bazı bitki ekstraktlarının kanser hücrelerinde antioksidan

BAZI BİTKİ EKSTRAKTLARININ KANSER HÜCRELERİNDE
ANTİOKSİDAN, ANTİKANSEROJENİK VE APOPTOTİK ETKİSİNİN
BELİRLENMESİ
Özge TARANÇI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
BİYOLOJİ
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Ocak 2014
ANKARA
Özge TARANÇI tarafından hazırlanan “BAZI BİTKİ EKSTRAKTLARININ
KANSER
HÜCRELERİNDE
ANTİOKSİDAN,
ANTİKANSEROJENİK
VE
APOPTOTİK ETKİSİNİN BELİRLENMESİ” adlı bu tezin Yüksek Lisans tezi
olarak uygun olduğunu onaylarım.
Prof. Dr. Belma ASLIM
Tez Danışmanı, Biyoloji Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi
……………………..
Yrd. Doç. Dr. S. Selcen Babaoğlu AYDAŞ
Tez Danışmanı, Yaşlı Bakımı, Gazi Üniversitesi
……………………..
Bu çalışma, jürimiz tarafından oy birliği ile Biyoloji Anabilim Dalında Yüksek
Lisans tezi olarak kabul edilmiştir.
Prof. Dr. Belma ASLIM
Biyoloji Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi
……………………..
Yrd. Doç. Dr. S. Selcen Babaoğlu AYDAŞ
Tez Danışmanı, Yaşlı Bakımı, Gazi Üniversitesi
……………………..
Prof. Dr. Rahime ŞİMŞEK
Farmasötik Kimya Anabilim Dalı, Hacettepe Üniversitesi
……………………..
Prof. Dr. Şule Coşkun CEVHER
Biyoloji Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi
……………………..
Doç. Dr. Barbaros BALABANLI
Biyoloji Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesİ
……………………..
Tez Savunma Tarihi: 03.01.2014
Bu tez ile G.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Yüksek Lisans derecesini
onaylamıştır.
Prof. Dr. Şeref SAĞIROĞLU
Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü
……………………..
TEZ BİLDİRİMİ
Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde
edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu
çalışmada bana ait olmayan her türlü kaynağa eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm.
ÖZGE TARANÇI
iv
BAZI BİTKİ EKSTRAKTLARININ KANSER HÜCRELERİNDE
ANTİOKSİDAN, ANTİKANSEROJENİK VE APOPTOTİK ETKİSİNİN
BELİRLENMESİ
(Yüksek Lisans Tezi)
Özge TARANÇI
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Ocak 2014
ÖZET
Kanser tüm dünyada hızla büyümekte olan bir sağlık problemidir.
Epidemiyolojik kanıtlar bitkilerin, kanser sıklığının azaltılmasında ve kanser
kaynaklı ölümlerin önlenmesinde kullanılan ilaçların elde edilmesinde birincil
kaynaklar
olduğunu
doğrulamaktadır.
Çalışmada
endemik
Tanacetum
albipannosum Hub.-Mor. & Grierson ve Achillea sp. nova ve yaygın Centaurea
depressa Bieb. türlerinden elde edilen su ve metanol ekstraktları kullanılmıştır.
Ekstraktların 100, 250 ve 500 µg/mL konsantrasyonlarının kolorektal
adenokarsinoma hücre hatları HT-29 ve Caco-2, servikal kanser hücre hattı
HeLa üzerine antiproliferatif ve sağlıklı gingivial fibroblast hücre hattı HGF-1
üzerine sitotoksik etkisi araştırılmıştır. Konsantrasyon artışıyla birlikte
bitkilerin antiproliferatif etkisinin arttığı bulunmuştur. Bitki ekstraktlarının
hiçbir konsantrasyonu HGF-1 hücrelerine sitotoksik etki göstermemiştir. En iyi
antiproliferatif etki HeLa hücrelerinde, C. depressa metanol (500 µg/mL) ve HT29 hücrelerinde C. depressa su ekstraktında (500 µg/mL) bulunmuştur (p<0,05).
Metanol ve su ekstraktları ile muamele olan (250 ve 500 µg/mL) HT-29, Caco-2
ve HeLa hücrelerinin total antioksidan kapasitesi ve süperoksit dismutaz (SOD)
aktivitesi araştırılmıştır. Üç kanser hücresindeki total antioksidan kapasite
v
karşılaştırıldığında doz artışıyla birlikte sadece HT-29 hücresinde yüksek
antioksidan etki görülmüştür (p<0,05). HT-29 hücresine en yüksek antioksidan
etkiyi A. sp. nova metanol ekstraktı (500 µg/mL) göstermiştir. C. depressa ve T.
albipannosum, HeLa ve Caco-2 hücrelerine antioksidan etki göstermemiştir.
Kontrol grubuyla karşılaştırıldığında tüm bitkiler HeLa ve HT-29 hücrelerine
SOD aktivitesi göstermiş, Caco-2 hücrelerine SOD aktivitesi göstermemişlerdir.
HeLa hücrelerine A. sp. nova su ekstraktı (500 µg/mL), HT-29 hücrelerine T.
albipannosum su ekstraktıyla (500 µg/mL) yüksek SOD aktivitesi gösterdiği
belirlenmiştir (p<0,05). Metanol ve su ekstraktlarının (500 µg/mL) comet
yöntemiyle
lenfositler
incelenmiştir.
Bitki
üzerindeki
genotoksik
ekstraktlarının
ve
genotoksik
antigenotoksik
etkilerinin
etkisi
olmadığı
belirlenmiştir. En iyi antigenotoksik etki C. depressa su ekstraktından elde
edilmiştir (p<0,05). Bitkiler arasında en yüksek apoptotik etkiyi HT-29
hücrelerine A. sp. nova su ekstraktı (500 µg/mL) göstermiştir (p<0,05). Bitkiler
luteolin, biochanin A, rutin, kuersetin, kamferol, genistein, kateşin ve apigenin
flavonoidleri bakımından taranmıştır. Flavonoidler arasında rutin, kuersetin,
kamferol ve apigenin elde edilen değerler literatürlerle karşılaştırıldığında
yüksek bulunmuştur. Sonuç olarak çalışmada yaygın C. depressa ve endemik A.
sp. nova ve T. albipannosum türlerinin kullanılmış olması ve bu türlerle
antikanser çalışmalarının olmamasının, yeni bir antikanser ajanı bulma
açısından
bu
araştırmayı
önemli
kılacağı
düşünülmektedir.
Bu
bitki
ekstraktlarının antikanser etkilerinin yanı sıra antikanser mekanizmalarının da
ortaya konulması, daha etkin ve hedefe yönelik koruyucu ve tedavi edici ilaç
formülasyonlarının geliştirilmesini sağlayacaktır. Bu şekilde etki mekanizması
tam olarak ortaya konmuş bir ajanın, ilaç olarak kullanım oranı ve etkinliğini
daha fazla artırmak mümkün olabilecektir.
Bilim Kodu
: 203.1.023
Anahtar Kelimeler : Bitki, antiproliferatif, total antioksidan aktivite, süperoksit
dismutaz aktivite, antigenotoksisite, apoptoz
Sayfa Adedi
: 138
Tez Yöneticisi
: Prof. Dr. Belma ASLIM
vi
DETERMINATION OF ANTIOXIDANT, ANTICANCEROGENIC AND
APOPTOTIC EFFECT OF SOME PLANT EXTRACTS ON CANCER CELL
LINES
(M. Sc. Thesis)
Özge TARANCI
GAZİ UNIVERSITY
GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE
January 2014
ABSTRACT
Cancer is a serious health problem growing rapidly all over the world.
Epidemiological evidences confirm that plants are accepted as primary sources
because of their great effect on decreasing the incidence of cancer, prevention of
cancer deaths and their usage for drug improvement. In this study, water and
methanol extracts of endemic Tanacetum albipannosum Hub.-Mor. & Grierson
and Achillea sp. nova and common Centaurea depressa Bieb. were evaluated. We
investigated the antiproliferative effect of 100, 250 and 500 µg/ml extract
concentrations on colorectal adenocarcinoma cell lines HT-29, Caco-2 and
cervical cancer cell line HeLa and their cytotoxic effects on healthy gingivial
fibroblast cell line HGF-1. With increased concentration of plant extracts,
antiproliferative effects have been found to increase. None of the plant extracts
has cytotoxic effects on HGF-1 cells. The best antiproliferative effect was found
on HeLa cells with the C. depressa methanol (500 µg/mL) and on HT-29 cells
with the C. depressa water extract (500 µg/mL) (p<0.05). Total antioxidant
capacity and superoxide dismutase (SOD) activity of the methanol and water
extracts (250 and 500 µg/mL) on HT-29, Caco-2 and HeLa cells were also
vii
investigated. According to the data obtained from three cancer cells; plants
showed high total antioxidant effect in parallel with the increasing doses just on
HT-29 cells (p<0,05) A. sp. nova' s methanol extract (500 µg/mL) showed the
highest antioxidant effect on HT-29 cells. C. depressa and T. albipannosum
extracts didn’t show any antioxidant effect on HeLa and Caco-2 cells. All plant
extracts showed SOD activity on HeLa, and HT-29 cells as compared to the
control but no effect on Caco-2 cells. High SOD activities were; A. sp. nova’s
water extract (500 µg/mL) on HeLa cells, and T. albipannosum' s water extract
(500 µg/mL) on HT-29 cells (p<0.05). Antigenotoxic and genotoxic effects of
methanol and water extracts (500 µg/mL) on lymphocytes were examined with
comet assay. Extracts showed no genotoxic effect on lymphocytes. The best
antigenotoxic effect was obtained with C. depressa water extract (p<0.05).
Apoptotic effect of plant extracts on cancer cells was investigated. Water extract
(500 µg/mL) of A. sp. nova showed the highest apoptotic effect on HT - 29 cells
(p<0,05). Plants were scanned in terms of their flavonoids; apigenin, luteolin,
biochanin A, rutine, quercetin, kaempferol, genistein and catechin. High values
were obtained as compared with the literature; rutine, quercetin, kaempferol
and apigenin. In conclusion we used the common C. depressa and endemic A. sp.
nova and T. albipannosum species for the first time in terms of their
anticancerogenic effects. This makes the research unique because of the benefits
of finding a new anticancer agent. In addition the proof of these plant extracts
with their anticancer effects and the mechanism underlying will provide the
improvement of more effective, target focused, preventive and therapeutic
medicine formulations. In this way it would be possible to increase the usage
rate and efficiency of an agent whose mechanism of action is fully elucidated as
a medicament.
Science code : 203.1.023
Key words
: Plant, antiproliferative, total antioxidant activity, superoxide
dismutase aktivity, antigenotoxicity, apoptosis
Page number : 138
Adviser
: Prof. Dr. Belma ASLIM
viii
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans öğrenimim süresince ve tez çalışmamın her aşamasında engin bilgi ve
deneyimleriyle bana yol gösteren, her türlü araştırma olanağını ve desteğini sağlayan
değerli danışman hocalarım Sayın Prof. Dr. Belma ASLIM’a ve Sayın Yrd. Doç. Dr.
S. Selcen Babaoğlu AYDAŞ’a, tez çalışmalarımda kullanılan bitki materyallerinin
toplanmasını sağlayan Prof. Dr. Zeki AYTAÇ, tezimin düzeltmesinde bilgileriyle
beni yönlendiren Sayın Prof. Dr. Rahime ŞİMŞEK’e, Sayın Prof. Dr. Şule Coşkun
CEVHER ve Sayın Doç. Dr. Barbaros BALABANLI’ya, laboratuvar çalışmalarımı
yaptığım Moleküler Biyoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi ile Biyoteknoloji
Laboratuvarı ve çalışanlarına ve ayrıca bugünlere gelmemde maddi ve manevi olarak
her türlü desteği ile emeklerini asla ödeyemeyeceğim canım aileme ve tez
çalışmalarım boyunca her konuda her zaman yanımda olan sevgili eşim Emrah
TARANÇI’ya ve arkadaşlarıma teşekkürlerimi sunarım.
Bu çalışma Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri (BAP) Birimi tarafından
46/2012-02 kodlu proje ile desteklenmiştir. Maddi katkılarından dolayı Gazi
Üniversitesi Rektörlüğüne teşekkür ederim.
ix
İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET........................................................................................................................... iv
ABSTRACT ................................................................................................................ vi
TEŞEKKÜR .............................................................................................................. viii
İÇİNDEKİLER ........................................................................................................... ix
ÇİZELGELERİN LİSTESİ ........................................................................................ xii
ŞEKİLLERİN LİSTESİ ............................................................................................ xiii
RESİMLERİN LİSTESİ ........................................................................................... xvi
SİMGELER VE KISALTMALAR .......................................................................... xvii
1. GİRİŞ ....................................................................................................................... 1
2. KAYNAK ARAŞTIRMASI .................................................................................... 7
2.1. Kanser ve Genetik Yapısı ................................................................................. 7
2.1.1. Kanser oluşumunda rol alan genler ...................................................... 10
2.1.2. Serbest radikaller ve kanser oluşumuna etkileri ................................... 11
2.1.3. Genotoksik etki ..................................................................................... 16
2.1.4. Kolon kanseri ........................................................................................ 18
2.1.5. Serviks kanseri ...................................................................................... 21
2.2. Kanser Tedavisinde Kullanılan Yöntemler .................................................... 24
2.3. Kanser Tedavisinde Alternatif Olabilecek Bitkisel Kaynaklar
ve Bileşenleri .................................................................................................. 26
2.3.1. Flavonoidler ......................................................................................... 28
2.4. Antioksidan Bileşikler ve Antioksidan Savunma Sistemi ............................. 33
2.5. Kanserde Hücresel ve Moleküler Düzeyde Apoptoz Mekanizması ............... 37
x
Sayfa
2.5.1. Apoptozun moleküler mekanizması .................................................... 39
2.6. Türkiye’nin Bitki Örtüsü ................................................................................ 46
2.7. Asteracea Familyasının Genel Özellikleri ...................................................... 47
2.7.1. Asteracea familyasının morfolojik özellikleri ..................................... 48
2.8. Tanacetum Cinsinin Özellikleri ..................................................................... 48
2.8.1. Tanacetum albipannosum Hub.-Mor. & Grierson
bitkisinin özellikleri ............................................................................. 48
2.8.2. Tanacetum L. cinsinin halk arasında kullanımı ................................... 50
2.9. Achillea Cinsinin Özellikleri .......................................................................... 51
2.9.1. Achillea sp. nova bitkisinin özellikleri ................................................ 51
2.9.2. Achillea cinsinin halk arasında kullanımı ............................................ 52
2.10. Centaurea Cinsinin Özellikleri .................................................................... 53
2.10.1. Centaurea depressa bitkisinin özellikleri ........................................ 53
2.10.2. Centaurea cinsinin halk arasında kullanımı .................................... 54
3. MATERYAL VE METOT .................................................................................... 55
3.1. Materyal .......................................................................................................... 55
3.1.1. Bitki materyali ...................................................................................... 55
3.1.2. Çalışmada kullanılan hücre hatları ....................................................... 55
3.2. Metot................................................................................................................ 56
3.2.1. Bitki ekstraktlarının elde edilmesi ........................................................ 56
3.2.2. Bitki ekstraktlarının farklı konsantrasyonlarda denenmesi .................. 57
3.2.3. Hücrelerin geliştirilmesi için kullanılan besi ortamları ve gelişme
şartları .................................................................................................... 57
xi
Sayfa
3.2.4. Bitki ekstraktlarının antiproliferatif etkilerinin belirlenmesi ................ 59
3.2.5. Bitki ekstraktlarının antioksidan etkisinin belirlenmesi ....................... 61
3.2.6. Bitkilerin genotoksik ve antigenotoksik etkisinin belirlenmesi............ 62
3.2.7. Apoptozun belirlenmesi ........................................................................ 65
3.2.8. Apoptotik indeksin belirlenmesi ........................................................... 66
3.2.9. Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ....................................... 66
3.2.10. İstatiksel analizler ............................................................................... 69
4. DENEYSEL BULGULAR .................................................................................... 70
4.1. Bitki Türlerine Ait Ekstraktların Verimleri .................................................... 70
4.2. Bitkilerin Antiproliferatif Etkisinin Araştırılması .......................................... 70
4.3. Bitkilerin Antioksidan Etkilerinin Belirlenmesi ............................................. 74
4.3.1. Total antioksidan aktivitesinin belirlenmesi ......................................... 74
4.3.2. Süperoksit dismutaz analizi .................................................................. 78
4.4. Bitkilerin Genotoksik ve Antigenotoksik Etkisi............................................. 81
4.5. Bitkilerin Apoptotik Etkisinin Belirlenmesi ve Morfolojik Olarak
Değerlendirilmesi ........................................................................................... 86
4.6. Apoptotik İndeksin Belirlenmesi .................................................................... 89
4.7. Bitki Türlerinde Flavonoidlerin Araştırılması ................................................ 94
5. TARTIŞMA VE SONUÇ ...................................................................................... 95
KAYNAKLAR ........................................................................................................ 109
EKLER……………………………………………………………………………..125
EK-1 Gazi Üniversitesi (girişimsel olmayan) klinik araştırmalar etik kurulu
değerlendirme formu..................................................................................... 126
EK-2 SPSS Analizi................................................................................................. 128
ÖZGEÇMİŞ ............................................................................................................. 131
xii
ÇİZELGELERİN LİSTESİ
Çizelge
Sayfa
Çizelge 2.1. Reaktif oksijen türevleri ......................................................................... 12
Çizelge 2.2. Reaktif oksijen türevlerinin kaynakları .................................................. 13
Çizelge 2.3. Bazı bitkilerde ve gıdalarda bulunan flavonoidler ................................. 29
Çizelge 2.4. Farklı kanser hücre hatları üzerine antikanser özellik gösteren
flavonoidler ............................................................................................ 30
Çizelge 2.5. Türkiye’de bölgelere özgü endemik bitki türü sayıları .......................... 47
Çizelge 3.1. Tez kapsamında kullanılan bitki türleri, lokaliteleri, toplama yılı ......... 55
Çizelge 3.2. Çalışılan flavonoidler, mobil fazları, dalga boyları ve akış hızları ........ 68
Çizelge 4.1. Bitki ekstraktların verimleri (% w/w), (Centaurea depressa, Achillea sp.
