Restriksiyon Endonükleazlar

Restriksiyon Endonükleazlar
Restriksiyon endonükleaz (RE) enzimleri, kısa DNA dizilimlerini özgül olarak tanıyan
ve bu dizilimlere yakın bölgelerden veya bu dizilimler içindeki spesifik bölgelerden DNA’yı
kesen enzimlerdir. Bu dizilere palindromik diziler adı verilir. RE’ların doğal biyolojik
fonksiyonu, bakteriyel savunma mekanizmasında oynadıkları roldür. Bakteriye giren yabancı
DNA’ları da kesebildiklerinden, intraselüler bakteriyel patojenleri inaktive edebilmekte ve
bakteriyi virüslerden ve yabancı DNA’lardan korumaktadırlar. Mikroorganizmalar kendi
RE’larının kendi DNA’larını kesmemesi için çeşitli modifikasyonlar kullanmaktadırlar
(Metilasyon v.b.).
RE’ lerin isimlendirmesinde önce enzimin elde edildiği bakteri cinsinin ilk harfi, daha
sonra bakteri türünün ilk iki harfi ve son olarak da soya ait bir harf ile ilk izolasyondan
başlayarak Romen rakamı ile enzimin izolasyon sırası belirtilir. Örneğin EcoRI enzimi için;
E = cins (Escherichia)
co = tür (coli)
R = suş (RY 13)
I = Bu mikroorganizmadan izole edilen ilk RE olduğunu belirtir.
Endonükleazın kesme özelliği küt yada yapışkan uçlar meydana getirir. Örneğin EcoRI
enzimi DNA’yı (5’......GAATTC......3’) (3’.....CTTAAG......5’) dizilerinde G ile A arasından
keser ve iki yapışkan uç oluşturur. Aynı şekilde BamHI enzimi (5’....GGATCC.....3’)
(3’....CCTAGG....5’) dizisindeki 2 Guanin bazı arasından keser ve iki yapışkan uç oluşturur.
SmaI enzimi ise DNA’yı (5’......CCCGGG......3’) (3’.....GGGCCC......5’) dizilerinde C ve G
arasından keser ve küt uç oluşumuna sebep olur.
Reaksiyon şartları
pH: Pek çok RE pH 7.2 -8.5 arasında aktiftir.
Mn+2 : Ticari olarak mevcut RE’ler kofaktör olarak yalnızca Mg +2’ye ihtiyaç duymaktadır.
Reaksiyon şartlarında özellikle Mn+2 varlığı enzimin star aktivitesini ortaya çıkarmaktadır.
Tuz konsantrasyonu: RE’lerin pek çoğu 50-150 mM NaCl ya da KCl ortamında kesim
yaparken bazı enzimler için 20 mM’dan fazla tuz konsantrasyonu enzimin etkinliğini ortadan
kaldırmaktadır.
Bovin serum albumin (BSA): Enzimin stabilitesini sağlamak amacıyla saklama ve çalışma
tamponu içerisinde BSA bulundurulmaktadır. BSA ile enzim; proteaz, spesifik olmayan
adsorbsiyon ve ısı gibi çevresel zararlardan korunmaktadır.
Gliserol: RE’ler – 20°C’de saklanırken saklama tamponu içerisine gliserol katılmaktadır. Bu
tedbir enzimin donmasını engellemektedir. Böylece enzimin dondurulup çözdürülmesi
esnasında göreceği zarar azaltılmaktadır. Pek çok enzim için son konsantrasyonda %5’ten
fazla gliserol, enzimin star aktivitesine sebep olmaktadır. Ancak, bazı enzimlerin %10 gibi
yüksek gliserol konsantrasyonunda da normal kesim yaptıkları ortaya konmuştur.
İnkübasyon ısısı: Pek çok RE maksimum aktivitesini 37°C’de göstermektedir. Genel olarak
bu enzimlerin inkübasyon ısıları orijin aldıkları bakterinin üreme özelliklerini yansıtmaktadır.
Bu nedenle enzimlerin farklı ısı ihtiyaçları bulunmaktadır.
DNA konsantrasyonu: Substrat olarak kullanılan DNA’nın miktarı RE kesimini
etkilemektedir. Az bir hacim içinde çok miktarda DNA bulunması, enzimin difuzyonunu
engellemekte ve etkinliğini büyük ölçüde düşürmektedir. Oldukça düşük DNA
konsantrasyonları da enzim tarafından kesimin verimini etkilemektedir.
Restriksiyon endonükleazların özellikleri üzerine yapılan çalışmalar, bunların çok ilginç
özelliklere sahip olduklarını ortaya koymuştur. Özelliklerin en dikkate değer olanı, bu
enzimlerin optimal şartlarda özgül DNA’yı en yakın dizilimden ayırt edebilme başarılarının,
optimal olmayan şartlarda oldukça değişmesidir. Örneğin, EcoRI enziminin tanıma bölgesi
(5’-GAATTC-3’)’ne bağlanma oranı en yakın tanıma bölgesi (5’-TAATTC)’ne kıyasla 105
kat daha fazladır. Ancak, enzim için optimal olmayan şartlar altında oran oldukça değişmekte
ve pek çok enzim için bu durum söz konusu olmaktadır. Benzer bölgeleri kesme işlemine, bir
enzimin star aktivitesi denilmektedir. Bu durum moleküler biyoloji çalışmalarında oldukça
önemli olmakta ve çalışmanın başarısında belirleyici konuma yükselebilmektedir. Bu nedenle
kullanılan enzimlerin star aktiviteye sahip olup olmadıkları bilinmelidir.
RESTRİKSİYON ENDONÜKLEAZLAR NERELERDE KULLANILIR?






DNA haritası çıkartılmasında
Popülasyon polimorfizminin analizinde
DNA molekülünün yeniden düzenlenmesinde
Probların hazırlanmasında
Mutant organizmaların meydana getirilmesinde
DNA’nın modifikasyon statülerinin analizinde
Örnek çalışma:
Bu çalışmada pHT315 plazmiti (6.5 kb) üzerine Bacillus thuringiensis’e ait ppx ve
ppk genleri klonlanmaya çalışılmıştır. Klonlama çalışmasının doğrulanması için elde edilen
mutant plazmit RE’ler ile kesilmiştir. pHT315 plazmitine genler için kesim bölgeleri ve
kesim sonucunda beklenen DNA büyüklükleri aşağıda belirtilmiştir.
ppx
ppk
Plazmitin SacI, HindIII ve EcoRI restriksiyon enzimleri ile
kesim sonucu.
Kuyular:
Kuyu 1: SacI kesim sonucu
Kuyu 2: HindIII kesim sonucu
Kuyu 3: EcoRI kesim sonucu
Kuyu 4: Belirteç (1 kb DNA Ladder, Fermentas)
Kaynaklar:
1) http://yunus.hacettepe.edu.tr/~mergen/sunu/s_restrictions.pdf
2) http://web.inonu.edu.tr/~iozerol/rdurmaz/UygMolMikr/109.pdf