Microsoft PowerPoint - 5 HIZLI Y\326NTEMLER III.pptx

Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
1
HIZLI YÖNTEMLER (III)
Doç.
Doç. Dr. Serap COŞANSU AKDEMİR
2
MOLEKÜLER GENETİK YÖNTEMLER
• Gıda kaynaklı patojenlerin tanımlanmasında
ve karakterizasyonunda fenotipik yöntemler
halen yaygın olarak kullanılmakla birlikte, son
yıllarda genetik yöntemlere olan eğilim
artmıştır.
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
1
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
3
4
• Bakteriyel ribozom (70S) 3 farklı rRNA fraksiyonu içerir: 5S, 16S ve
23S
• 5S: 120 nükleotid
• 16S: 1500 nükleotid
• 23S: 3000 nükleotid
• Bunlardan 16S rRNA bakterilerin tanımlanmasında kullanılır.
• Bakteri hücresinden 16S rRNA’yı ekstrakte etmek ve ampilifiye etmek
(çoğaltmak) nispeten kolay…
• 1 g yaş ağırlığa sahip hücre kitlesinde DNase enzimi ile DNA
parçalandıktan sonra, ticari kitler kullanılarak RNA ekstrakte edilebilir.
Ortama nükleotid primerleri, revers transkriptaz (RT) ve
deoksiribonükletid ilave edildiğinde RT rRNA şablonunu okur ve
şablona göre DNA kopyalarını (cDNA) oluşturur. Bir seri
manupulasyondan sonra orijinal 16S rRNA sekansı ortaya çıkarılabilir.
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
2
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
5
Nükleik Asit (DNA) Probları
• Bir DNA probu, hedef mikroorganizmadan elde edilmiş ve
homolog DNA veya RNA sekanslarını belirlemeye yarayan
DNA sekansından oluşur. Buna göre, prob DNA aranan
mikroorganizmanın DNA’sı ile hibridize olabilmelidir.
• Hibridizasyonun gerçekleşip gerçekleşmediğini ortaya
çıkarmak için prob DNA işaretlenir.
• İşaretleme için radyoizotoplar kullanılabilir:
32P, 3H, 125I
ve 14C
6
• Kromozomal DNA sıklıkla hedef nükleik asidin
kaynağıdır, ancak çoğu durumda hücre içinde
tektir. Bu nedenle mRNA, rRNA veya plazmid
DNA’sı gibi çoklu hedefler tercih edilir. Böylece
yöntemin hassasiyeti artar.
• Sentetik oligonükleotid probları 20-50 bazdan
oluşur ve hibridizasyon 30-60 dk’da gerçekleşir.
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
3
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
7
İşlem:
1. Restriksiyon endonükleaz ile bilinmeyen
organizmanın DNA fragmentlerinin oluşturulması
2. Fragmentlerin elektroforez ile ayrılması ve
nitroselüloz filtrelere aktarılması.
3. İşaretlenmiş problarla hibridizasyon
4. Reaksiyona girmeyen probların uzaklaştırılması için
yıkama ve hibridizasyonun otoradyografi ile tespiti
8
• Standart bir probla belirlenebilecek minimum
bakteri hücresi sayısı 106-107, ancak bazı
araştırıcılar 104 adet bakteri hücresini
belirleyebilmişler…
• Gıda örneğinde patojen bakterilerin
belirlenmesinde sayı çok düşük (1 kob/ml)
olabileceğinden mutlaka zenginleştirme
yapılmalı.
• Başlangıç hücre sayısı 108 olduğunda 10-12
saat sonunda sonuç alınabilir.
• Zenginleştirme gerekli olduğunda toplam süre
en az 44 saat
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
4
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
9
Digoksigenin ile işaretlenmiş prob kullanılarak 48 saatte
çiğ et örneğindeki ≤10 kob/g düzeyindeki enterotoksijenik
C. perfringens belirlenebilmiş…
L. monocytogenes’in süt, et ve su ürünlerinde aramasında
kolorimetrik DNA probu ile FDA’in yöntemi
karşılaştırılmış… 660 süt ve su ürünü örneğinin 354’ünde
FDA’in yöntemi ile patojen belirlenmiş, buna karşın prob
ile 393 örnek pozitif sonuç vermiş… 540 et örneğinin 261’i
FDA’in yöntemi ile, 378’i ise DNA probla pozitif bulundu.
Prob 48 saat içinde sonuç verirken, FDA/USDA’in metodu
ile sonuç almak için 3-4 gün gerekli…
10
• Salmonella spp. için geliştirilen kolorimetrik prob 110
serotipin tamamını tanımlamış, 61 Salmonella olmayan
izolatın hiçbirinde sahte-pozitif sonuç vermemiştir.