nova, Tanacetum albipannosum) ........................................................... 70
Çizelge 4.2. Bitki türlerinin insan lenfositleri üzerine genotoksik etkisi ................... 82
Çizelge 4.3. Bitki türlerinin H2O2 ile muamele edilmiş insan lenfositleri üzerine
antigenotoksik etkisi............................................................................... 83
Çizelge 4.4. C. depressa metanol ekstraktında (CME), C. depressa su ekstraktında
(CSE), T. albipannosum metanol ekstraktında (TME), T. albipannosum
su ekstraktında (TSE), A. sp. nova metanol ekstraktında (AME), A. sp.
nova su ekstraktında (ASE) araştırılan flavonoidler ............................. 94
xiii
ŞEKİLLERİN LİSTESİ
Şekil
Sayfa
Şekil 2.1. Servikste kanser gelişimi ve tümör dokusu oluşumu ................................... 7
Şekil 2.2. Kolonda tümör dokusunun oluşumu ............................................................ 8
Şekil 2.3. Genetik değişikliklerin birikmesi sonucu kanser oluşumu .......................... 9
Şekil 2.4. Serbest radikallerin hücresel hasarı ........................................................... 14
Şekil 2.5. Karsinojenlerin metabolizmada oluşturduğu hasar ve kanser oluşumu….18
Şekil 2.6. Kolonun bölümleri ..................................................................................... 19
Şekil 2.7. HT-29 ve Caco-2 hücrelerinin mikroskobik görüntüsü ............................. 20
Şekil 2.8. Kadın ürogenital sistem ............................................................................. 21
Şekil 2.9. HeLa kanser hücre hattınının mikroskobik görüntüsü ............................... 23
Şekil 2.10. Bitkilerde bulunan primer ve sekonder metabolitler ............................... 27
Şekil 2.11. Flavonoidler aracılığı ile kanserin baskılanması ..................................... 32
Şekil 2.12. Antioksidan grupları ve antioksidan savunma mekanizmaları ................ 34
Şekil 2.13. Apoptoza maruz kalan bir hücrede hücre ölümünün aşamaları ............... 38
Şekil 2.14. Hücrede gerçekleşen apoptozun ardından oluşan apoptotik cisimlerin ışık
mikroskobik görünümü ............................................................................ 39
Şekil 2.15. Hücre ölüm reseptörlerinden bazılarının apoptozdaki rolü ..................... 41
Şekil 2.16. Apoptozda mitokondri yolunda yer alan Bcl-2 familya üyeleri .............. 44
Şekil 2.17. Bcl-2 onkoproteininin apoptoz üzerine etkisi .......................................... 45
Şekil 2.18. Mitokondri aracılığı ile kaspaz aktivasyonu ............................................ 46
Şekil 2.19. Tanacetum albipannosum ........................................................................ 49
Şekil 2.20. Centaurea depressa…………………………………………………......54
xiv
Şekil
Sayfa
Şekil 4.1. Centaurea depressa bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29, HeLa
ve Caco-2 hücre hatları üzerine antiproliferatif etkisi................................ 71
Şekil 4.2. Tanacetum albipannosum bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29,
HeLa ve Caco-2 hücre hatları üzerine antiproliferatif etkisi ...................... 72
Şekil 4.3. Achillea sp. nova bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29, HeLa ve
Caco-2 hücre hatları üzerine antiproliferatif etkisi .................................... 73
Şekil 4.4. C. depressa bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29, HeLa ve Caco-2
kanser hücre hatları üzerine total antioksidan etkisi .................................. 75
Şekil 4.5. T. albipannosum bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29, HeLa ve
Caco-2 kanser hücre hatları üzerine total antioksidan etkisi...................... 76
Şekil 4.6. A. sp. nova bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29, HeLa ve Caco-2
kanser hücre hatları üzerine total antioksidan etkisi ................................. 77
Şekil 4.7. C. depressa bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29, HeLa ve Caco-2
kanser hücre hatları üzerine SOD aktivitesi ............................................. 78
Şekil 4.8. T. albipannosum bitkisinin HT-29, HeLa ve Caco-2 kanser hücre hatları
üzerine SOD aktivitesi .............................................................................. 79
Şekil 4.9. A. sp. nova bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29, HeLa ve Caco-2
kanser hücre hatları üzerine SOD aktivitesi .............................................. 80
Şekil 4.10. H2O2’in indüklediği DNA hasarına bağlı oluşan genotoksisitenin bitki
ekstraktları tarafından inhibisyonu ........................................................... 86
Şekil 4.11. C. depressa metanol ve su ekstraktının kanser hücre hatları (HeLa, HT-29
ve Caco-2) üzerine apoptotik etkisi.......................................................... 87
Şekil 4.12. A. sp. nova metanol ve su ekstraktının kanser hücre hatları (HeLa, HT-29
ve Caco-2) üzerine apoptotik etkisi.......................................................... 88
Şekil 4.13. T. albipannosum metanol ve su ekstraktının kanser hücre hatları (HeLa,
HT-29 ve Caco-2) üzerine apoptotik etkisi .............................................. 89
Şekil 4.14. C. depressa metanol ve su ekstraktlarının HeLa, HT-29 ve Caco-2
üzerine apoptotik indeksi ......................................................................... 89
xv
Şekil
Sayfa
Şekil 4.15. A. sp. nova metanol ve su ekstraktlarının HeLa, HT-29 ve Caco-2 üzerine
apoptotik indeksi ..................................................................................... 91
Şekil 4.16. T. albipannosum metanol ve su ekstraktlarının HeLa, HT-29 ve Caco-2
üzerine apoptotik indeksi ........................................................................ 92
Şekil 4.17. Hoechst 33342 boyası ile apoptotik ve nekrotik HeLa hücrelerinin
floresan mikroskobu ile görüntüsü .......................................................... 93
xvi
RESİMLERİN LİSTESİ
Resim
Sayfa
Resim 2.1. Achillea sp. nova ...................................................................................... 52
Resim 3.1. Çalışmada kullanılan soklet cihazı .......................................................... 56
Resim 3.2. Çalışmada kullanılan evaporatör cihazı ................................................... 57
Resim 3.3. Çalışmada kullanılan mikroplak okuyucu ............................................... 61
Resim 3.4. Eritrositlerin üzerinde oluşan beyaz, bulutumsu lenfosit halkası ............ 62
Resim 3.5. Comet elektroforez tankı.......................................................................... 63
Resim 3.6. Boyanan preparatların incelendiği floresan mikroskobu ......................... 65
Resim 3.7. Çalışmada kullanılan HPLC cihazı .......................................................... 67
Resim 4.1. Bitki türlerinin su ve metanol ekstraktlarının (500 µg/mL) H2O2 ile
muamele edilmiş insan lenfosit hücrelerine karşı gösterdiği genetik hasarı
önleyici etkisinin kuyruk yoğunluğuna göre belirlenmesi ....................... 84
xvii
SİMGELER VE KISALTMALAR
Bu çalışmada kullanılmış bazı simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte
aşağıda sunulmuştur.
Simgeler
Açıklama
%
Yüzde
CO2
Karbondioksit
cm
Santimetre
dk
Dakika
g
Gram
g/mL
Gram/mililitre
H2O2
Hidrojen peroksit
HNO3
Nitrik asit
kb
Kilobaz
km
Kilometre
L•
Lipit serbest radikali
LO-
Alkoksil radikali
LOOH
Lipid hidro peroksit
LOO•
Lipit peroksit radikali
M
Molar
m
Metre
mA
Miliamper
µg/ml
Mikrogram/mililitre
mg/kg
Miligram/kilogram
mg/mL
Miligram/mililitre
mL
Mililitre
mL/dk
Mililitre/dakika
mm
Milimetre
mM
Milimolar
ng/ml
Nanogram/mililitre
xviii
Simgeler
Açıklama
NO
Nitrik oksit
NO2
Nitrojen dioksit
N2O3
Dinitrojen trioksit
OH-
Hidroksil radikali
ONOO
Peroksinitrit
O2
Oksijen
O2 -
Süperoksit radikali
o
Santigrat derece
C
pH
Asitlik bazlık birimi
rpm
Devir sayısı
V
Volt
μg/mL
Mikrogram/mililitre
μl
Mikrolitre
μm
Mikrometre
μM
Mikromolar
α
Alfa
Kısaltmalar
Açıklama
ABTS
2,
2’-
Azino-di-[3-etilbenztiyozolin
sülfanat]
AIF
Apoptoz uyarıcı faktör
ANOVA
Tek yönlü varyans analizi
APAF-1
Apoptotik proteaz aktive etme faktörü
CAT
Katalaz
COX
Siklooksijenaz
DMEM
Dulbecco’s modified eagle medium
D-PBS
Dulbecco’s phosphate buffered saline
EDTA
Etilendiamintetraasetik asit
ECG
Epikateşin gallat
xix
Kısaltmalar
Açıklama
EGC
Epigallokateşin
EGCG
Epigallokateşin gallat
GPx
Glutatyon peroksidaz
GR
Glutatyon redüktaz
GST
Glutatyon-S-transferaz
HPLC
Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi
HPV
Human papilloma virüsü
LMA
Düşük erime ısılı agar
LOX
Lipooksijenaz
PUFA
Hücre membranı poliansatüre (çoklu
doymamış) yağ asitleri
MDA
Malondialdehit
MOBAM
Moleküler
biyoloji
araştırma
uygulama merkezi
NaCl
Sodyum klorür
NMA
Normal erime ısılı agar
PARP
Poli ADP-riboz polimeraz
PBS
Phosphate buffered saline
ROT
Reaktif oksijen türleri
RNT
Reaktif nitrojen türleri
SDS
Sodyum dodesil sülfat
SOD
Süperoksit Dismutaz
sp
Tür
spp
Türler
subsp
Alttür
TNF
Tümör nekröz faktör
Tsg
Tümör supresör gen
uv
Ultraviyole
WHO
Dünya sağlık örgütü
ve
1
1. GİRİŞ
Kanser, tüm dünyada hızla çoğalan bir sağlık problemi olup, kalp hastalıklarından
sonra ikinci önemli ölüm sebebidir. Dünya Sağlık Örgütü’nün (WHO) raporuna göre,
2008 yılında, dünyadaki ölümlerin % 13’ü kanserden kaynaklanmaktadır. Ülkemizde
ise kanser görülme sıklığının her 100 bin kişide 229 olduğu açıklanmıştır [Arıca ve
ark., 2011]. Kanser gelişimine neden olan etmenler arasında sigara dumanı ve
katranında bulunan kimyasal ve karsinojenik ajanlar, radyasyon ve güneş ışığından
gelen zararlı ultraviyole ışınlar, ağır metaller bulunmaktadır. Bu zararlı etmenlere ek
olarak; vitaminler, mineraller ve antioksidan molekülleri içeren gıdaların yetersiz
tüketilmesi ile hücrelerin zararlı moleküllere ve serbest radikallere karşı koruyucu,
detoksifiye edici sistemlerinin ve savunma mekanizmalarının zayıflaması da hücre
hasarının artmasına yol açmakta ve böylece kanser gelişimini tetiklemektedir
[Dönmez ve ark., 2010; Doll ve Peto, 1981].
Kanser tedavisinde kullanılan yöntemler arasında kemoterapi, radyoterapi, cerrahi
tedavi ve hormon terapisi bulunmaktadır. Bu tedavi yöntemleri tedaviye bağlı olarak
hastalarda ağır yan etkiler gösterdiği için ve tedavi sonucunun başarı olasılığının
düşük olması nedeni ile başka yöntemlere arayışların arttığı görülmektedir [Tekin ve
ark., 2012]. Kanserin tedavisine yönelik yapılan klinik, epidemiyolojik ve deneysel
çalışmalarda alternatif ilaçların ve tedavi yöntemlerinin ortaya konulmasının önemi
vurgulanmaktadır. Kanser tedavisinde kullanılan ilaçların birçoğunun etken maddesi
doğal kaynaklardan elde edilmektedir. Bu doğal kaynaklar, insanlık tarihinin çok
eski dönemlerinden bu yana hem hastalıkların tedavisinde hem de hastalıklara karşı
korunmada önemli bir role sahiptir. Dolayısıyla tüm dünyada doğal yaşam, sağlıklı
ve daha uzun yaşama isteğine paralel olarak tıbbi bitkisel ürünlerin, gıda
desteklerinin ve bitkisel ilaçların kullanımı gittikçe önem kazanmıştır.
Son yıllarda yapılan epidemiyolojik çalışmalar bitkilerdeki fenolik bileşiklerden olan
flavonoidlerin yüksek miktarda alımının insanlarda düşük kanser prevalansı ile
ilişkili olduğunu göstermektedir. Karsinojen inaktivasyonu, antiproliferasyon, hücre
2
döngüsünün askıya alınması, apoptoz ve farklılaşmanın indüksiyonu, anjiogenezin
baskılanması, antioksidasyon ve çoklu ilaç direncinin azaltılması ya da tüm bu
mekanizmaların kombinasyonu flavonoidlerin kansere karşı etki mekanizmalarını
oluşturmaktadır [Vauzour ve ark., 2010]. Antioksidanlar DNA’da hasara neden olan
serbest radikalleri diğer moleküllerden elektron alarak etkisiz hale getirirler. Serbest
radikallerin meydana getirdiği oksidatif stres ve DNA hasarı gibi zararlı etkiler
yaşlanma,
kanser
gelişimi
ve
birçok
hastalıktaki
patolojik
durum
ile
ilişkilendirilmektedir [Husain ve Kumar, 2012; Halliwell, 2012]. Bitkilerde bulunan
flavonoidler oksidatif stres tarafından indüklenen genotoksisiteye karşı da koruyucu
etki gösterdiğinden bitki sekonder metabolitleri klinik çalışmalarda kullanılabilecek
ideal etken maddelerdir. Son yıllarda sekonder metabolitlerden olan flavonoidlerin
bu üstün özellikleri nedeni ile kanser tedavisinde kullanılabilme olanaklarının
araştırılması üzerine yapılan çalışmaların hız kazandığı görülmektedir.
Kanser tedavisinde kullanılan alternatif ilaçlar kanser hücrelerinin yanı sıra sağlıklı
hücrelere de zarar verebilmektedir. Başta bitkiler olmak üzere doğal kaynaklardan
elde edilen, yan etkisi olmayan alternatif ilaçların araştırılması, bu yüzden giderek
önem kazanmaktadır. Dünyanın gelişmiş ülkeleri, özellikle tedavide bitkisel
kaynaklara yönelmiş durumdadırlar. Asya ile Avrupa arasında bir köprü oluşturan
Türkiye, bu coğrafi konumu nedeni ile çok fazla bitki türüne ev sahipliği
yapmaktadır. Ülkemiz bitki çeşitliliği bakımından dünyanın önde gelen ülkeleri
arasında yer almaktadır. Ülkemizde bulunan yaklaşık 3000 endemik bitki türüne her
yıl yeni türler kazandırılmaktadır. Ancak bitki türlerimizin tıbbi özelliklerini ortaya
çıkartmak için yapılan çalışmaların sayısı yetersizdir.
Güçlü ve tutarlı epidemiyolojik kanıtlar zengin antioksidan özelliği olan meyve ve
sebzelerin tüketilmesi sayesinde antioksidanların kanser sıklığının ve kanser
ölümlerinin önlenmesinde etkili ajanlar olabileceğini göstermiştir. Bu ajanlar, düşük
toksisitelerinin olması ve güvenilir olmaları nedeniyle beslenmede umut verici
bileşikler olmuştur [Fresco ve ark., 2006]. Çeşitli literatürlerde bitki ekstraktlarının
göstermiş olduğu antioksidan ve antigenotoksik etkilerin indirekt olarak kanserden
koruyucu özelliğinin ortaya konulması önem taşımaktadır. Bu yüzden son yıllarda
3
araştırıcılar artan bir ilgiyle kanser hücrelerinde apoptozu tetikleyici maddelerle ilgili
çalışmalara yönelmiş durumdadır.
