH ile yalnızca kromozom arası parça değişimleri değil, aynı zamanda kormozom içi değişimler de belirlenebilmektedir. (delesyon, inversiyon). G-­‐bantlama tekniği ile birlikte kullanıldığında 400 kat daha hassas sonuçlar vermektedir. GISH (Genomik in situ Hibridizasyon) • Türler arası hibritlerde, parental genomların ayrılmasına olanak tanıyan genomik boyama tekniğidir. • Uygulama alanı genellikle hibritlerdeki ebeveynlerin kromozom analizidir. • Başarılı çaprazların belirlenmesi açısından çok önemlidir. GISH (Genomik in situ Hibridizasyon) Temeli CGH (Karşılaştırmalı Genomik Hibiridizasyon) -­‐ Genom boyunca tüm kromozomları, DNA dizisindeki kopya sayısı değişimlerini, DNA kayıplarını, amplifikasyonlarını yada DNA miktarındaki değişiklikleri karşılaştırılmalı olarak inceleyen floresan moleküler sitogenetik bir tekniktir. -­‐ Bu teknik, kazanım (duplikasyon, insersiyon veya amplifikasyon) veya net kayıp (materyalde delesyon) gibi kromozom anomalilerinin sınıflandırılmasına olanak sağlar. Yalancı-­‐negatif ve yalancı-­‐pozitif sonuç verme olasılığının FISH tekniğinden çok daha düşük olması nedeniyle çok daha güvenilirdir. örn; embriyolarda-­‐ gebelik kusurlarında CGH Yöntemin avantajları: -­‐ Temel avantaj DNA örneklerinin kullanılarak tüm genomun tek bir deneyde görüntülenebilmesi -­‐ iki renkli görüntüleme sistemi kullanılması sonucunda kromozom anomalilerinin daha güvenilir saptanması -­‐ Az miktarlarda DNA örneğinin yeterli olması -­‐ Test örneği için metafaz kromozomları gerekli değil -­‐ Katı tümörlerin çalışılmasında da elverişlidir. CGH • CGH niceliksel 2 renk floresan in situ hibridizasyonuna dayanır. Eşit miktardaki farklı işaretlenmiş tumör genomik DNA ve normal referans DNA’sı karıştırılır ve hibridize edilir. Işaretlenmiş problar iki farklı floresan ile belirlenir. • Referans metafaz alanındaki kromozomlar boyunca floresan yoğunluklarındaki farklılıklar, tumor DNA’daki kopya numara değişikliklerine karşılık gelir. • Tek bir deneyde tüm genomları analiz edebilir. • Özellikle Sitogenetik analiz için yeterli metafaz vermeyen tümörlerin incelenmesi iç in kullanılabilir ve donmuş veya taze dokulara uygulanabilir. CGH (Karşılaştırmalı Genomik Hibiridizasyon) CISH (Kromogenik in situ hibridizasyon ) • CISH pratik, etkili ve FISH’a alternatif bir metottur. • FISH ile karşılaştırıldığında üç önemli avantajı vardır: 1) Parafin bölgelerin histolojik ayrıntıları aydınlık alanda genellikle daha iyi gözlenir. 2) Morfolojik ayrıntılar düşük güçlü mercekle kolaylıkla görülebilir. 3) Prob sinyalleri hızlı solmazlar.