• Salmonella için geliştirişmiş radyoizotopla işaretlenmiş
prob 269 kanatlı karkası ve su örneğinde test edilmiştir. İki
kez zenginleştirme uygulandıktan sonra 0,03 hücre/ml
kadar düşük sayıdaki Salmonella belirlenebilmiştir. Prob
ml’de ~104 kadar az sayıdaki hücreyi saptayabilir.
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
5
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
11
• DNA probları koloni hibridizasyon tekniklerinde de
kullanılır.
• Koloni hibridizasyon tekniğinde hedef mikroorganizma
uygun bir katı besiyerinde inkübe edildikten sonra
mikrokolonilerin direkt olarak bir membran üzerinde
oluşması sağlanır. Asıl petri veya membran ile eş zamanlı
kopyası hazırlanır.
12
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
6
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
13
Kolonilerin oluştuğu petri kutusu üzerine
nitroselüloz disk yerleştirilir ve belirli süre
inkübe edilir. Böylece kolonilerin disk
üzerine kopyası çıkarılmış olur. Disk
petriden ayrılır ve sırasıyla şu işlemler
yapılır:
a) NaOH ilave edilerek bakterilerin lize
olması ve DNA’nın hücre dışına
çıkması sağlanır.
b) NaOH nötralize edilir.
c) Proteinleri uzaklaştırmak için proteaz
ilave edilir.
d) Membran yıkanır.
e) DNA’yı membrana sabitlemek için
80oC’ye ısıtılır.
f) Membran üzerindeki DNA radyoaktif
prob ile uygun koşullar altında hibridize
edilir.
g) Membran yıkanarak hibridize olmamış
problar uzaklaştırılır.
h) Membran x-ray film üzerine konur. Xray film üzerine bir veya daha fazla
leke oluşması orada hibridizasyon
olduğunu, dolayısıyla hedef bakteriyi
işaret eder.
14
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
• Moleküler genetik yöntemler içinde gıdalardaki bakteri ve
virüsleri tespit etme ve tanımlamada en fazla kullanılan
yöntemdir.
• Çünkü;
• Yüksek hassasiyet
• Yüksek spesifiklik
• Ticari kitler halinde kolaylıkla ulaşılabilir olması vs…
• İlk kez 1971 yılında Kleppe ve ark. tarafından ortaya konmuş…
• Şu an kullanılmakta olan yöntem Perkin Elmer-Cetus Corp.’da
çalışan bilim adamları tarafından geliştirilmiş.
• PCR yöntemine katkılarından dolayı K.B. Mullis 1993 yılında
kimya dalında Nobel Ödülüne ortak olmuş…
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
7
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
15
PCR yöntemi genel olarak şu şekilde
uygulanır:
• Başlangıç materyali dsDNA (double strand DNA) ise tek
sarmal DNA elde etmek için 95oC’ye ısıtılır. Başlangıç
materyali RNA ise (örneğin virüs genomu) önce revers
transkriptaz (RT-PCR) kullanılarak dsDNA’ya
dönüştürülür. DNA zincirlerini ayırmak için ısıttıktan sonra
oligonükleotid primerleri varlığında 55oC’ye soğutulur.
Böylece soğutma sırasında tekrar dsDNA oluşur. Ortama
DNA polimerazla birlikte dATP, dCTP, dTTP, dGTP ilave
edilir (d: deoksinükleotid). Bunlar DNA sentezinin ön
maddeleridir. Bu işlem tekrar edildiğinde 2 zincir 4, 4 zincir
8, vs olur. Yeterince tekrarlanırsa başlangıçtaki DNA’nın
birkaç milyon kopyası elde edilebilir.
16
• Primerler genellikle kısa oligonükleotidlerdir. 20-30
nükleotid uzunluğunda olup baz dizilimi hedef DNA
bölgesinin son kısmı ile uyumludur.
• Amplifikasyon çok sayıda döngüden oluşur. Her bir döngü
sırasında çift sarmal DNA ısıtılarak denatüre edilir yani tek
sarmala dönüşür. Daha sonra reaksiyon karışımı
soğutularak primerlerin tek sarmal DNA’lara bağlanması
sağlanır. Böylece termostabil DNA-polimerazın
bağlanabileceği aktif bölgeler oluşur. DNA-polimerazın
çalışmasıyla tekrar çift sarmal DNA meydana gelir. Bir
sonraki döngüde primerler hem orijinal hem de yeni
üretilen DNA zincirine bağlanır. Böylece DNA kopyalarının
sayısı logaritmik olarak artar.