Bu nedenle bu çalışmada öncelikle Türkiye’de yetişen ve Asteraceae familyasına ait
endemik Tanacetum albipannosum ve Achillea sp. nova ve yaygın Centaurea
depressa türlerinden elde edilen su ve metanol ekstraktlarının kolorektal
adenokarsinoma hücreleri olan HT-29 ve Caco-2 kanser hücre hattında, servikal
kanser hücresi olan HeLa kanser hücre hattında antiproliferatif etkilerinin ve sağlıklı
gingivial
fibroblast
hücrelerinde
(HGF-1)
sitotoksik
etkisinin
belirlenmesi
hedeflenmiştir.
İyonize radyasyon, UV ışınları gibi fiziksel ve ksenobiyotikler, alkilleyiciler gibi
kimyasal ajanlar canlıda DNA moleküllerinde hasar oluşturmakta ve oluşan bu hasar
tamir edilemediğinde kansere ve yaşlanmaya yol açmaktadır [Debeleç Bütüner ve
Kantarcı, 2006; Dinçer ve Kankaya, 2010]. Bu bağlamda herhangi bir kimyasal
ajanın sebep olduğu genotoksik hasarın doğal bir ajan kullanılarak önlenmesi
kanserin gelişiminin önlenmesi bakımından önem oluşturmuştur. Bu sebeple
çalışmamızda kimyasal bir mutajen olan hidrojen peroksit (H2O2) tarafından
oluşturulan oksidatif DNA hasarına karşı bitki ekstraktlarının antigenotoksik
etkisinin comet yöntemi ile belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu şekilde oksidatif strese
neden olan etkenlere bağlı olarak oluşan hasarı, azaltıcı veya yok edici amaçlı
kemoterapötik özellikte doğal kaynakların ilaç sanayine yeni ürün olarak
kazandırılması olasıdır.
Bitkilere ait birçok bileşiğin özellikle antioksidan etki bakımından önemli ve farklı
biyolojik aktiviteye sahip olduğu bilinmektedir. Reaktif oksijen türevlerinin
oluşturduğu hasarlara karşı organizmada, gıdalarda ve çevrede antioksidanlar
kullanılmaktadır. Reaktif oksijen türevleri ve serbest radikaller DNA, protein,
karbonhidrat ve lipidler gibi biyolojik önemi olan moleküllere zarar verebilmektedir.
Bu açıdan serbest radikaller geniş araştırma konusu olmuş, serbest radikallerle ilgili
yapılan
mevcut
araştırmalar
ise
antioksidan
yönünden
zengin
gıdaların
kardiyovasküler hastalıklar, kanser, parkinson ve alzheimer dahil olmak üzere
4
nörodejeneratif hastalıkların önlenmesinde önemli rol oynadıklarını açıkça
göstermektedir [Gerber ve ark., 2002]. Flavonoidlerin etki mekanizmalarının
anlaşılması ve klinik olarak kullanılabilme yollarının araştırılmasının önemli olduğu
görülmektedir. Bu nedenle çalışmamızda bitki türlerimize ait su ve metanol
ekstraktlarının kanser hücreleri üzerine antioksidan etkilerinin de belirlenmesi
amaçlanmıştır. Hücreler üzerindeki antioksidan kapasite total antioksidan kapasitesi
ve antioksidan bir enzim olan süperoksit dismutaz enzim aktivitesi ile
değerlendirilmiştir.
Apoptoz, normal hücre büyümesi ve homeostazisi için gerekli bir süreçtir. Son
yıllarda yapılan çalışmalarla bu dengenin bozulması sonucu apoptozun kontrolünde
oluşan anormalliklerin kanser başta olmak üzere birçok önemli hastalığın
patogenezinde rol aldığı gösterilmiştir [Gökçe ve ark., 2011; Mcphie ve ark., 2003].
Doğal
fenoliklerin
apoptozun indüklenmesini
sağlayarak tümör hücresinin
eliminasyonunda ve kanserde görev aldığı bildirilmiştir. Bu nedenle apoptozu
indükleyici ajanların ideal kanser ilaçları olması umut edilmektedir. Çalışmamızda
aynı zamanda bitki türlerimize ait su ve metanol ekstraktlarının kanser hücreleri
üzerine apoptotik etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Apoptoza uğramış hücreler
morfolojik olarak da mikroskopta değerlendirilmiştir.
Tüm bu bilgiler ışığında, Gazi Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü
Biyoteknoloji
Laboratuvarı’nda
bulunan
Centaurea
depressa,
Tanacetum
albipannosum ve Achillea sp. nova bitkilerinin metanol ve su ekstraktlarının;
1) Her bir ekstraktın 100, 250 ve 500 µg/ml konsantrasyonlarının kontrol sağlıklı
hücre olan insan gingivial fibroblast (HGF-1) hücrelerinde sitotoksik aktivitesinin
olup olmadığının belirlenmesi ve tercihen sağlıklı hücrelerde sitotoksik etki
göstermeyen ekstraktların seçilmesi,
2) 100, 250 ve 500 µg/ml konsantrasyonları kullanılarak kolorektal adenokarsinoma
hücreleri olan HT-29 ve Caco-2 kanser hücre hattında ve servikal kanser hücresi olan
HeLa kanser hücre hattında antiproliferatif etkilerinin sitotoksik aktivite ile tespit
edilmesi,
5
3) Antikanser ajanı olarak kullanım potansiyelini belirlemek amacıyla bu bitki
ekstraktlarının genotoksik etkisinin araştırılması güvenilirlikleri açısından önemlidir.
Bundan dolayı tüm ekstraktların insan lenfositleri üzerine genotoksik hasar oluşturup
oluşturmadığının comet yöntemi ile araştırılması,
4) H2O2 kimyasal ajanı ile insan lenfosit hücrelerinde yaratılan oksidatif DNA hasarı
üzerine, kanseri önleme mekanizmalarından biri olan antigenotoksisite aktivitesinin
olup olmadığının yine comet yöntemi ile belirlenmesi ve antigenotoksik etkinin
antikanser etkideki rolünün ortaya konulması
5) 250 ve 500 µg/ml konsantrasyonlar kullanılarak HT-29, Caco-2 ve HeLa kanser
hücre hatlarında bitki ekstraktlarının total antioksidan kapasitelerinin tespit edilmesi,
6) 250 ve 500 µg/ml konsantrasyonlar kullanılarak HT-29, Caco-2 ve HeLa kanser
hücre hatlarında bitki ekstraktlarının süperoksit dismutaz enzim aktivitesinin
araştırılması ve antioksidan etki ile antikanser etkinin ilişkisinin ortaya konulması,
7) Kanser hücre hatları üzerine antiproliferatif etkisi yüksek konsantrasyona (500
µg/ml) sahip bitki ekstraktlarının, kanser hücrelerinde apoptozun indüklenmesi
sonrasında hücre sitoplazması dışındaki histon ile kompleks oluşturmuş DNA
fragmentlerinin miktarsal tayini ile apoptotik etkisinin belirlenmesi,
8) Bitki ekstraktlarının kanser hücreleri üzerine apoptotik etkisinin hücre zarındaki
bozulmalar göz önünde bulundurularak morfolojik olarak değerlendirilmesi,
9) En iyi antiproliferatif, antigenotoksik, antioksidan ve apoptotik etkiye sahip
olduğu belirlenen bitkilerin metanol ve su ekstraklarının antikanser etkisi olduğu
düşünülen flavonoidler bakımından araştırılması,
10) Ekstraktların flavonoid içeriği ile antiproliferatif, antigenotoksik, antioksidan ve
apoptotik etkileri arasında ilişki olup olmadığı ve bu antikanser mekanizmalarında
denediğimiz bitki ekstraktlarının etksini nasıl göstermiş olabileceğinin ortaya
koyulması amaçlanmıştır.
Bugüne kadar birçok bitki türü ile yapılan antikanser çalışmalarının çoğunlukla
kanser hücrelerine sitotoksik etki düzeyinde olduğu dikkati çekmiştir. Bu çalışmada
yaygın C. depressa ve endemik A. sp. nova ve T. albipannosum bitki türlerinin
kullanılacak olması ve bu bitki türlerinden özellikle antikanser çalışmaların
olmaması, yeni bir antikanser ajanı bulma açısından bu araştırmayı önemli kılacağı
6
düşünülmektedir. Ayrıca bu bitki ekstraktlarının antikanser etkilerinin yanısıra
antikanser mekanizmasının ortaya konulması, daha etkin ve hedefe yönelik koruyucu
ve tedavi edici ilaç formülasyonlarının geliştirilmesini sağlayacaktır.
Bu şekilde etki mekanizması tam olarak ortaya konmuş bir ajanın, ilaç olarak
kullanım oranı ve etkinliğini daha fazla artırmak mümkün olabilecektir. Diğer bir
taraftan çalışmamız ile elde edilen sonuçlar bu alanda bundan sonra yapılacak yeni
çalışmalara, projelere kaynak teşkil edecek ve konuyu daha ileri düzeye taşımada
önemli rol oynayacaktır. Diğer taraftan çalışmamızda seçtiğimiz bitkiler literatürde
ilk defa antiproliferatif, antigenotoksik, apoptotik ve antioksidan etkileri bakımından
bir arada değerlendirilecektir. Bu sebep ile de Türkiye’de ve Dünya’da ilk çalışma
olacaktır.
7
2. KAYNAK ARAŞTIRMASI
2.1. Kanser ve Genetik Yapısı
Kanser, hücrelerin aşırı ve zamansız çoğalmaları yani kontrolsüz hücre büyümesi,
immün sistem kontrolünden çıkmaları ve hücrelerin orijininden vücudun yakın ya da
uzak dokularına yayılmaları (metastaz) ile karakterize edilen bir hastalık grubudur
[Mcphie ve ark., 2003]. Vücutta oluşan tümörler eğer bulundukları orijinden uzak
bölgelere yayılıp orada kolonize olmuyor ise bu tümör benign (iyi huylu) olarak
isimlendirilir ve malign (kötü huylu) (Şekil 2.1 ve Şekil 2.2) olarak adlandırdığımız
tümör çeşidinden farkı da bu özelliğidir [Kumar ve ark., 2008].
Şekil 2.1. Servikste kanser gelişimi ve tümör dokusu oluşumu
[http://www.womeningovernment.org]
8
Şekil 2.2. Kolonda tümör dokusunun oluşumu [http://www.healthcentral.com]
Çeşitli kimyasal, fiziksel ya da toksik ajanların neden olduğu DNA sekans
değişimleri veya mutasyonların kanserden sorumlu olduğu yapılan araştırmalar ile
gösterilmiştir [Herceg ve Hainaut, 2007]. Tümör hücrelerinde tanımlanan hemen
hemen her mutasyon somatik mutasyondur. Fakat hücre bölünmesinden sonra yavru
hücrelere aktarılır. Mutasyonlar bu kişinin (erken gelişme safhalarında vücut ve eşey
hatları ayrıldıktan sonra) somatik bir hücre hattında sonradan ortaya çıkar. Zaman
içinde çok sayıda somatik bir mutasyon vücut hücrelerinde birikir, çok sayıda genin
fonksiyonunu değiştirir veya durdurur, sonunda kanserli bir hücre (Şekil 2.3) üretilir
[Ekmekçi ve ark., 2008].
9
Şekil 2.3. Genetik değişikliklerin birikmesi sonucu kanser oluşumu
[http://medschool.creighton.edu]
Hanahan ve Weinberg [2000] kanserin 6 önemli niteliğini açıklamışlardır:
a) Büyüme sinyal otonomisi: Normal hücreler bölünebilmek için büyüme
faktörlerinin dışında bir sinyale ihtiyaç duyarlar, kanser hücreleri ise büyüme faktör
sinyaline bağımlı değildir. Çünkü büyüme faktör yolağında oluşan mutasyon
kontrolsüz büyümeye sebep olur.
b) Büyüme inhibitör sinyallerinden kaçınma: Normal hücreler homeostaziyi devam
ettirmek için inhibitör sinyallerine yanıt verirler; kanser hücreleri, oluşan
mutasyonlar inhibitör yolaklarını engellediği için büyüme inhibitör sinyallerine yanıt
vermez.
c) Apoptotik hücre ölümlerinden kaçınma: Normal hücreler apoptoz mekanizması
tarafından uzaklaştırılır, kanser hücreleri ise apoptotik sinyalden kaçınırlar.
d) Sınırsız replikasyon potansiyeli: Normal hücreler yaşlandıktan sonra, hücrenin
sınırlı sayıda iki katına çıkmasını belirleyen sayma düzeneğine sahiptirler. Bu
hücresel sayaç her DNA replikasyonu sırasında meydana gelen kromozom uçlarının
kısalmasını belirler (telomerler). Kanser hücrelerinde telomeraz uzunluğu korunur.
Telomer regülasyonunun değişmesi sınırsız replikasyon potansiyeline neden olur.
10
e) Anjiyogenez (yeni kan damarlarının oluşumu): Normal hücreler besin ve oksijen
desteği için kan damarlarına bağlıdır, fakat olgun bir insanda dolaşım sabittir. Kanser
hücreleri ise anjiyogenezi uyarır, yeni kan damarlarının gelişmesi tümör yaşamı ve
büyümesi için gereklidir. Anjiyogenik değişimin aktive edilebilmesi anjiyogenik
uyarıcılar ve inhibitörler arasındaki dengenin değiştirilmesi ile sağlanabilir.
f) İnvazyon ve metastaz: Normal hücreler vücut içerisinde yerlerini korurlar ve
genellikle göç etmezler. Ancak vücudun diğer kısımlarına hareket eden kanser
hücreleri, kanser ölümlerinin en büyük nedenidir. Mutasyonlar, invazyona neden
olan enzimlerin aktivitesini, hücre-hücre ve hücre-ekstrasellüler adhezyonu sağlayan
molekülleri değiştirir.
2.1.1. Kanser oluşumunda rol alan genler
Kanser oluşumu ile ilgili iki sınıf gen vardır: onkogenler ve tümör supresör genleri.
Onkogenler
Normal hücrelerde hücre bölünmesini kontrollü bir şekilde gerçekleştiren
protoonkogenlerde mutasyon meydana gelirse kontrolsüz hücre çoğalmasına neden
olan onkogenler oluşur. Onkogenler mutasyona uğramış genlerdir. Onkogenlerin
protein ürünleri yüksek miktarda üretilir ve böylece tümör formunun başlatılması
için dominant tavır sergiler [Fışkın, 2002]. Onkogenler transkripsiyon faktörleri,
büyüme faktörü ve büyüme faktörü reseptörlerinin üretimini arttırarak, apoptozu
baskılayarak kansere neden olmaktadır [Croce, 2008].
Tümör supresör genler
Anti onkogen olarak da adlandırılan tümör süpresör genler, normal olarak hücre
bölünmesini baskılayan bir grup gendir. Tümör süpresör genlerin her iki allelindeki
normal işlevin kaybı, kontrolsüz hücre bölünmesine ve tümör büyümesine neden
olur. Bir etki oluşması için işlev kaybı her iki alleli de etkilemelidir [Pazarbaşı ve
Kasap, 2003; Akbulut ve Akbulut, 2005]. Pro veya antiapoptotik proteinler, hücre
11
siklusu kontrol proteinleri, DNA tamir proteinleri tümör supresör genlere örnek
olarak verilebilir. Kanser genleri arasında en çok üzerinde çalışılan ve en iyi bilinen
tümör baskılayıcı gen p53 genidir [Kopnin, 2000]. Hasar görmüş hücrelerde p53,
büyümenin önlenmesinde önemli rol oynar. Hücrede DNA hasarı, p53 ekpresyonunu
arttırır ve hücre döngüsünün G1’de durdurulmasına yol açarak S fazına geçmesini
engeller. Böylece hücre siklusu durdurularak oluşmuş olan hasarlı DNA’ya sahip
hücrenin çoğalması engellenir. Tümör süpresör gen kategorisinde yer alan DNA
tamir genleri; baz kesip çıkarma, hasarın direkt geriye döndürülmesi, yanlış
eşleştirme onarımı, nükleotid kesip çıkarma, homolog rekombinasyon gibi
aktivitelere sahip olup hücre döngüsü süresince oluşan mutasyonların onarılmasını
sağlamaktadırlar [Lahtz ve Pfeifer, 2011].
2.1.2. Serbest radikaller ve kanser oluşumuna etkileri
Serbest radikaller, son yörüngelerinde eşleşmemiş elektron bulunduran ve bu açığı
kapatabilmek için başka bileşiklerin elektronlarını almaya çalışan reaktif oksijen ve
reaktif nitrojen türevleri (ROT/RNT) gibi atom veya bileşiklerdir [Astley, 2003;
Benzei, 2003]. Memeliler, hücrelerindeki ATP üretiminin büyük bir kısmını
mitokondriyal elektron transport sisteminde, oksijenin dört elektronunun su
oluşturmak üzere alınması ile elde ederler. Bu süreçte oksijenin % 1-3’ ü tam olarak
suya dönüşemez ve ara ürün olarak serbest oksijen radikalleri ve bunların da çeşitli
reaksiyonları ile reaktif oksijen türevleri meydana gelir [Cheeseman ve Slater, 1993].
Başta mitokondriyal elektron transportu olmak üzere ksenobiyotik metabolizması,
fagositik aktivasyon, çeşitli sentez ve degradasyon reaksiyonlarında ROT (Çizelge
2.1) oluşmakta ve antioksidan dengenin bozulması sonucunda gelişen oksidatif stres,
çeşitli mekanizmalar ile biyomoleküllere hasar vermektedir.
