DİCLE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ DÖNEM I HÜCRE

DİCLE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ
DÖNEM I
HÜCRE BİLİMLERİ 2 KOMİTESİ
HÜCRE KÜLTÜRÜ ve TEKNOLOJİSİ
Doç.Dr. Engin DEVECİ
Hücre Kültürü Araştırma Laboratuvarı, çeşitli hücrelerin invitro kültürlerini yaparak
araştırmacılara kanser, kök hücre, hücre mekaniği çalışmaları gibi konularda hücre içi ve
hücreler arası biyokimyasal olayların moleküler düzeyde incelenebilmesi için devamlı olarak
hücrelerin temin edilmesi ve bu hücrelere istenilen deneysel uygulanmaların yapılması için
kurulmuştur.
Rahim ağzı kanseri hücreleri doku kültürü mikroskopik görüntüsü.
Hücre kültürü besiyerleri laboratuar ortamında hücrelerin normal metabolik aktivitelerini
sürdürebilmeleri için gerekli olan mikroçevreyi sağlayan besleyici solusyonlardır.
Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki aminoasit, karbonhidrat, vitamin ve iyonlarla
hücrelerin gelişimini desteklerler.Laboratuar ortamında hücrelerin çoğaltılabilmesi için uygun
pH sıcaklık ve nemin sağlanması çok önemlidir.
Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki iyonlarla gerekli ozmolarite ve pH’ı da sağlarlar
HÜCRE KÜLTÜRÜ





Hücre kültür ortamının hazırlanması ve içeriği
Beslenme
Pasajlama
Sayım
Dondurma
Katı (agarlı) besiyerinde sayım, canlı hücrelerin koloni oluşturması ve bu kolonilerin
sayılarak «her canlı hücre 1 koloni oluşturur» prensibi ile materyaldeki canlı hücre sayısının
hesaplanması esasına dayanır. Bu amaçla sayım yapılacak materyalden belirli bir miktar alınır
ve besiyerine aktarılır. Koloni oluşması için gerekli inkübasyon süresinin sonunda Petri
kutusundaki koloniler sayılarak materyaldeki canlı hücre sayısı hesaplanır. Ölü hücreler
üreyip koloni meydana getiremeyeceği için bu yöntemde sadece canlı hücreler sayılır.
Hücre Kültür ortamında kullanılan cihazlar
 Steril çalışma kabini
 CO2 inkübatörü yada CO2 tankı
 İnverted mikroskobu
 Santrifüj
 Vakum hattı yada pompası
 Otoklav
 Sıvı azot tankı
 Primer Kültürler;Doğrudan dokudan elde edilen hücre kültürleridir.Elde edildikleri
dokunun özelliklerini taşırlar
 Hücre Hatları;Primer hücrelerin spontan mutasyonu,kimyasal madde uygulanması ile
mutasyon oluşturularak elde edilen ölümsüz hücre tipleridir.
Besleme İşlemi
Ekimi yapılan hücrelerin yapışması beklendikten sonra besleme amacı ile ortam
değiştirir.Hücreler zemini kapladığında ise hücreler ya pasajlanır yada dondurulur.
Hücre Kültürlerinin Hazırlanması
A-Pasajlama (subkültür)
Hücrelerin pasajlanabilmesi için hücre kültür flakslarının yüzeyini kaplamış olmalıdır.Böyle
flakslara konfulent flakslar denir.Pasajlama işlemi hücreler sıkışık konumda olduğu için
yapılır.Ve daha geniş alana yayılır.Pasajlama işlemi besi ortamı içerisindeki hücrelerin
nutrientleri tüketmesinden dolayı üreme hızlarının düşmesini ölümlerini önlemek amacı ile
yapılır.
Pasajlama işlemi tutunarak çoğalan hücrelerde ve süspanse kültürlerde farklı yapılır:
Süspanse kültürlerde pasajlama yapılırken; kültür eşit şekilde santrifüj tüplerine dağıtılır ve
santrifüj edilerek kullanılmış besi ortamı atılır.Daha sonra uygun besi ortamıyla dilue edilerek
platelere ya da flasklara ekim yapılır. Bazı hücre türlerinin pasajlaması yapılırken kullanılmış
besi ortamından bir miktar tekrar besi ortamına eklenir.
B-Hücrelerin Dondurulması
 Hücre kültürünün uzun süre devam etmesi kontaminasyon ve üreme hızının düşüşü
gibi olumsuzluklara yol açar.Bunun önüne geçebilmek için hücreler dondurulur.
 Dondurma işleminin başarısı,çözdürme işleminin sonunda hücre canlılık oranının
yüksek olması ile orantılıdır
Dondurma Prosedürü
 Su banyosu 37C ye ısıtılır.
 Hücre besi ortamı ve serum su banyosunda 37 C ye ısıtılır
 Hücre Pasajlanması protokolünde belirtildiği
şekilde hücre pelleti elde edilir.
 Hücre pelleti, 1 ml dondurma ortamı
 içinde süspande edilir ve cryovial adı verilen tüplere konulur.Hücrelerin bulunduğu
tüpler dondurma kabına konulur ve -80C ‘de bir gece bekletilir.
 Ertesi gün sıvı azot tankına transfer edilir.
C- Hücrelerin çözülmesi
Başka laboratuardan gönderilmiş yada üzerinde yapılan çalışmaya daha sonra devam edilmek
üzere dondurulmuş olan hücre kültürleri,yeni kültürler üretilmesi amacı ile tekrar çözülürler
Kan lenfosit hücreleri için kültür süresi genellikle 72 saattir. Fibroblast kültür süresi
hücrelerin canlılık oranına, sayısına ve aktivasyonuna bağlı olarak değişmekte ortalama 10-12
gün veya daha uzun sürebilmektedir. Kan lenfosit kültürü için 37°C’lik etüv, fibroblast
kültürleri için 37°C, %5 CO2’li etüv ortamına gerek vardır. Kültürün son 2 saatinde hücreleri
mitoz aşamasında durdurmak için kültürlere kolsemid ilavesi yapılırFibroblast kültürlerinde
hücrelerin flask tabanında tutunarak çoğalmaları beklenir.Hücre kolonileri belirli bir
yoğunluğa ulaşana kadar kontrol edilir ve medium değişimleri yapılır.Yeterli hücre elde
edileceğine karar verildiğinde harvest işlemi başlatılır

Örnek materyalin (tümör dokusu, biyopsi materyali, kemik iliği, periferik kan, veya
“ascite”) laboratuara teslimi. 2. Materyalden enzimatik ve mekanik yollarla tümör
hücre süspansiyonunun elde edilmesi.
 3. Hücrelerin sayılması, 96 kuyucuklu plaklara (20.000 hücre/kuyucuk) ekimi ve
takibinde hücrelerin hekimin karar verdiği veya Karar Lab.ın her tümör tipi için
belirlenmiş ilaç panel listesindeki kemoterapötik ilaçların farmakokinetik verilere göre
belirlenmiş 6 farklı dozu ile hücre kültür ortamında muamele edilmesi