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
8
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
17
• BAX system
• Probelia
• Foodproof
18
Multiplex PCR (MPCR)
• Birden fazla mikroorganizmanın tek bir reaksiyonla hızlı
bir şekilde belirlenmesine olanak sağlar.
• MPCR, çoklu virülens faktörlerin tanımlanmasında ve çok
sayıda izolatın aynı anda tanımlanmasında kullanılabilir.
• MPCR’nin ticari şekli GeneDisc®
• Uygulanması kolay
• Birkaç saat içinde sonuç alınabilir
• Gıda endüstrisinde gıda kaynaklı patojenler belirlenebilir.
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
9
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
19
GeneDisc
• Sistem üç birimden oluşur:
• GeneDisc DNA Ekstraktörü
• GeneDisc Plate (Üzerindeki
kuyucuklarda anahtar nitelikteki
iki reaktif primer ve prob
kullanıma hazır halde bulunur.)
• GeneDisc Cycler: Testi yapar ve
sonuçları kaydeder.
20
Sistem nasıl çalışır?
• GeneDisc DNA ekstraktörü örneği analize hazırlamak için
kullanılır. 4 temel aşamadan oluşur: filtrasyon, sonikasyon,
ısıtma, DNA saflaştırma
• GeneDisc Plate yaklaşık aynı çaptaki üst üste konmuş DVD’ye
benzer bir aparattır. Üstteki diskin orta kısmında 6, 9 veya 12
bölme içeren bir oyuk yer alır. Alttaki diskte ise 36 kuyucuk ve
mikrokanal bulunur. Her bir bölme sırasıyla 6, 4 veya 3
kuyucuğa mikrokanallarla bağlıdır. Buna göre aynı anda 6, 9
veya 12 örnek test edilebilir. Reaktiflerin kuyucuklara
yerleştirilmiş olması taşımada kolaylık sağlar. Oda sıcaklığı
veya 4oC’de nakliye edilebilir, çoğu zaman olduğu gibi -20oC
veya daha düşük sıcaklık gerektirmez. Her bir bölmede bir
negatif kontrol ve bir pozitif kontrol kuyucuğu yer alır. Böylece
test sonucunun geçerliliğinden emin olunur.
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
10
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
21
22
Fluoresan in situ hibridizasyon (FISH)
• Ribozomal RNA’yı hedef alan FISH PCR-olmayan moleküler
teknikler içinde en çok kullanılanıdır. DNA yerine RNA’yı hedef
almak hem yöntemi duyarlı hale getirir, hem de canlı hücreleri
belirlemeye olanak sağlar.
• Bu yöntemde hücreler kimyasal bağlayıcılar ile muamele edilir
ve uygun koşullar altında cam üzerinde veya oligonükleotid
prob içeren sıvı ortamda hibridize edilir.
• Genellikle problar 15-25 nükleotid uzunluğunda olup 5’
ucundan kolvalent olarak floresan boya ile etiketlenir.
Bağlanmayan probu uzaklaştırmak için yıkadıktan sonra
boyanan hücreler epifloresan mikroskop ile belirlenir.
• Teşhis limiti yaklaşık 104 kob/ml’dir. Yaklaşık bir gecelik
zenginleştirme işlemi ile bu seviyeye ulaşılır.
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
11
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
23
24
Mikroarray teknolojisi
• Basit bir mikroarray bilinen farklı bakteri türlerinden elde
edilmiş tek sarmal DNA (ss-DNA) parçacıklarının
tutturulduğu katı bir yüzeyden oluşur. Katı yüzey naylon
membran, cam slayt veya silikon çip olabilir.
• Bilinmeyen yada tanımlanmak istenen DNA parçacıkları
mikroarraya maruz bırakılırsa çip üzerinde kendisine uyan
tek sarmal DNA zincirini tamamlayacaktır.
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
12
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
25
Mikroarray’ler nasıl üretilir ve nasıl çalışır?
• Mikroarray’lerin üretiminde çeşitli yöntemler
kullanılabilir: cam lamlar üzerine ince uçlu
iğnelerle baskı, önceden hazırlanmış maskelerle
fotolitografi, dinamik mikroayna cihazlarıyla
fotolitografi, ink-jet baskı, mikroelektrod
array’lerinde elektrokimya gibi...