12
Çizelge 2.1. Reaktif oksijen türevleri [Çavdar ve ark., 1997]
Reaktif oksijen türevleri
Radikal olanlar
Radikal olmayanlar
Süperoksit radikali (O2ˉ)
Hidrojen peroksit (H2O2)
Hidroksil radikali (OHˉ)
Lipid hidroperoksit (LOOH)
Alkoksil radikali (LOˉ)
Hipoklorik asit (HClO)
Peroksil radikali (LOOˉ)
Singlet oksijen (1O2)
Serbest radikaller çoğunlukla singlet oksijen (1O2), süperoksit anyonu (O2‾), hidrojen
peroksit (H2O2), ve hidroksil radikalini (OH•) içerirler [Sharma ve ark., 2012]. Bu
radikaller yaşlanma, kanser, kardiyovasküler hastalıklar, immün sistem hastalıkları,
katarakt, diyabet, böbrek ve karaciğer hastalıkları gibi pek çok hastalıktan sorumlu
tutulurlar [Dai ve Mumper, 2010]. Süperoksit anyonu moleküler oksijene bir elektron
vermesi ile meydana gelir. Süperoksit radikali oksidatif zincir reaksiyonlarında
aracıdır. Süperoksit radikalinin dismutasyonu sonucu H2O2 üretilir. H2O2 ve
süperoksit radikali etkileşime girmekte (Haber-Weiss reaksiyonu) ve oksidatif hasara
neden olan hidroksil radikali oluşmaktadır [Al-Gubory ve ark., 2010]. Normal
oksijenden çok daha hızlı bir biyolojik molekül olan singlet oksijen yapısında iki
adet çiftlenmemiş elektron taşır. Hücre membranındaki çoklu doymamış yağ asitleri
ile singlet oksijen doğrudan reaksiyona girerek lipit peroksitlerin oluşumuna yol
açarlar. Çizelge 2.2’ de reaktif oksijen türevlerinin in vivo ortamdaki kaynakları
görülmektedir [Çavdar ve ark., 1997].
13
Çizelge 2.2. Reaktif oksijen türevlerinin kaynakları [Çavdar ve ark., 1997]
Normal biyolojik işlemler
-
Oksijenli solunum
-
Katabolik ve anabolik işlemler
1. İskemi – kanama – travma – radyoaktivite
2. Ksenobiotik maddelerin etkisi
a. İlaçlar
b. Alışkanlık yapanlar
3. Oksidan enzimlerin aktivitesi
a. Ksantinoksidaz b. İndolamin dioksigenaz
c. Triptofan dioksigenaz d. Galaktoz oksidaz
Oksidatif stres yapıcı
e. Siklooksigenaz f. Lipooksigenaz
durumlar
g. Monoamino oksidaz
4. Stres ile artan katekolaminlerin oksidasyonu
5. Fagositik inflamasyon hücrelerinden yapılan
salgı (endotelyal hücreler, nötrofil, makrofaj,
monosit, eosinofil)
Bazı kanser türleri, oksijen merkezli serbest radikallerden ve diğer reaktif oksijen
türevlerinden kaynaklanmaktadır (Şekil 2.4) [Meral ve ark., 2012]. Çünkü bu tür
serbest radikallerin normalden fazla sentezlenmesi biyomoleküllerde (örn; lipitler,
proteinler ve DNA) oksidatif hasara neden olmaktadır. İnsan vücudunun her
hücresinde DNA’nın günde 103 kez oksidatif hasara maruz kaldığı öne sürülmüştür
[Halliwell ve Gutteridge, 1999]. Genetik materyalde oluşan hasarlar tamir
edilemediğinde, DNA sekans değişikliklerine bağlı, kromozom bozuklukları ile
sonuçlanabilen tek veya birden fazla nükleotid değişikliklerine yol açmakta ve
bunların sonucu olarak rekombinasyon, mutasyon, doku hasarı, yaşlanma ve kanser
oluşabilmektedir. Epidemiyolojik kanıtlar zengin antioksidan özelliği olan meyve ve
sebzelerin tüketilmesi ile antioksidanların kanser sıklığının ve kanser ölümlerinin
önlenmesinde etkili ajanlar olabileceğini göstermiştir. [Fresco ve ark., 2006].
14
Şekil 2.4. Serbest radikallerin hücresel hasarı [http://www.spice-of-life.com]
Serbest radikallerin lipitlere etkileri
Hücre membranı poliansatüre (çoklu doymamış) yağ asitleri (PUFA) ve kolesterol
bakımından zengindir. Serbest radikaller ile hücre membranlarındaki kolesterol ve
yağ asitlerinin doymamış bağları reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri
oluştururlar. Lipit peroksidasyonu oldukça zararlıdır ve kendi kendini devam ettiren
zincir reaksiyonu şeklinde ilerler. Hücre membranlarında lipit peroksit radikalleri
(LOO•) ve lipit serbest radikallerinin (L•) oluşması, reaktif oksijen türevlerinin
(ROT) neden olduğu hücre hasarının önemli bir özelliği olmaktadır.
Lipit peroksidasyonu, direkt olarak membran yapısına ve ürettiği reaktif aldehitler ile
indirekt olarak diğer hücre bileşenlerine zarar verir. Bu da doku hasarına ve birçok
hastalığa neden olur. Malondialdehit (MDA), üç veya daha fazla çift bağ içeren yağ
15
asitlerinin peroksidasyonunda meydana gelir. MDA, kanda ve idrarda ortaya çıkar.
Oksidatif stresi belirlemede, lipit oksidasyonunu MDA ölçümleri yansıtır [Porter,
2013; Dalle Donne ve ark.,, 2003].
Serbest radikallerin proteinlere etkileri
Proteinlerin aminoasit içeriğine göre serbest radikallerin proteinlere etkisi
değişmektedir. Proteinler üzerindeki sülfidril ya da amino grupları ile serbest
radikallerin etkileşmesi sonucu proteinlerde yapısal değişiklikler oluşur. Bu yapısal
değişiklikler üçe ayrılır: aminoasitlerin modifikasyonu, proteinlerin fragmantasyonu,
proteinlerin agregasyonu ya da çapraz bağlanmalarıdır. Proteinlerde serbest
radikallerin oluşturduğu hasarın büyüklüğü, aminoasit kompozisyonlarına, protein
konformasyonuna, aminoasitlerin lokalizasyonuna ve hasar gören proteinin tamir
yeteneğine bağlıdır.
Proteinin hücresel lokalizasyonuna ve serbest radikalin toksisite gücüne göre protein
hasar boyutları değişebilir. Yapısında doymamış bağ içeren fenilalanin, tirozin,
triptofan, histidin ve kükürt içeren metiyonin, sistein ve sistin gibi aminoasitlere
sahip proteinler serbest radikallerden kolaylıkla etkilenirler. Bu etki sonucunda sülfür
radikalleri ve karbon merkezli organik radikaller oluşur. Serbest radikaller, membran
proteinleri
ile
reaksiyona
girebilirler.
Enzim,
nörotransmitter
ve
reseptör
proteinlerinin fonksiyonlarının bozulmasına neden olabilirler. Serbest radikallerin
etkileri sonucu yapılarında fazla sayıda disülfit bağı bulunan immünoglobülin G
(lgG) ve albümin gibi proteinlerin tersiyer yapıları bozulur ve normal fonksiyonlarını
yerine getiremezler. Hem proteinleri de hemoglobin gibi serbest radikallerden önemli
oranda hasar görürler. Bilhassa oksihemoglobinin süperoksit radikali (O2•-) ya da
hidrojen peroksit (H2O2) ile reaksiyonu methemoglobin oluşumuna neden olur
[Ahmed ve ark., 2013; Üzümlüoğlu Coşkun, 2008].
16
Serbest radikallerin karbonhidratlara etkileri
Serbest oksijen radikalleri monosakkaritlerin otooksidasyonu sonucu meydana gelir.
Bu radikaller diyabet ve sigara içimi ile ilişkili kronik hastalıklar gibi patolojik
süreçlerde önemli rol oynarlar. Bir mukopolisakkarit olan hyalüronik asit sinoviyal
sıvı ve gözün vitröz sıvısında bulunmaktadır. Hyalüronik asitte serbest oksijen
radikallerinin meydana getirdiği hasar sonucu inflamatuvar eklem hastalıklarının ve
kataraktın oluşumu görülmektedir [Mccord, 1993; Üzümlüoğlu Coşkun, 2008].
Serbest radikallerin DNA’ya etkileri
Serbest radikallerin DNA’da meydana getirdiği oksidatif hasar mutasyona, kansere
ve yaşlanmaya yol açmaktadır. Reaktif oksijen türevi olan hidroksil radikali, bazlar
ve deoksiribozlar ile kolayca reaksiyona girer. Hidrojen peroksit ise hücre
membranlarından kolayca geçebildiği için hücre çekirdeğindeki DNA’ya ulaşır ve
hücre fonksiyonlarının bozulmasına hatta ölümüne yol açar. DNA’ da hasar
oluşumuna neden olan iç reaksiyonlar oksidasyon, metilasyon, depürinasyon ve
deaminasyon reaksiyonlarıdır. Nitrojen dioksit (NO2), nitrik oksit (NO), peroksinitrit
(ONOO), dinitrojen trioksit (N2O3) ve nitrik asit (HNO3) gibi reaktif ürünleri,
nitrozasyon ve deaminasyon reaksiyonları yoluyla mutajenik aktivite gösterirler
[Üzümlüoğlu Coşkun, 2008].
2.1.3. Genotoksik etki
Genotoksisite, fiziksel ve kimyasal ajanlar etkisiyle genetik materyalde meydana
gelen hasarlar olup bu hasarlar tek zincir kırıkları, çift zincir kırıklıkları, DNA
eklentileri gibi hasarlardır [Kramer, 1998; Vincent Hubert ve ark., 2011]. Genotoksik
ajanların neden olduğu DNA hasarı eğer onarılmaz ise kromozomal değişiklikler,
gen mutasyonları, kanser oluşumu ve hücre ölümü ile sonuçlanırlar [Christmann ve
Kaina, 2013]. DNA’da mutasyonlara yol açan mutajenler ya da ajanlar, DNA
üzerindeki etkilerini ya doğrudan, ya da genomik bilgilere göre sentezlenen
proteinlere bağlanarak dolaylı olarak gösterirler [Kirsch Volders ve ark., 2003;
17
Mateuca ve ark., 2006]. Ökaryot organizmalarda, somatik hücrelerdeki genetik hasar
kötü huylu tümöre neden olabilmektedir. Bu nedenle bir bileşiğin genotoksisitesinin
araştırılması
karsinojen
mekanizmasının
anlaşılmasında
önemli
olmaktadır.
Genotoksisitenin araştırılması aynı zamanda yeni bir bileşiğin karsinojen ya da
mutajen olup olmadığının değerlendirilmesinde önem arz etmektedir [Phillips ve
Arlt, 2009]. Karsinojen, biyolojik sistemlerde kanser oluşturan virüsler, kimyasal ve
fiziksel maddeler gibi etkenlerdir (Şekil 2.5). Kimyasal karsinojenler ise toksik
etkilerini insan ve hayvanlarda kanser oluşturarak gösterirler. Bu olay "kimyasal
karsinojenezis" olarak adlandırılır [Vural, 2005]. Karsinojenite ve genotoksisite
arasındaki ilişki, yapılan pek çok çalışmada incelenmiş ve insanlar için karsinojen
olan pek çok bileşiğin genotoksik etkiye sahip olduğu bulunmuştur [Atlı Şekeroğlu
ve Şekeroğlu, 2011]. Genotoksik karsinojenler DNA ile etkileşebilen maddelerdir.
Bu maddeler DNA veya gen ekspresyonunu değiştirerek kalıtsal bir değişime yol
açarlar [Vural, 2005]. Hücresel metabolizmanın yan ürünü olarak üretilen serbest
radikallerin neden olduğu DNA hasarları genotoksik etki bakımından önemli yer
tutmaktadır [Dinçer ve Akçay, 2000]. Serbest radikaller normal metabolik olaylar
sırasında veya çevresel faktörlerin etkisiyle oluşur. Organizmada serbest radikal
oluşum hızı ile bunların antioksidan sistemler aracılığı ile etkisizleştirme hızı
dengede olduğu sürece organizma bu bileşiklerden etkilenmez. Serbest oksijen
radikallerinin aşırı üretimi lipid peroksidasyon, mutajenez ve karsinojenezle
sonuçlanan biyomoleküllerde oksidatif hasara neden olur [Özden ve ark., 2004]. Pek
çok kanserin çeşidi, serbest radikallerin DNA üzerinde meydana getirdiği hasar
sonucu mutasyon ve hücre döngüsünün bozulmasına bağlı olarak oluşmaktadır.
Serbest radikaller doku hasarı, diyabet, kalp-damar hastalıkları, alzheimer hastalığı,
parkinson, omurilik hasarları ve epilepsi gibi nörolojik hastalıkların oluşumunda rol
almaktadır [Mateuca ve ark., 2006].
18
Şekil 2.5. Karsinojenlerin metabolizmada oluşturduğu hasar ve kanser oluşumu
[http://www.nature.com]
2.1.4. Kolon kanseri
Sindirim sistemimizin kalın bağırsak kısmının en uzun bölümü kolondur. Kolon
yaklaşık 1,5 m uzunluktadır [Yeatman, 2001]. Kolon sırasıyla çekum, asendan kolon
(çıkan kolon), desendan kolon (inen kolon) ve sigmoid kolon olarak bölümlere ayrılır
(Şekil 2.6). Çekum, kalın bağırsağın ilk bölümü olup kolonun en geniş yeridir.
Asendan kolon, çekumdan başlayıp yukarı karaciğer sağ lob komşuluğuna kadar
yükselir. Desendan kolon (inen kolon) pelvis girişine kadar ki 25 cm’lik kolon
kısmıdır. Sigmoid kolon ise desendan kolonun devamıdır. Boyu çok değişken
olmakla birlikte 40 cm’dir [Keith ve ark., 2007].
19
Şekil 2.6. Kolonun bölümleri [http://healthycolontips.com]
Kolon kanseri, görülme sıklığı bakımından tüm kanserler arasında 4. sırada yer
almakta, erkek ve kadınlarda görülen kanserlerin yaklaşık % 10-15 ini
oluşturmaktadır [Hassen ve ark., 2012]. Bağırsakta kanser oluşumu, kolon ya da
rektum duvarının içinde ve astarlanma yoluyla gelişmeye başlar. Hücresel sıvı ve
atıkları taşıyan kanallar olan lenf damarları ya da kan damarlarında gelişebilen
kanserler duvarları istila ederler. Kanser hücreleri, enfeksiyonlarla mücadeleye
yardım eden lenf nodları yakınına süzülürler. Kanser hücreleri metastaz olarak
adlandırılan bu süreçlerle, kan veya lenfatik damarlar yoluyla vücudun diğer
bölümlerine taşınırlar [Kinzler ve Vogelstein, 1996].
20
Kolon kanser hücre hatları
Kolon kanser hücre hatlarından olan Caco-2 ve HT-29 hücreleri (Şekil 2.7) bağırsak
hücrelerinin farklılaşması ile karakterize edilir. Caco-2 hücreleri insan kolon
adenokarsinoma hücrelerinden izole edilmiş, özellikle insan bağırsak hücrelerinin
işlevleri ve organizasyonu, laktik asit bakterilerinin yapışması çalışmalarında
kullanılmıştır. İnsan kolon adenokarsinomasından izole edilen bir diğer hücre ise
HT-29 hücrelerdir. HT-29 hücreleri apikal ve bazal membran birbirinden dar bileşim
ile ayrılan iki nüfuz alanının biçimlenmesini içerir. Bu nüfuz alanlarında protein ve
lipit kompozisyonlarındaki farklılıktan kaynaklanan ultra yapısal farklılık göze
çarpmaktadır. Apikal yüzey (fırça kenar) peptidaz ve disakkaritleri, basolateral nüfuz
alanı ise intestinal hidroelektrik salgılanmasının kontrolünü gerektiren birkaç peptit
resöptörü içermektedir. Dar bileşim alanları ise, bu bölgeye özel proteinler içerir
[Sillanpaa, 2001; Gopal ve ark., 2001].
Şekil 2.7. HT-29 ve Caco-2 hücrelerinin mikroskobik görüntüsü. Sol taraftaki resim
HT-29 ve sağ taraftaki resim Caco-2 kanser hücrelerini göstermektedir
[http://www.lgcstandards-atcc.org]
21
2.1.5. Serviks kanseri
Serviks kanseri dünya üzerinde, her iki dakikada bir kadının ölümüne neden olan ve
değişik ülkelerde yapılan çalışmalara göre kadınlarda meme kanserinden sonra en sık
görülen ikinci kanserdir. Dünyada yıllık ortalama 83 100’ü gelişmiş ülkeler, 409
900’ü gelişmekte olan ülkelerde olmak üzere 493 bin kadının servikal kansere
yakalandığı ve 273 505 kadının bu hastalıktan hayatını kaybettiği bildirilmektedir.
Ülkemizde ise yapılan çalışmalar sonucu serviks kanserinin görülme sıklığı 100 000
de 3,96 olduğu bulunmuştur [Arvas, 2007].
Vücudumuzun üreme sisteminin önemli bir organı olan vajina; rektum, mesane ve
üretra arasında bulunmaktadır. Vajina uterusu vücudun dışına bağlayan yaklaşık 7-10
cm uzunluğunda bir tüptür (Şekil 2.8). Vajinal duvar üç tabakadan oluşmaktadır.
Bunlar epitelyal tabaka, orta kas tabakası ve dış fibröz tabakadır ve yeterli elastiklik
için üst üste katlanmıştır [Brannon-Peppas, 1993; Valenta, 2005]. Vajinal epitelyum,
müsinin doğrudan salgılandığı bir yer olmamasına rağmen ince bir sıvı film tabakası
ile kaplanmış olup genelde mukozal bir yüzey olarak nitelendirilmektedir [Vermani
ve Garg, 2000].
Şekil 2.8. Kadın ürogenital sistem [http://www.tupbebek-istanbul.com]
22
Normal vajina florası koliformlar, difteroidler, aerobik gram-pozitif koklar ve diğer
potansiyel patojen bakterileri de içeren geniş bir mikroorganizma çeşitliliğine
sahiptir [Vallor ve ark., 2001]. Vajinal mikroflorada en baskın mikroorganizmalar
Laktobasillerdir.
Florayı
oluşturan
diğer
mikroorganizmalar;
Bakteroides,
Peptokoklar, S. epidermitis, Korinobakteriler, Peptostreptokoklar, B ve D grubu
streptokoklar, E. coli ve Eubakteriumlar’ dır. Candida albicans ise vajen florasında
düşük miktarlarda bulunur. Ayrıca florada Gardnerella vaginalis ve Trichomonas
vaginalis de bulunmaktadır. Vajen florasında Neisseria gonorrhoeae, HSV (Herpes
Simplex Virus) ve HPV (Human Papilloma Virus) bulunmaz [Balcı ve Çapar, 2005].
Yapılan epidemiyolojik ve deneysel çalışmalarda serviks kanser gelişiminde insan
papilloma virüsü (HPV) ana etken olarak gösterilmektedir. HPV 72 kapsomerden
oluşan zarfsız çift katlı bir DNA virüsüdür. Virüs partikülü ısıya dayanıklı olup
DNA içeriği 5.2 milyon daltondur ve 8000 baz çiftinden oluşmaktadır [Arvas, 2007].
200 tip HPV sınıflandırılmıştır. Genital HPV’ler malign tümör indükleme
potansiyeline göre yüksek riskli tip, olası yüksek riskli tip ve düşük riskli tip olarak
sınıflara ayrılmışlardır [Duenas Gonzalez ve ark., 2005]. Düşük onkojenik risk
grubundaki HPV tipleri servikal lezyon ve genital siğillerden sorumludur. Yüksek
riskli HPV tipleri ise, servikal kanserlerin ve onun öncüsü olarak kabul edilen
prekanseröz, sukuamöz intraepitelyal lezyonların % 99,7’ sinde saptanmaktadır
[Somer, 2009; Trottier ve Franco, 2006].
HPV’ler insanda primer olarak epitel hücreleri ve mukozayı enfekte etmekte; deri ve
mukozalarda bazal tabakalardan başlayarak sıklıkla servikal transformasyon zonunda
(vajina ve serviks epitel hücrelerinin birbiri ile birleştiği yer) çeşitli lezyonlar
oluşturmaktadır. Düşük riskli HPV tipleri (özellikle HPV-6 ve HPV-11) genital
siğiller ve lezyonlara neden olurken, yüksek riskli HPV tipleri servikal, vajinal, anal
karsinomayı da içine alan çeşitli kanserlerin gelişiminde doğrudan ya da dolaylı
olarak rol oynayabilmektedir [Kanbur ve Çapık, 2011]. Serviks kanserine neden olan
faktörler arasında düşük sosyoekonomik düzey, sigara içimi, ırk, erken yaşta cinsel
ilişki, çok sayıda cinsel eş, doğum sayısının fazlalığı yer tutmaktadır [Güner ve
Taşkıran, 2007; Akhan, 2007; Eren, 2007].
23
Serviks kanser hücre hattı
1951 yılında Amerika Birleşik Devletleri Baltimore’da servikal kanser nedeni ile
takip edilen Afrika kökenli Amerikalı bir kanser hastasının kanser dokularının
laboratuvarda kültürü yapılmıştır. Henrietta Lack adındaki bu kanser hastası kanserin
metastaz yapması sonucu hayatını kaybetmiştir, ancak laboratuvarda kültürü yapılan
kanser hücrelerinin adı hastanın ad ve soyadının harfleri olan ‘‘HeLa’’ adı serviks
kanser hücre hattı olarak isimlendirilmiştir. Bu kanser hücrelerinin ölümsüz olması
ve çok kolay üretilebilmeleri antikanserojenik çalışmalar başta olmak üzere birçok
çalışmada kullanımına hız kazandırmıştır. İnsan serviks kanser hücre hattı olan HeLa
hücresi (Şekil 2.9) köken olarak epitel bir hücredir. Bu kanser hücreleri yüzeye
tutunarak gelişmektedirler [Rahbari ve ark., 2009; Batts, 2010].
Şekil 2.9. HeLa kanser hücre hattınının mikroskobik görüntüsü
[http://www.lgcstandards-atcc.org]
24
2.2. Kanser Tedavisinde Kullanılan Yöntemler
Kanser, son zamanlarda görülme sıklığı ve ölüm oranı hızla artan bir hastalıktır.
Ölüme neden olan hastalıklar sıralamasında yüzyılın başlarında 7., 8. sıralarda yer
alırken bugün birçok ülkede kardiyovasküler hastalıklardan sonra ikinci sırayı
almaktadır [Haydaroğlu, 2007]. En sık görülen kanser türleri erkeklerde akciğer,
kolorektal ve prostat kanseri iken; kadınlarda ise meme, kolorektal ve serviks
kanseridir [WHO, 2008].
Kanserde yaygın olarak kullanılan tedavi yöntemleri cerrahi, kemoterapi (ilaç) ve
radyoterapidir. Bu yöntemler başarılı olmakla birlikte organ kaybı, kanserin
tekrarlama riski ve tüm kanser tiplerine uygulanamaması gibi bazı dezavantajlara da
sahiptir. Radyoterapi yönteminde kanserli hücreler, spesifik frekans bandında ve
spesifik şiddette radyasyon ile yakılırlar. Bu süreç zarfında kanserli hücrelerin
yanında sağlıklı hücrelerin de zarar görmesi, tüm kanser hücrelerine radyasyon
dağılımının eşit yoğunlukta olmaması ve radyasyona maruz kalan dokuda fonksiyon
kaybı oluşması bu yöntemin dezavantajlarını oluşturmaktadır. Kemoterapide ise
kanserli hücrelerin toksik etkisi bulunan ilaçlar ile öldürülmesi, kanserli hücrelerin
bölünmesini sağlayan mekanizmaların ortadan kaldırılması hedeflenmektedir [Nehru
ve Singh, 2008]. Klasik kemoterapi ilaçları vücutta hedefe yönelik hareket
etmemekte ve kullanılan ilaçlar kanserli hücreler üzerinde etki göstermesinin yanı
sıra sağlıklı hücrelere de etki etmektedir. Ayrıca kanserli hücrelere, tedavi için
gereken dozlar da tam olarak ulaşmamaktadır [Chen ve ark., 2009]. Kemoterapi
tedavisi, kanserli hastanın bağışıklık sistemini güçsüzleştirmekte ve hasta, diğer
hastalıklara daha duyarlı duruma gelmektedir. Bu önemli yan etkiler, kemoterapi
ilaçlarının dokuya özgü etki göstermemesinden de kaynaklanmaktadır [Oylar ve
Tekin, 2011].
Bu yöntemlerin mevcut ilaç ve kombinasyonları ile birçok kanser türünde tedaviyi ya
hiç sağlamaması ya da yetersiz kalması, sonuçta bu kanser türlerinde ölüm oranının
oldukça yüksek olması, kullanımda olan ilaçların önemli yan etkileri ve diğer
25
dezavantajlarının giderilememiş olması nedeni ile araştırmacılar yeni yöntemler
araştırmaktadırlar [Gilman ve Goodman, 1991; Akgün ve ark., 2000].
Son zamanlarda kanserde tamamlayıcı ve özellikle alternatif tedaviler üzerine
araştırmalar yapılmaktadır. Tamamlayıcı tedavi bilimsel tıbba destek amacı ile
yapılan tedavilerdir. Bu tedavi yaşam kalitesini geliştirmek, semptomları ve
kullanılan ilaçların yan etkilerini azaltmak, fiziksel ve psikolojik destek sağlamak
amacıyla uygulanmaktadır. Alternatif tedavi ise, bilimsel tıbbi uygulamalar yerine
yapılan ve etkisi bilimsel olarak tam anlamıyla kanıtlanmamış tedavilerdir [Ernst ve
Cassileth, 1998].
Tamamlayıcı ve alternatif tedaviler, alternatif ve medikal sistemler (geleneksel Çin
tıbbi ve ayurveda gibi kültürel kökenli sistemler), beden-zihin müdahaleleri (müzik
terapi, psikolojik görüşmeler, dua), biyolojik temelli tedaviler (bitkiler, diyet destek
ürünleri, tıbbi bitki çayları), beden temelli tedaviler (masaj), enerji tedavileri (reiki,
elektromagnetik terapiler) olarak gruplandırılmaktadır [Özçelik ve Fadıloğlu, 2009].
Gelişmiş ülkelerde kanser hastalarında tamamlayıcı ve alternatif tedavilerin
kullanımı; Amerika’da % 42,1, Avustralya’da % 48,2, Fransa’da % 49,3, Kanada’da
% 70,4 iken, gelişmekte olan ülkelerde ise Kolombiya’da % 40, Çin’de % 70, Şili’de
% 71 ve Afrika ülkelerinde % 80 oranındadır [Bodeker ve Kronenberg, 2002].
Ülkemizde kanser hastalarında tamamlayıcı ve alternatif tedavilerin kullanımı ile
ilgili yapılmış çalışmalar mevcuttur. Bu tedavilerin kullanım sıklığını Gözüm ve
arkadaşları % 41,1, Taş ve arkadaşları % 47,3, Samur ve arkadaşları % 50, Ceylan ve
arkadaşları % Oğuz ve Pınar % 80,2, oranlarda bulmuşlardır [Algier ve ark., 2005;
Kav ve ark., 2008].
Günümüzde kanser tedavisinde kullanılan ilaçların birçoğunun etken maddesi doğal
kaynaklardan elde edilmektedir. Bu doğal kaynakların büyük kısmını ise çok çeşitli
kimyasal maddeler sentezleyebilen bitkiler oluşturmaktadır. Bitki kimyasalları
antikanser etkilerini karsinojen inaktivasyonu, antiproliferasyon, hücre döngüsünün
askıya alınması, apoptoz ve farklılaşmanın indüksiyonu, anjiyogenezin baskılanması,
26
antioksidasyon ve çoklu ilaç direncinin azaltılması gibi mekanizmalar ile
göstermektedir [Vauzour ve ark., 2010].
2.3. Kanser Tedavisinde Alternatif Olabilecek Bitkisel Kaynaklar ve Bileşenleri
Fitokimyasallar (bitki kimyasalları) yenilebilir meyve ve sebzelerde bulunan
bileşiklerdir [Tripoli ve ark., 2007]. Yunancada “Fito” bitki, “kimyasal” ise
bitkilerde doğal olarak oluşan kimyasal bileşikleri ifade etmektedir. Kanser, diyabet,
koroner kalp hastalığı, inflamasyon, viral ve parazitik hastalıklara karşı
fitokimyasalların faydalı etkileri ile ilgili yapılan bilimsel çalışmalar hız
kazanmaktadır [Coşkun, 2005].
Fitokimyasallar primer ve sekonder metabolitler olarak iki gruba ayrılır. Primer
metabolitler, bitkilerde fotosentez sonucu oluşurlar. Amino asitler, klorofil yağlar,
proteinler
ve
karbonhidratlar
gibi
bileşikler
primer
metabolitler
olarak
isimlendirilmektedir. Doğada yaygın bulunan primer metabolitler, yüksek bitkilerin
tohum ve vejetatif dokularında fazla miktardadır. Bitkinin büyümesi, gelişimi,
metabolizması veya savunması ile ilgili görevlerinden dolayı bitkinin fizyolojik
gelişimi için önemlidir. Sekonder metabolitler ise, primer metabolitlerden biyosentez
yol ile üretilmişlerdir. Şekil 2.10’ da görüldüğü gibi bitki için gerekli olan ve
fotosentezde görev alan primer metabolitlerden üretilen sekonder metabolitler çeşitli
bileşikleri içermektedirler. Bu metabolitler herbivor, bakteri ve fungal patojen
tehlikelerine karşı bitkiyi korur, tozlaşmaya yararlı olan organizmaları bilhassa
böcekleri kendilerine çekerler ve simbiyotik ilişkilerde görev alırlar. Işık, ultraviyole,
su, mineral madde ve sıcaklık değişimleri gibi abiotik stres unsurlarına karşı bitkiyi
korurlar [Oskay ve Oskay, 2009].
27
Şekil 2.10. Bitkilerde bulunan primer ve sekonder metabolitler [Oskay ve Oskay,
2009]
Fazla sayıda bileşik içeren sekonder metabolitler içinde bulunan fenolik bileşikler,
sahip oldukları görevler sebebi ile büyük önem taşımaktadırlar. Fenolik bileşiklerin
insan sağlığı üzerindeki olumlu etkileri araştırılmıştır. Bu bileşikler özellikle
antimikrobiyal ve antikanser etkileri ile ön plana çıkmıştır. Buna ek olarak fenolik
bileşiklerin, nükleik asitlere, somatik hücrelere ve bağışıklık sistemine saldırarak
çeşitli hasarlara sebep olan serbest radikal gibi bileşikleri kendilerine bağlayıp güçlü
antioksidan etki gösterdikleri kaydedilmiştir [Çetin, 2010].
28
Tüm bitkiler çok çeşitli sekonder metabolitler üretmektedirler. Bu metabolitlerin en
önemli gruplarından birisi fenolik bileşiklerdir [Michalak, 2006]. Bu bileşikler
bitkilerde fizyolojik ve morfolojik olarak önem arz etmektedirler [Ignat ve ark.,
2011]. Fenolikler, en az bir hidroksil grubu (OHˉ) ve bunun fonksiyonel gruplarını
içeren aromatik halkalı bileşiklerdir [Dai ve Mumper, 2010]. Fenolik bileşikler,
fenolik asitler ve flavonoidler olmak üzere iki gruba ayrılırlar [Nizamlıoğlu ve Nas.,
2010]. Fenolik asitler hidroksisinnamik ve hidroksibenzoik asitler olarak iki gruba
ayrılırlar. C6-C1 fenilmetan yapısında olan hidroksibenzoik asitler, bitkisel gıdalarda
eser miktarda bulunurlar. Bunlar vanilik asit, gallik asit, m-hidroksibenzoik asit,
salisilik asit gibi asitlerdir. C6-C3 fenilpropan yapısında olan hidroksisinnamik
asitlerin yaygın bulunanları; o-kumarik asit, p-kumarik asit, kafeik asit ve ferulik
asitlerdir [Nizamlıoğlu ve Nas., 2010].
2.3.1. Flavonoidler
Flavonoidlerin biyolojik aktiviteleri ile ilgili yapılmış ilk çalışma 1936 yılında SzentGyorgyi ve Rusznyak tarafından yayınlanmıştır. Flavonoidler, en büyük polifenol
grubudur [Çapanoğlu Güven ve ark., 2010]. Flavonoidler flavan çekirdeği ve C6-C8C6 karbon iskeleti ile karakterize edilen sekonder metabolitlerdir. Flavonoidlerin
temel yapısı iki benzen halkasının (A ve B) bir heterosiklik piren halkasına (C)
bağlanması ile oluşmaktadır [Sandhar ve ark., 2011]. Merkez C halkasının
oksidasyon durumuna göre flavonoidler altı gruba ayrılırlar: flavonlar, flavonoller,
flavanonlar, flavononlar, izoflavonlar ve antosiyanidinler [Dai ve Mumper, 2010].
Flavonoidler yapısında 4000’den fazla polifenolik bileşiği barındıran ve bitkisel
kaynaklı besinlerde doğal olarak bulunan bir gruptur [Huang ve ark., 2009]. Tüm
hücre içinde, bitki dokularında ya da çeşitli bitkisel organların yüzeyinde bulunan
flavonoidler bitkilerde çoğunlukla glikozit formları halinde olup aglikon formlarına
(şeker kısmını içermeyen form) ise daha az rastlanılmaktadır [Çapanoğlu Güven ve
ark., 2010]. Flavonoidler çok sayıda meyve, sebze, aromatik ve tıbbi bitkilerde, çay
ve kırmızı şarapta bulunmaktadır [Gibellini ve ark., 2011]. Yapılan çalışmalarda
29
baharatlar ve test edilmiş tıbbi bitkilerde zengin flavonoid içerikleri bulunmuştur.
Bazı bitkilerde ve gıdalarda bulunan flavonoidler Çizelge 2.3’de verilmiştir.
İnsan beslenmesinin bir parçası olan flavonoidlerin insan sağlığı üzerine yararlı
etkileri vardır. Başta antikanser özellikleri olmak üzere antiviral, antioksidan
antiinflamatuvar gibi çeşitli özelliklere ve serbest radikal süpürücü gibi çeşitli
aktiviteye sahiptirler.