• Temel olarak çiplerin hazırlanması iki şekilde
yapılabilir:
• Çip üzerinde oligonükleotid sentezi
• DNA’nın direkt olarak yüzeye bırakılması
26
Çip üzerinde oligonükleotid sentezi
(On-chip oligonucleotide synthesis)
• DNA ya da gen parçaları direkt olarak cam maddenin
üzerinde sentez edilir. Genellikle fotolitografi yöntemi
kullanılır.
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
13
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
27
28
DNA’nın direkt olarak yüzeye bırakılması
(Direct DNA deposition):
• Bu teknikte genomik DNA’nın parçaları fiziksel olarak cam
yüzeydeki yerlerine bırakılır. Yöntem Stanford
Üniversitesi’nden Pat Brown’un laboratuvarında
tasarlanmıştır.
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
14
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
29
• Stanford çiplerinin DNA
fragmentleri; genlerin PCR
amplifikasyonuyla elde edilip, cam
film üzerine robotic spotting
yöntemiyle kusursuz bir şekilde
yerleştirilmesiyle elde edilir.
• PCR ürünleri cam film üzerine
yaklaşık 2 cm2 bir alana
noktacıklar halinde yerleştirilir. Her
bir PCR ürününün yerleştirildiği
bölge ve içerdiği DNA dizisi kesin
olarak bellidir. Daha sonra slayt
üzerindeki DNA’ lar kurutulur
(100ºC de 2 sn ), sabitlenir (UV
cross-linking), ve denatüre
edilerek tek zincirli hale getirilir
(95º C de 2 dk). Hazırlanan çipler,
işaretlenmiş cDNA fragmentleriyle
bağlanmak üzere kullanılırlar.
30
Ice nucleation assay
• Bu yöntem prensip olarak lux
geninin hedef bakteriye özgü
faja aktarıldığı bakteriyel
biyolüminesans yöntemine
benzer.
• Gram-negatif bakteri cinslerinin
çoğu «ice nucleator» gibi
davranan bir proteinin sentezini
kodlayan «ina» geni içerir. Bu
geni içeren bakterilerden biri
Pseudomonas syringae olup
ina geni 3600 baz çiftinden
oluşur.
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
15
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
31
• Bu protein suyun normalden daha yüksek sıcaklıklarda
donmasına olanak sağlar. Yani normal koşullarda -6oC
veya daha düşük sıcaklık gerekirken -2oC’de su buza
dönüşebilir.
• Söz konusu ice nükleatörler yumurta akı, somon gibi
gıdalara uygulandığında hem donma süresi kısaltılmış
hem de enerji tasarrufu sağlanmıştır.
32
• Bakteriyel ice nükleasyon testi ilk kez Salmonella’yı belirlemek
için geliştirilmiştir.
• P. syringae’den elde edilen ina geni Salmonella’ya spesifik bir
faja aktarılır. Faj Salmonella varlığı araştırılan ortama ilave
edilir. Eğer Salmonella varsa faj tarafından edilecek ve faj
genleri bakteri genomu ile birlikte ifade edildiğinde dış
membranın bir parçası olarak ice nükleasyon proteini
sentezlenecektir. -9oC civarında buz kristallerinin oluşumu ile
Salmonella varlığını gösterir. Floresan özellikteki freeze
indikatör boya ilave edilirse yeşil renk buz kristallerini yani
Salmonella varlığını, turuncu renk ise negatif sonucu gösterir.
• Salmonella’nın P22 fajı ile 25 hücre/g düzeyindeki patojen 24 h
içinde belirlenebilmiştir.
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
16
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
33
Biyosensörler
• Biyosensörler, biyospesifik tanıma sistemlerinin fiziksel veya
elektrokimyasal sinyaller ile kombine edildiği analitik cihazlardır.
• Gıdalardaki patojenlerin belirlenmesinde kullanılan biyosesörler
enzim, antikor, antijen veya nükleik asit gibi biyolojik olarak aktif bir
materyal ile alınan sinyalleri dönüştüren bir birimden oluşur.
• Alınan sinyal hedef molekülün konsantrasyonu ile doğru orantılı olup
elektrik, optik veya termal bir sinyaldir.
34
• Biyosensörler analiz süresini kısaltmakla birlikte
kullanılabilirlikleri seçici ve hassas olmalarına bağlıdır.
• Otomatik ve minyatürize sistemlerdir. Örnek miktarı
nanolitre ile ifade edilir. Bu nedenle kullanılan reaktif
miktarı azalacağından maliyet düşer.
• Aynı anda çok sayıda örneğin analizine olanak
sağladığından zamandan tasarruf sağlar.
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
17
Mikrobiyolojik Kalite Kontrol Yöntemleri
05.05.2016
35
Doç. Dr. Serap Coşansu Akdemir
18