Çizelge 2.3. Bazı bitkilerde ve gıdalarda bulunan flavonoidler [Sandhar ve ark.,
2011; Ren ve ark., 2003]
Bazı flavonoidler
Bitki türleri
Gıda kaynağı
Luteolin, apigenin, kirisin
Aloe vera,
Kekik, maydonoz
Mentha longifolia
Kuersetin, kamferol,
Azadirachta indica, Soğan, brokoli, elma, kiraz
mirisetin, rutin
Betula pendula,
Tilia cordata
Kateşin, (-)-epikateşin
Brysonima crassa
Elma, çay
Daidzein, genistein
Butea
Bakliyatlar
monospermea
Hesperitin, naringenin
Citrus medica
Turunçgiller
Flavonoidlerin Etki Mekanizmaları
Flavonoidler serbest radikal süpürücü, karsinojen metabolizmasının düzenleyici,
hücre proliferasyonu ve farklılaşmasında tümör süpresör ve onkogenlerinin gen
ekspresyonu ve apoptozun indükleyici, antioksidan aktivitesi, hücre çoğalmasını
inhibe etmesi, antialerjen, antibakteriyel, antiviral, sitotoksik, antitümör ve
antiinflamatuvar gibi sahip olduğu özellikler ile araştırmacıların ilgisini çekmektedir
[Huang ve ark., 2009; Sandhar ve ark., 2011].
30
Sağlığa yararlı etkilerinden dolayı kansere karşı tedavi edici ajan ya da kanser
gelişimini engelleyici olarak kullanımları mümkün olabilmektedir. Çizelge 2.4’ de
flavonoidlerin kansere karşı inhibitör özellikleri ile ilgili toplanan veriler
özetlenmiştir [Ren ve ark., 2003].
Çizelge 2.4. Farklı kanser hücre hatları üzerine antikanser özellik gösteren
flavonoidler [Ren ve ark., 2003]
Kanser tipi
Kanser hücre hattı
İnsan oral kanser
HSC-2, HSG, SCC- Epigallokateşin gallat (EGCG),
Flavonoid
Epigallokateşin (EGC),
25
Genistein, Epikateşin galat(ECG),
Kuersetin
İnsan meme kanseri
MCF-7
Flavanonlar, Daidzein, Genistein,
Kuersetin, Luteolin
İnsan tiroid kanseri
ARO, NPA, WRO
Genistein, Biochanin A,
Apigenin, Kamferol, Kirisin,
Luteolin
İnsan akciğer kanseri SK-LU1, H661,
Flavon, Kuersetin
A549 SW900, H441
İnsan prostat kanseri
LNCaP, PC3,
Genistein, Kuersetin, Epikateşin
DU145
Kateşin, Kamferol, Luteolin,
Apigenin
İnsan kolon kanseri
İnsan lösemi
Flavonoidlerin
Caco-2, HT-29,
Flavon, Antosiyanin, Kuersetin,
HCT-15, IEC-6
Genistein
HL-60, K562, Jurkat
Apigenin, Kuersetin, Mirisetin
karsinojen
metabolizmasına
etki
eden
enzimleri
uyarması
karsinojenleri uzaklaştırıcı bir mekanizmadır. Bu mekanizma kanseri tetikleyebilecek
kimyasal maddeler, ilaçlar, insektisitler, petrol ürünleri vb. prokanserojen maddeleri
enzimler aracılığıyla oksidasyon, redüksiyon gibi işlemler ile metabolize eden
31
sistemlerdir. Faz I ve Faz II enzim grupları metabolize edici enzimlerdir. Faz I
enzimleri ile gerçekleşen metabolizmada sitokrom P450 enzimleri (CYP) büyük
ölçüde rol oynamaktadırlar. Flavonoidlerin mevcut P450 izoenzimleri olan CYP1A2
enzimlerinin aktivitelerini inhibe ederek karsinojenlerin aktivasyonu ile hücresel
hasarın indüklenmesine karşı koruyucu etkileri olduğu söylenebilir. Bir diğer
mekanizma ise karsinojenlerin detoksifiye edilmesini sağlayan Glutatyon-Stransferaz, kinon redüktaz ve UDP-glukuronil transferaz gibi faz-II metabolize edici
enzimlerin indüksiyonudur. Bu da, karsinojenlere karşı flavonoidlerin kanser
gelişimini engelleyici etkilerini açıklamaya yardımcı olmaktadır [Chahar ve ark.,
2011]. Şekil 2.11’ de flavonoidlerin kansere karşı etkisi anlatılmaktadır.
Kanser, normal hücrelerin mutant hücrelere dönüşümü ile başlar. Bu hücreler tümör
artışına bağlı olarak iyi huylu tümör hücrelerine dönüşürler. Flavonoidler bu sürecin
farklı basamaklarında rol oynamaktadırlar. Kamferol, biochanin A gibi bazı
flavonoidler faz I enzimleri (ağırlıklı olarak CYP) aracılığı ile prokarsinojenlerin
metabolik aktivasyonunu inhibe edebilme özelliğindedirler. Bundan dolayıdır ki bu
alanlar tümör oluşumunu bloke ederler. Alternatif olarak naringenin, kuersetin gibi
diyetle alınan flavonoidler faz II enzimlerin uyarılması ile karsinojenlerin
detoksifikasyonuna yardım eder. Genistein ve epigallokateşin gallat (EGCG) gibi
flavonoidler hücre siklusu, anjiyogenezis, invazyon ve apoptozu etkileyerek kanserin
sonuncu basamağını baskılar [Moon ve ark., 2006] .
32
Şekil 2.11. Flavonoidler aracılığı ile kanserin baskılanması [Moon ve ark., 2006]
Flavonoidlere ilişkin epidemiyolojik veriler incelendiğinde yüksek miktarda
flavonoid alımı ile düşük kanser riskinin korelasyon gösterdiği göze çarpmaktadır.
Şangay’da 2000-2002 yılları arasında yapılmış olan bir çalışmada 250 meme kanserli
hastadan ve eşlenmiş kontrollerinden alınan idrar örneklerinde toplam flavonoid
miktarları karşılaştırılmış ve kanserli hastaların idrar örneklerinde daha az miktarda
flavonoid saptanmıştır [Ren ve ark., 2003]. Bu çalışma flavonoidlerin meme
kanserinden korunmadaki potansiyel rolünü ortaya koymaktadır. Çoğu flavonoidin
insan kanser hücre hatları üzerinde proliferasyonu engelleyici özellikler gösterirken
normal insan hücrelerine çok az toksik etki gösterdiği ya da hiç toksik etki
göstermediği bildirilmiştir.
33
Antiproliferasyon etki ile ilgili moleküler mekanizma, tümör oluşumuna yol açan
prooksidan sürecin baskılanması ile ilişkili olabilmektedir. Büyümeyi teşvik edici
reaktif oksijen türevleri (ROT) gibi oksidanlar tümör oluşumunun ve gelişim
evrelerinin başlıca katalizleyicileridir. Prooksidan enzimler çeşitli karsinojenler
tarafından aktive edilir. Örnek olarak forbol esterleri, siklooksijenazları (COX) ve
lipooksijenazları (LOX) da içeren araşidonat metabolize enzimler gösterilebilir.
Flavonoidler özellikle ksantin oksidazı, COX ya da LOX2’u inhibe etmede etkindir.
Böylece tümör hücre proliferasyonunu da inhibe etmektedirler [Ren ve ark., 2003].
Flavonoidlerin
antiproliferatif
etkilerinde
bir
başka
mekanizma
poliamin
biyosentezinin inhibisyonudur. Ornitin dekarboksilaz, poliamin biyosentezinde
sınırlayıcı enzimdir ve çeşitli dokularda DNA sentezi ve hücre proliferasyonu ile
korelasyon göstermektedir. Çeşitli deneyler, flavonoidlerin tümör promoterleri
tarafından indüklenen ornitin dekarboksilazı inhibe edebileceğini göstermiştir.
Bunun sonucunda da, poliamin seviyelerinde düşüş ve DNA/protein sentezinde
inhibisyon gözlenir [Chahar ve ark., 2011].
Hirano ve arkadaşları (1994) insan akut myeloid lösemi hücre hattı üzerine (HL-60)
28 flavonoidin antikanser etkisini incelemişlerdir. Dört klinik antikanser ajanı ile
birlikte bu bileşiklerin antiproliferatif etki ve sitotoksisitesi arasındaki farklılıkları
araştırmışlardır. 28 flavonoidden 8’ i 10-940 ng/ml’ den başlayan IC50 değeri ile HL60 hücreleri üzerine önemli derecede süpresör etki göstermiştir [Hirano ve ark.,
1994].
Knutz ve arkadaşları (1999) Caco-2 ve HT-29 kolon kanser hücre hatlarında 30 dan
fazla flavonoidin hücre proliferasyonu ve sitotoksik etkisine bakmışlardır.
Bileşiklerin hemen hemen hepsi sitotoksik etki olmadan antiproliferatif etki
göstermiştir.
2.4. Antioksidan Bileşikler ve Antioksidan Savunma Sistemi
Antioksidanlar;
oksidatif
stresi
azaltarak
ve
serbest
radikalleri
süpürerek
oksitlenebilen maddelerin oksidasyonunu önleyebilen ve geciktirilmesini sağlayan
34
bileşikler olarak tanımlanırlar [Dai ve Mumper, 2010]. Vücutta reaktif oksijen
türevlerinin oluşumunu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek üzere
enzimatik ve enzimatik olmayan birçok antioksidan savunma mekanizması
bulunmaktadır [Öğüt ve Atay, 2012]. Antioksidan savunma mekanizmasını birinci
olarak peroksidaz ve metal bağlayan proteinlerin süpresyonu ile serbest radikallerin
oluşumunu önleyebilen antioksidanlar oluşturur. İkincisini vitamin E ve C gibi
radikal-temizleyici antioksidanların oksidasyonu, zincirinin başlamasını engellemesi
ve zincirleme reaksiyonların yayılımının önlenmesi oluşturmaktadır. Üçüncüsünü
onarma ve eski haline getirmeye çalışan lipaz, proteaz, DNA onarıcı enzimler ve
transferaz gibi onarıcı ve yeniden yapılandırıcı enzimler oluşturur. Şekil 2.12’de
antioksidan çeşitleri ve serbest radikallerin oluşturduğu oksidatif strese karşı
antioksidan savunma mekanizması gösterilmektedir [Willcox ve ark., 2004].
RADİKAL SÜPÜRÜCÜ
ANTİOKSİDANLAR
KORUYUCU
ANTİOKSİDANLAR
ONARICI
ANTİOKSİDANLAR
- SOD
- Vitamin C
- Vitamin E
- Lipaz
- GPX
- Ürat
- Karotenoidler
- Proteaz
- Albümin
- Flavonoidler
- DNA
onarıcı
enzimler
Radikal
Zincir
Kırık
oluşumunun
başlangıcının
yayılımı/zincir
Dokuların yeniden
durdurulması
durdurulması
sonlanması
yapılanması
Başlatıcı
Hasar
Serbest Radikal Oluşumu
zincir
Lipid Radikali
Hasar
onarımı,
Zincir Oksidasyonu
Hastalık Oluşumu.
Şekil 2.12. Antioksidan grupları ve antioksidan savunma mekanizmaları [Willcox ve
ark., 2004]
35
Genel olarak antioksidan etki mekanizması aşağıdaki gibidir [Gutteridge ve
Halliwell, 1994]:
1. Serbest radikal oluşumunun önlenmesi;
 Başlatıcı reaktif türevleri uzaklaştırıcı etki,
 Oksijeni uzaklaştırıcı ve konsantrasyonunu azaltıcı etki,
 Katalitik metal iyonlarını uzaklaştırıcı etki,
2. Oluşan serbest radikallerin etkisiz hale getirilmesi;
 Temizleyici (scavenging) etki: Reaktif oksijen türevlerini etkileyerek onları tutma
veya çok daha az reaktif başka bir moleküle çevirme,
 Bastırıcı (quencher) etki: Reaktif oksijen türevleri ile etkileşip, onlara bir proton
ekleyerek aktivite kaybına neden olma,
 Zincir kırıcı (chain breaking) etki: Reaktif oksijen türevlerini ve zincirleme
reaksiyonları başlatacak diğer maddeleri kendilerine bağlayıp, zincirlerini kırarak
fonksiyonlarını önleyici etki.
Antioksidanlar, enzimatik ve enzimatik olmayan antioksidanlar olarak iki gruba
ayrılmaktadırlar. Enzimatik antioksidanlar Süperoksit Dismutaz (SOD), katalaz
(CAT), selenyum bağımlı glutatyon peroksidaz (GPx), glutatyon-S-transferaz (GST),
glutatyon redüktaz (GR) dır [Gümüştaş ve Atukeren, 2008]. Katalaz (CAT) enzimi
her biri bir prostetik grup olan ve yapısında Fe+3 bulunduran dört hem grubundan
oluşmuş bir hemoenzimdir. Peroksizomlarda lokalize olan bu enzimler süperoksit
dismutazın (SOD) oluşturduğu H2O2’i katalaz peroksidazlar ile beraber suya ve
oksijene
parçalar.
Düşük
konsantrasyonlarda
H2O2’i
glutatyon
peroksidaz
parçalarken yüksek konsantrasyonlarda katalaz aktivite kazanır. Katalaz aktivitesi
böbrek, eritrosit ve karaciğerde yoğundur [Husain ve Kumar, 2012; Memişoğulları,
2005]. Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) enzimi redükte glutatyonu yükseltgerken
H2O2’i suya çevirir. Böylelikle membran lipidlerini ve hemoglobini oksidan strese
karşı korur. Ayrıca E vitamini yetersiz olursa membranı peroksidasyona karşı korur
[Memişoğulları, 2005]. Yapısında bakır, çinko ve magnezyum iyonu bulunduğundan
metaloenzim olarak da adlandırılan SOD, süperoksidin hidrojen perokside
36
dismutasyonunu katalize eden bir enzimdir [Çavdar ve ark., 1997]. Üç tür SOD
vardır. Birincisi mitokondride lokalize Mn-SOD, ikincisi sitozolde lokalize Cu-Zn
SOD ve üçüncüsü de Cu içeren ve plazmadaki süperoksit radikallerini metabolize
eden vasküler endotele bağlı Cu-SOD’dur. SOD’un katalizlediği süperoksitin
hidrojen peroksite dismutasyonu, süper oksit radikalinin anyon ve katyon formlarının
eşit oranda bulunduğu pH 4,8’de kendiliğinden oluşur [Memişoğulları, 2005].
Enzimatik olmayan antioksidanlardan vitamin C (askorbik asit), indirgeyici
özelliğinden dolayı güçlü bir antioksidandır. Lipit peroksidasyonunu başlatan
radikallerin etkilerini yok ederek, lipitleri oksidasyona karşı korumaktadır.
Antioksidan etkisi yanında organizmada fenton reaksiyonunda ferri demiri ferro
demire indirgeyerek hidrojen peroksit ile etkileşmeye uygun olan süperoksit
radikalinin üretimine neden olur. Bu nedenden dolayı serbest radikal reaksiyonlarının
önemli bir katalisti veya bir prooksidan olarak değerlendirilir [Montezano ve Touyz,
2011; Üzümlüoğlu Coşkun, 2008]. Vitamin E (α-tokoferol) çok güçlü bir enzimatik
antioksidandır. En önemli işlevi membran fosfolipitlerinde bulunan çoklu doymamış
yağ asitlerini serbest radikal etkisinden koruyan ilk savunma hattını oluşturmaktır.
Vitamin E süperoksit ve hidroksil radikallerini, singlet oksijeni, lipit peroksit
radikallerini ve diğer radikalleri indirger. Vitamin E zincir kırıcı antioksidan olarak
bilinir. Lipit peroksidasyonu zincir reaksiyonu vitamin E vasıtası ile sonlandırılabilir.
Yaşlılarda
vitamin
E
ve
C
verilmesinin
ortalama
kan
lipit
peroksit
konsantrasyonlarında bir azalma sağladığı saptanmıştır. Glutatyon peroksidaz ile
vitamin E, serbest radikallere karşı birbirlerini tamamlayıcı etki gösterirler.
Glutatyon peroksidaz oluşmuş peroksitleri ortadan kaldırırken, vitamin E
peroksitlerin sentezini engellemektedir [Niki, 2013; Üzümlüoğlu Coşkun, 2008].
Flavonoidler serbest radikalleri yok edici, güçlü antioksidan ve iltihaplanmayı
önleyici etkiye sahiptirler [Sandhar ve ark., 2011]. Bu bileşikler peroksi radikalleri
ile reaksiyona girmeleri sonucunda elektron transferi yoluyla hidroksil ve süperoksit
radikallerini yakalayarak lipid peroksidasyonunu engellerler [Ferreira ve ark., 2010].
Hidrojen verici bir serbest radikal yakalayıcısı olarak görev yapan flavonoidler bu
fonksiyonlarını B halkasındaki kateşol yapısının, radikal forma daha yüksek bir
37
stabilite kazandırması ile, C halkasındaki çift bağların elektronlarının yer
değiştirmesi ile, 3ı ve 5ı hidroksil gruplarının yüksek radikal yakalama gücü ile
gerçekleştirmektedir [Hirano ve ark., 2001]. Gıdalarda doğal antioksidanların
kullanımı ile ilgili birçok çalışma yapılmaktadır. İçerisinde yüksek miktarda kateşin,
antosiyanidin flavonoidleri bulunduran üzümsü meyvelerde antioksidan etkinin
oldukça fazla olduğu bulunmuştur [Wang, 1997; Wang ve Stretch, 2001]. Sharififar
ve arkadaşları (2009), Teucrium polium’ un metanol ekstraktının antioksidan
aktiviteleri olduğunu rapor etmiş ve apigenin ve rutinin beta-karotenin oksidasyonu
ve lipid peroksidasyonun güçlü inhibitörleri olduğunu bulmuştur. Braca ve
arkadaşları (2002) Licania licaniaeflora’ nın yapraklarından bazı flavonoidleri izole
etmişler ve kuersetin türevlerinin güçlü antioksidan aktiviteye ve flavonon 8hidroksi-naringen ve kamferol 3-O-α-rhamnositin düşük antioksidan aktiviteye sahip
olduğunu bildirmişlerdir. Salucci ve arkadaşları (2002) diyetle alınan epikateşin,
apigallokateşin, gallik asit, kuersetin-3-glukozit flavonoidlerinin güçlü antioksidan
aktiviteye sahip olduğunu rapor etmişlerdir [Sandhar ve ark., 2011].
2.5. Kanserde Hücresel ve Moleküler Düzeyde Apoptoz Mekanizması
Organizmada hücre ölümünün iki tipi vardır: bunlar nekroz ve apoptozdur
[Thompson, 1995; Ameisen, 1996]. Nekroz, hücre şişmesi ve hızlı dejenerasyon
olarak tanımlanır. Nekroz mekanizması şu şekilde gerçekleşmektedir: Dışarıdan
fiziksel ve kimyasal uyarılar (ısı, yanma, toksik maddeler) olduğunda bu uyarılar
sonucu hücrenin iyon dengesi bozulur ve DNA tamirinden sorumlu nuklear enzim
olan PARP (Poli ADP-riboz polimeraz) enzimi NAD kaybına neden olur. Bu
durumda gerçekleşen ATP eksikliği, iyon pompası yetersizliğine yol açar. Böylece
hücre sıvı alır ve organeller şişer. Bunun sonucunda ise plazma membran bütünlüğü
bozulur ve osmotik basınç nedeni ile hücre patlar. Hücre ölümünü takiben hücre
içeriğinin hücreler arası boşluğa salınması yangı (inflamasyon, iltihaplanma) olayına
sebep olur. Bu olayın karakteristik özelliği makrofaj ve nötrofillerin nekrotik dokuya
göç etmesidir. Göç eden bu hücreler nekrotik dokuyu fagosite eder. Bu nedenle
enflamasyon nekrozun önemli bir işareti olarak görülmektedir [Golstein ve Kroemer,
38
2007; Nicotera ve ark., 2004]. Apoptoz terimi ise ilk olarak Kerr ve arkadaşları
(1972) tarafından fizyolojik hücre ölümü olarak tanımlanmıştır [Kandaş, 2004].
Apoptoz mekanizması, normal gelişim sırasında ve olgun organizmadaki çeşitli
hücre tiplerinin tahribi esnasında spesifik hücrelerin kaybından sorumludur.
Apoptotik hücre sayısı kişinin ya da organizmanın sağlıklı ya da hasta oluşunu
belirlediği için apoptozun mekanizmaları hücrede denge unsuru olmaktadır [Kwon
ve ark., 2006]. Çok hücreli organizmalarda, hücredeki genetik hasarın bloke edilmesi
ya da hücrenin tamamen yok edilmesi apoptoz ile gerçekleşir. Hasarın yayılması ve
tümör oluşumu gibi olasılıklar engellenmiş olur. Apoptoz ani gerçekleşen hızlı bir
olaydır. Apoptotik bir uyarı sonrasında önce hücre zarında değişimler meydana gelir
ve bunun sonucunda hücre zarı degredasyona uğrayarak zamanla küçülür ve
apoptotik cisimcikler oluşur (Şekil 2.13) [Altunkaynak ve Özbek, 2008].
Şekil 2.13. Apoptoza maruz kalan bir hücrede hücre ölümünün aşamaları
[Altunkaynak ve Özbek, 2008; http://ajprenal.physiology.org]
39
Apoptotik cismin oluşumuna kadar bütün apoptotik olaylar zinciri birkaç dakika
sürer. Bununla birlikte apoptotik hücrelerin (Şekil 2.14) fagositozu için daha uzun bir
zaman gerekir [Altunkaynak ve Özbek, 2008].
Şekil 2.14. Hücrede gerçekleşen apoptozun ardından oluşan apoptotik cisimlerin ışık
mikroskobik görünümü. Oklar; hücre içerisinde görülen lipid
damlacıklarını, ok başı; heterokromatik ve koyu eozinofil sitoplazmalı bir
hücreyi, yıldız; apoptotik cisimleri işaret etmektedir [Özbek ve Özbek.,
2003]
2.5.1. Apoptozun moleküler mekanizması
Kanser, onkogenlerin tümör süpresör genlerinin mutasyonundan kaynaklanan
genetik bir rahatsızlıktır. Apoptoz, DNA’da meydana gelen hasar onarılamadığı
durumda gerçekleşen hücre ölüm tipidir [Ouyang ve ark, 2012]. Apoptoz olayının
gerçekleşmesi esnasında gözlenen genetik olaylar, hem toksik ilaçların hücre
ölümünü bu yolla gerçekleştirmesinden, hem de bu işlemde tümör supresör genler ile
40
onkoproteinlerin
birlikte
iş
görmesi
açısından
önemlidir.
Apoptozun
mekanizmasında belli aşamalar görülür; ölüme karar verme, hücre ölümünü
gerçekleştirme, parçalanma ve fagositoz [Altunkaynak ve Özbek, 2008].
Apoptoz, iki ana yolak ile gerçekleşir, dış apoptotik yolak (ekstrensek) – ölüm
reseptörleri yolağı ve iç apoptotik yolak (intrensek) mitokondriyal ölüm yolağı ile
gerçekleşebilir [Ouyang ve ark., 2012]. Apoptozu transmembran reseptör aracılı
etkileşimler ile başlatan yol, ölüm reseptör yoludur. Bu sinyal yolunda, TNF reseptör
gen süper ailesinin üyeleri olan ölüm reseptörlerini içeren transmembran reseptörleri
(Şekil 2.15) rol almaktadır. TNF reseptör ailelerinin üyeleri birbirine benzer sisteince
zengin hücre dışı domain (alan) içerir ve öldürücü domain olarak adlandırılan
yaklaşık 80 aminoasitlik bir sitoplazmik alana sahiptirler. Ligand ve onların karşılığı
olan öldürücü reseptörler FasL/FasR, TNF-α/TNFR1, Apo3L/DR3, Apo2L/DR4 ve
Apo2L/DR5’dir. Apoptozun ekstrensek fazını tanımlayan olayların oluş sırası en iyi
şekilde FasL/FasR ve TNF-α/TNFR1 modelleri ile karakterize edilir. TNF, sitolitik
aktivitesini Fas (CD95) antijeni aracılığı ile yürütür [Eröz ve ark., 2012].
41
Şekil 2.15. Hücre ölüm reseptörlerinden bazılarının apoptozdaki rolü [Altunkaynak
ve Özbek, 2008]
Hücre içi reseptörlere doğrudan etki eden reseptörlerden ayrı olarak uyarının farklı
bir düzenini içeren yola intrensek (mitokondriyal yol) adı verilir. Apoptozu başlatan
intrensek sinyal yolu; mitokondriyal başlatıcı olaylar olan, hücre içerisindeki
hedefler ile direkt etkileşimde olan ve hücre içi sinyaller üreten, reseptör olmayan
uyaranların aracı olduğu bir dizi olayları içermektedir. İntrensek yolu başlatan
uyarıcı, pozitif ya da negatif biçimde rol oynayabilir. Negatif sinyaller, ölüm
programının baskılanmasının başarısız olmasına neden olabilecek belirli büyüme
faktörleri, hormonlar ve sitokinlerin olmadığı durumları içerir ve apoptozu tetikler.
Serbest radikaller, radyasyon, hipertemi, toksinler, hipoksi ve viral enfeksiyonlar gibi
diğer uyaranlar pozitif sinyaller olarak rol oynamaktadır. Bu uyaranların tamamı
mitokondriyal permeabilite geçiş porunun açılmasına, mitokondriyal transmembran
42
potansiyeli ve sitozolun iç membran boşluğundan normal olarak izole edilmiş
proapoptotik proteinlerin iki ana grubunun salınımına yol açan değişikliklere neden
olabilir [Saelens ve ark., 2004]. İlk grup sitokrom c, Smac/DIABLO, ve serin proteaz
HtrA2/Omi’den oluşur. Sitokrom c bir apoptozom oluşturan prokaspaz-9’a ilave
olarak apoptotik proteaz aktive etme faktörünü (Apaf-1) aktive eder ve bağlar. Bu
şekilde prokaspaz-9’un kümeleşmesi kaspaz-9 aktivasyonuna yol açar. Proapoptotik
proteinlerin ikinci grubu, apoptoz süresince mitokondrilerden salınan AIF,
endonükleaz G ve CAD’dır, ancak bu hücrenin ölümünden sonra oluşan bir olaydır.
Apoptoz uyarıcı faktör (AIF) çekirdeğe transloke edilir ve DNA’nın 50-300kb’lik
parkalara bölünmesine ve periferal çekirdek kromatininin kondensasyonuna yol açar
[Eröz ve ark, 2012].
Çeşitli kanser hücreleri üzerine bitkiler ile apoptotuzun indüklenmesi üzerine çalışma
yapılmıştır. 2011 yılında yapılan bir çalışmada Mentha piperita bitkisinin HeLa
(Serviks kanser hücre hattı ), MCF-7 (Meme kanser hücre hattı), Jurkat (T-lenfoblast
hücre hattı), T24 (Üriner karsinoma), HT-29 (Kolon adenokarsinoma), MIAPaCa-2
(Pankreatik adenokarsinoma) ve normal IMR-90 (Akciğer fibroblastı), HEK-293
(Böbrek epiteli) hücreler üzerine mitokondriyal yol ile apoptotik aktivitesini test
etmişlerdir [Jain ve ark., 2011].
Yapılan bir çalışmada SH-SY5Y (insan nöronal hücreleri) hücreleri ile kuersetinin
H2O2 indüklü apoptoza karşı koruyucu etkisine bakılmıştır. Bu çalışmada SH-SY5Y
hücreleri 100 µM kuersetin ve 100 µM H2O2 ile 24 saat inkübe edilmiştir. Buna göre;
H2O2 uygulanmış SH-SY5Y hücrelerinin DNA’sında degradasyon görülürken H2O2
uygulanmış SH-SY5Y hücrelerine 100 µM kuersetin ile muamele sonucu
degradasyon seviyesi gözle görülür biçimde azalmıştır [Suematsu ve ark., 2011].
Apoptotik yolların kesiştiği kavşak noktanın mitokondri olduğu görülmüştür. Bu
yüzden mitokondrinin aktivasyonu
salınması)
(sitokrom c’nin mitokondriden sitoplazmaya
apoptotik süreçte geri dönüşümsüz noktayı gösterir.
Mitokondri,
membranlar arası alandan sitoplazmaya sitokrom c ve apoptoz uyarıcı faktör (AIF)
gibi apoptotik faktörlerin salınımı ile apoptozun pek çok formunda önemli rol oynar.
43
Sitokrom c, elektron transport zincirine ve oksidatif fosforilasyona katılır. Sağlıklı
hücrelerde sitokrom c, mitokondride membranlar arası boşlukta yer alır. Sitotoksik
ilaçlar, gelişme faktörü eksikliği, reaktif oksijen türevleri ve DNA hasarı gibi değişik
hücresel stresler sitokrom c’nin sitoplazmaya salınmasını harekete geçirir. Sitokrom
c’nin salınması, Bcl-2 aile üyeleri ile düzenlenir.
Bcl-2 onkoprotein grubu
Bcl-2 ailesi antiapoptotik ve proapoptotik üyelerden oluşan ve apoptozu
düzenlemede en önemli role sahip olan onkoprotein grubudur (Şekil 2.16). Bcl-2 ile
ilgili proteinler yapısal ve işlevsel durumlarına göre 3 grup altında sınıflandırılırlar:
1) Bcl-2 alt grubu Bcl-2, Bcl-XL ve Bcl-w’ den oluşur, dört bölgeleri (BH1, BH2,
BH3, BH4) kuvvetli benzerlik gösterir. Hepsinin antiapoptotik aktivitesi vardır.
Proteinin C ucundan zara tutunma bölgesi vardır ve mitokondri dış zarına yerleşirler.
2) Bax alt grubu Bax ve Bak’ dan oluşur. BH1, BH2 ve BH3 bölgelerinde Bcl-2’ ye
benzerlik gösterirler ve hepsi pro-apoptotiktir. Bax difteri toksininin yapısal olarak
tam benzeridir. Bu toksin, endozomal/lizozomal zarlarda mRNA çevirimi
(translokasyon) baskılayıcı adenozin 5’- difosfat ribozile edici polipeptid A alt
ünitesinin sitoplazmaya geçmesini sağlayacak büyüklükte kanallar oluşturarak
hücreyi öldürür.
3) Bik alt grubu proapoptotik Bik, Bid ve Bim’ den oluşur. Bunların yalnız BH3
bölgeleri Bcl-2’ ye benzerlik gösterdiği için BH3 proteinler olarak da adlandırılırlar.
Belirgin özellikleri heterodimerler oluşturmaları ve böylece eşlerinin aktivitelerinin
düzenlenmesini sağlamalarıdır [Atagün ve ark., 2011; Çolakoğulları, 2007].
44
Şekil 2.16. Apoptozda mitokondri yolunda yer alan Bcl-2 familya üyeleri [Atagün ve
ark., 2011]
Bir hücrenin apoptoza eğilimli oluşu heterodimer ya da homodimer formundaki Bcl2 ailesi genlerinin etkisine bağlıdır [Altunkaynak ve Özbek, 2008]. Bax hücrede aşırı
yapıldığında apoptotik ölüm artar iken Bcl-2 aşırı yapıldığında Bax ile
heterodimerize olur ve apoptotik ölüm baskılanır. Bax ya da Bak gibi üyeler
heterodimerizasyon yoluyla kaspaz serbestleşmesini uyarır ve mitokondri zarının
geçiş porlarının açıklığını değiştirerek sitokrom c’ yi serbestleştirir. Dolayısıyla
kaspaz aktivasyonuna yol açar [Tsujimoto, 1998; Taneja ve ark., 2001]. Bcl-2 ve
Bcl-XL apoptozu engelleme fonksiyonunu; ya kaspazların öncü formlarını
durdurarak ya da kaspaz akışını direkt olarak aktive eden sitoplazmadaki AIF ve
sitokrom-C
gibi
apoptogenik
faktörlerin
mitokondriden
serbestleşmesini
engelleyerek gerçekleştirir (Şekil 2.17) [Altunkaynak ve Özbek, 2008].
45
Şekil 2.17. Bcl-2 onkoproteininin apoptoz üzerine etkisi. PARP: poli ADP riboz
polimeraz’ ı sembolize etmektedir [Altunkaynak ve Özbek, 2008]
Kaspazlar
Gerek ölüm reseptörleri yolu gerekse mitokondriyal apoptozda rol alır. Kaspazların
günümüze dek 14 izoformu keşfedilmiştir: Apoptozu başlatan kaspazlar (C-2, C-8,
C-9, C-10), apoptozu yürüten kaspazlar (C-3, C-6, C-7) ve sitokin inaktivasyonu (C1, C-4, C-5, C-11, C-12) [Gültekin ve ark., 2008]. Sitoplazmada normalde inaktif
proenzimler olarak bulunurlar. Fakat proteolitik parçalanmadan sonra aktif hale
geçerler ve böylece kaspaz aktivasyon zinciri (Şekil 2.18) başlar. Başlangıçta,
kaspazlar mitokondride membran hasarı oluşturur ve bu olayların sonucunda; zar
değişimleri, hücre iskeleti ve çekirdek değişimine yol açan hasarlar ortaya çıkar
[Leach, 1998; Saikumar, 1999]. Bazı kaspazlar mitokondride inhibe edilir. Bcl-2 ve
Bax mitokondri dış zar geçirgenliğini ayarlar. Apoptotik uyarıda mitokondriyal bir
protein olan sitokrom-C, APAF-I aktive eder ve ardından ATP’nin katılmasıyla
apoptozom adı verilen bir kompleks oluşur. Bu kompleks inaktif olan prokaspaz 9’un
46
aktif kaspaz 9’a dönüşmesine ve diğer efektör kaspazların aktivasyonuna yol açar
[Atagün ve ark., 2011].
Şekil 2.18. Mitokondri aracılığı ile kaspaz aktivasyonu. A. Apoptotik uyarıdan sonra
sitokrom c sitoplazmaya salınır. B. Sitokrom c ve ile Apaf-1 heptamerik
oluşumu sağlayan konformasyon kazanır [Atagün ve ark., 2011]
2.6. Türkiye’nin Bitki Örtüsü
Türkiye, çevresindeki çoğu ülkeye göre sahip olduğu bitki çeşitliliği bakımından
farklılık göstermektedir. Günümüz bitkilerine göre Türkiye, 3090’ı endemik toplam
12 000 bitki taksonunun yaşam alanıdır. Türkiye’nin bu özelliği, coğrafi faktörlerden
ileri gelmektedir. Toprak tiplerinin farklılıkları, iklim özelliklerinde kısa mesafelerde
meydana gelen değişiklikler gibi coğrafi faktörler, bitki formasyonlarının
farklılaşmasına ve türce çeşitlenmesine neden olmaktadır. Türkiye’nin, kuzey ve
güney kıyılarının gerisindeki dağlık alanlar ile batısından doğusuna doğru gidildikçe
47
belirginleşen
yükselti
farkları,
dağlık
sahalarında
bitki
topluluklarının
kademelenmesine ve topluluklarının değişimine neden olmuştur [Avcı, 2005].
Türkiye’de endemik bitki türleri yönünden zengin bölgeler İç Anadolu, Doğu
Anadolu ve Akdeniz bölgeleri olup 1890 bitki sadece coğrafik bölgelerimize
özgüdür; geri kalan 1200 endemik takson ise birden çok coğrafik bölgede yayılış
göstermektedir [Atik ve ark., 2010] (Çizelge 2.5).
Çizelge 2.5. Türkiye’de bölgelere özgü endemik bitki türü sayıları [Atik ve ark.,
2010]
Bölge
Endemik bitki türü sayısı
Güney Doğu Anadolu
35
Marmara
70
Ege
160
Karadeniz
220
İç Anadolu
275
Doğu Anadolu
380
Akdeniz
750
TOPLAM
1890
2.7. Asteracea Familyasının Genel Özellikleri
Dünyada geniş habitat tiplerine sahip Asteraceae familyası üyeleri Antartika dışında
hemen hemen her bölgede bulunurlar [Kürşat ve Civelek, 2011]. Özellikle Akdeniz
Bölgesi, Meksika ve Güney Afrika gibi subtropik ve tropik yan kurak bölgelerde,
Güney
Amerika,
Afrika
ve
Avustralya'nın
ormanlık
bölgelerinde,
çalı
formasyonlarında ve kırlarda temsil edilmektedir. Asteraceae familyası yaklaşık
1100 cins ve 25 000 tür ile dünyada, 152 cins, 1230 tür, 133 alt tür, 75 varyete olmak
üzere toplam 1438 taxa ile de Türkiye'de temsil edilmektedir [Saday, 2005].
48
2.7.1. Asteracea familyasının morfolojik özellikleri
Tek ve çok yıllık otsular veya nadir olarak çalı şeklinde olup; bazıları süt boruları
içeren böcekler ile tozlaşan bitkilerdir. Familyanın yaprakları bazen karşılıklı ama
genelde alternat ve stipulsuzdur. Yaprak laminası değişik şekillerde olup parçalı ya
da bütündür. Çiçek durumu baş veya kapitulumdur. Kapitulum nadiren tek çiçekli
olup çok sayıda sapsız çiçekten oluşur. Kapitulum bir ya da çok sıralı braktelerden
oluşan koruyucu bir involukrum ile çevrilidir. Tüm çiçekler hermafrodit veya tek
eşeyli, aktinomorf ya da zigomorftur. Kaliks ya papus ya halka veya pul
biçimindedir. Ovaryum alt durumlu olup iki karpelden meydana gelmiş tek
ovüllüdür. Asteracea familyasının meyve tipi akendir, tepesinde bazen bir papus,
bazen kaliks artığı bulunur.
Asteracea familyası oldukça geniş bir familyadır. Körpe ve sulu bitkiler, yabani
zararlı otlar ve zehirli bitkiler gibi bitkilerinin yanında gıda bitkileri, hammadde
kaynakları, ilaç bitkilerini içermelerinden dolayı ilaç sanayisinde kullanılır, süs
bitkisi olarak yetiştirilir ve bal gibi gıdalar elde edilir. Bundan dolayı ekonomiye
büyük oranda katkı sağlamaktadırlar [Süslü ve ark., 2010].
2.8. Tanacetum Cinsinin Özellikleri
Asteraceae familyasına ait Tanacetum cinsi dünyada 70 tür ile temsil edilmekte olup
bunların 18’i endemiktir. Dünyada kuzey yarım kürede yayılış göstermektedir.
Türkiye’de Doğu Anadolu Bölgesi başta olmak üzere, İç ve Güney Anadolu
bölgelerinde oldukça yaygındır. Tanacetum cinsinin 45 türü ülkemizde yetişmektedir
[Kılıç, 2007; Aydemir, 2005].
2.8.1. Tanacetum albipannosum Hub.-Mor. & Grierson bitkisinin özellikleri
Türkçe adı ‘Keçeli Pireotu’ olarak ismlendirilen Tanacetum albipannosum (Şekil
2.19) otsu, bazen tabanda odunsu bir bitkidir. Gövde hemen hemen dik, yapraklı, 2540 cm boyunda; yukarı kısmında 2-5 dallı, nadiren basit, grimsi tüylüdür. Taban
49
yapraklar pinnat bölümlü, 7-15 cm boyunda grimsi veya beyaz keçimsi tüylüdür. Üst
yapraklar pinnat bölümlü 1-2 cm’dir. Kapitulum tekli çiçek tablasını saran grimsi
yapraklar tüylü, 4-7 x 7,5-12,5 mm’dir. Fillariler yumurtamsı, sivri uçlu, kahverengi
kenarlıdır. Kenardaki çiçekler 20-35 adet olup, beyaz ya da açık sarıdır. Uç tarafında
3 dişlidirler. Ortadaki çiçekler 2-2,5 mm, meyveleri aken şeklinde 2-2,5 mm boyunda
ve 10 kadar çıkıntı taşır. Çiçeklenmesi 6. ve 7. aylarda, kaya koğuklarında ve dik
kayalıklarda 1550-1750 m yükseklikte yetişirler. Ülkemizde Erzincan, Sivas ve
Giresun yüksek daülarında bulunurlar. Endemik ve Iran-Turan elementidir [Grierson,
1975].
Şekil 2.19. Tanacetum albipannosum [http://turkherb.ibu.edu.tr]
50
2.8.2. Tanacetum L. cinsinin halk arasında kullanımı
Tanacetum cinsinin birçok türü dünyanın her yerinde farmakolojik araştırmalarda ve
etnobotanikte geniş kullanım alanına sahiptirler. Bu cinsin taksonları, yüksek oranda
uçucu yağ içermektedirler [Özmen, 2009]. Solucan otu olarak bilinen T. vulgare L.
bitkisi farklı birçok farmakolojik özelliklere sahiptir. Sırbistan’da yayılış gösteren bu
tür, başlıca tansiyon ilacı olarak kullanılmakta olup ayrıca antidiyabetik, gaz giderici
ve idrar söktürücü gibi birçok kullanım amacı vardır. Bu türden elde edilen
ekstraktların antioksidan, antimikrobiyal, antiinflamatuvar ve antitümör aktivite
gösterdiği rapor edilmiştir [Stevovic ve ark., 2009]. T. parthenium Schultz Bıp.
kulak, baş, diş ve mide ağrıları, kulak çınlaması, baş dönmesi, ateş, eklem iltihabı,
astım, adet düzensizliği ve sedef gibi birçok rahatsızlığa karşı tedavi edici olarak
kullanılmaktadır. Amerika’nın güneyi ve merkezinde değişik hastalıkların tedavisi
için bu bitki türünden faydalanılmaktadır. Andes dağlarında yaşayan Hintliler mide
bulantısı, karın ve böbrek ağrısına karşı kullanmakta; Kosta Rikalılar ise bitkiyi
kaynatarak sindirime yardımcı amaçlı kullanmaktadırlar. Ayrıca yapılan klinik
çalışmalarda migren ağrısını engelleyici etki, antiinflamatuvar, antiülser ve insektisit
özellik ve antikanser aktivite gösterdiği belirtilmiştir [Pareek ve ark., 2011]. Wu ve
arkadaşları (2006) apigenin, luteolin ve parthenolid içeren Tanacetum parthenium
türünün insan meme kanser hücreleri (MCF-7 ve Hs 605.T) ve insan serviks kanser
hücresinin (SiHa) canlılığını araştırmışlardır. Parthenolid’in üç hücre hattı üzerine de
antiproliferatif etkisi yüksek olmuştur [Wu ve ark., 2006].
T. coccineum Grierson halk arasında oltu otu olarak bilinmektedir. Bu bitki kene,
pire ve bit gibi vücut parazitlerine karşı haşere öldürücü olarak, kaşıntılı deri
hastalıklarına ve sivilcelere karşı tedavi amaçlı kullanılmaktadır [Kılıç, 2007].
Endemik bir tür olan T. albipannosum ile ilgili benzer çalışmalar ülkemizde ve
dünyada bulunmayıp, çalışmamız bitkinin kanser hücreleri üzerine sitotoksik ve
apoptotik etkisi, antioksidan aktivitesi, genetik hasarı önleyici etkisi bakımından
yapılmış ilk çalışma olarak önem taşımaktadır.
51
2.9. Achillea Cinsinin Özellikleri
Achillea cinsinin geneli (Şekil 2.20) Avrupa’da, Asya’nın ılıman bölgelerinde,
bazıları da Kuzey Amerika’da yayılış gösterirler. Günümüzde yaklaşık 140 türü olan
cinsin Türkiye’deki tür sayısı 42 dir. Deniz seviyesinden 3000 m’ye kadar her türlü
habitatta yetişebilmektedir [Saeidnia ve ark., 2011; Arabacı, 2006].
2.9.1. Achillea sp. nova bitkisinin özellikleri
Achillea sp. nova çok ılık, otsu, yastık formundadır. Tabandan çok dallanan 30-40
cm boyunda ve tabanında verimsiz yaprakları bulunan basık, keçemsi tüylü
bitkilerdir. Yaprakların hepsi aynı olup ipliksi; gövdedeki yapraklar 7-16 x 1-2 mm
pinnat, kiremit dizilişli, yumurtamsı veya kılışsı, keçemsi tüylüdür. Kapitulumlar
daima bir adet olup 5-7 cm boyundaki saplar üzerinde yer alırlar. Fillarileri 3-4 seri,
dışarıdakiler 10-12 mm, yumurtamsı oblong, ortadakiler oblong oblivikülerdir. En
içte yer alanlar ipliksi, kılıçlı ve tamamı zarsı bir kenar ile sonlanır. En dış fillarilerin
orta damarları sık tüylüdür. Ray çiçekler 6-8 adet, beyaz 10-12 mm boyunda ve üç
parçalıdır. Anterler sarı, hafifçe tüpten çıkarlar. Disk çiçekler 50-70 adet, 3,5 – 4 mm
boyunda, involokrumu hafifçe geçerler. Stilus kahverengimsi, 1-2 mm boyunda ve
uçta iki parçalıdır. Aken oblong, 2-3 mm boyundadır. Çiçeklenme 5. ve 6. aylarda
olup steplerde, kayalık yamaçlarda 1500-1600 m’lerde yetişirler. Henüz bilim
dünyası için tanımlanmayan bu tür Fethiye – Babadağ’da yetişmektedir. Achillea sp.
nova endemik bir tür olup, Akdeniz elementidir.
52
Şekil 2.20. Achillea sp. nova [http://turkherb.ibu.edu.tr]
2.9.2. Achillea cinsinin halk arasında kullanımı
Achillea türleri halk hekimliğinde farmakolojik amaçlı eskilerden beri kullanılan
tıbbi bitkilerdir. Bu bitkiler terpenler, flavonoidler, alkoloidler, yağlar, taninler gibi
farklı farmakolojik bileşikleri içermektedirler. Bu türler yara iyileştirici, antiseptik,
terlemeyi önleyici, kanamayı durdurucu, idrar söktürücü gibi özelliklere sahip olup
mide ağrısı, ishale karşı da tedavi edici olarak kullanılmaktadır. Ayrıca farklı
Achillea
türlerinin
antimikrobiyal,
antioksidan,
antitümör,
antiinflamatuvar,
antidiyabetik ve sitotoksik etkileri kaydedilmiştir [Motavalizadehkakhky ve ark.,
2013]. Biyolojik sistemlerde doğal antioksidanların koruyucu aktivitesi dikkat çekici
53
olmuştur. Bazı tıbbi bitkilerin serbest radikal süpürücü ve antioksidan aktivitelerinin
olduğu kanıtlanmıştır. A. falcata L. eritrositlerde katalaz, süperoksit dismutaz ve
glutatyon peroksidaz enzim sistemleri üzerine etkisi oldukça yüksek olmuştur. A.
millefolium sindirim sistemi bozukluklarının tedavisinde halk hekimliğinde yaygın
olarak kullanılmaktadır [Seidnia ve ark., 2011]. A. fragrantissima türü ile ilgili
yapılan bir çalışmada bu türden elde edilen su ekstraktının insan karaciğer kanser
hücre hattı (HepG2) üzerine sitotoksik etki gösterdiği bulunmuştur [Harlev ve ark.,
2012]. Endemik tür olan A. sp. nova ile yapılmış herhangi bir çalışma yoktur. Farklı
kanser hücre hatları üzerine sitotoksik ve apoptotik etkisinin, antioksidan
aktivitesinin aynı zamanda genetik hasarı önleyici özelliğinin araştırıldığı bu çalışma,
dünyada ve ülkemizde ilk olacaktır.
2.10. Centaurea Cinsinin Özellikleri
Centaurea cinsi Güney Batı Asya ve Akdeniz’de yayılış göstermektedir. Dünyada
yaklaşık 600 ülkemizde ise 190 kadar tür ile temsil edilmektedir [Özcan, 2013].
2.10.1. Centaurea depressa Bieb. bitkisinin özellikleri
Türkiye’de ‘Acımık’ olarak da isimlendirilen Centaurea depressa (Şekil 2.21) tek
yıllık, 10-60 cm boyunda, genelde tabandan dallanan bir bitkidir. Yapraklar düz,
kılıçsı ve keçemsi tüylüdür. İnvolukre 14-18 x 8-12 mm, ovaid veya fincan
şeklindedir. Appendiçleri kahverengi ya da siyahımsı çizgili ve kurşuni renkli
dişlidir. Çiçekler mavi, kenardaki çiçekler radiant, merkez çiçekler tüp şeklindedir.
Akenleri 4, 5 ya da 5,5 mm boyunda ve ortadan yarıya kadar uzanan bir çizgi
bulunmaktadır. Aken üzerinde yer alan tüyler (Pappus) 5-8 mm’dir. Tarla ve yol
kenarlarında 0 m’den 2300 m’ye kadar olan yüksekliklerde yetişirler. Ülkemizde çok
geniş yayılışı olan bu tür Asya’da Himalayalara kadar Avrupa’da Balkanlar ve
Kırım’da yetişmektedir [Wagenitz, 1975].
54
Şekil 2.21. Centaurea depressa [http://turkherb.ibu.edu.tr]
2.10.2. Centaurea cinsinin halk arasında kullanımı
Centaurea cinsinin türleri antidiyabetik, antibakteriyel, antiinflamatuvar, idrar
söktürücü, sindirimi düzenleyici, ishali önleyici etkilerinden dolayı halk ilacı olarak
bilinirler. Bu türler zengin sekonder metabolit içerikleri, özellikle flavonoid ve
seskiterpen laktonlarından ötürü birçok fitokimyasal araştırmalarda konu olmuştur
[Bicha ve ark., 2013]. Erol-Dayi ve arkadaşları [2011] üç Centaurea türü (C.
calcitrapa subsp. calcitrapa, C. ptosimopappa, C. spicata) ile yaptığı çalışmada bitki
türlerine ait su ve metanol ekstraktlarının HeLa kanser hücre hattı üzerine sitotoksik
etkisininin olup olmadığını araştırmışlardır. Yapılan bu çalışma sonucu C. calcitrapa
subsp. calcitrapa türünün metanol ekstraktının yüksek oranda HeLa hücresine
sitotoksik etki gösterdiği bulunmuştur. Yapılan bir çalışmada C. melitensis türünün
yüksek antioksidan aktivite gösterdiği belirtilmiştir [Ayad ve ark., 2012].
55
3. MATERYAL VE METOT
3.1. Materyal
3.1.1. Bitki materyali
Bu tez kapsamında bitki materyali olarak Asteraceae familyasına ait üç bitki türü
kullanılmıştır. Türkiye’de yetişen bu bitkiler Achillea sp. nova ve Tanacetum
albipannosum endemik türler olup Centaurea depressa yaygın türdür. Bitki
türlerinin teşhisi Gazi Üniversitesi öğretim üyesi Prof. Dr. Zeki Aytaç tarafından
yapılmıştır. Materyaller 2011 yılı yaz döneminde toplanmıştır. Tez kapsamında
kullanılan bitki türleri, lokaliteleri ve toplanma yılları Çizelge 3.1’de verilmiştir.
Çizelge 3.1. Tez kapsamında kullanılan bitki türleri, lokaliteleri, toplama yılı
Toplama yılı
Bitki ismi
Lokalite
Achillea sp. nova
Muğla; Fethiye, Babadağ, 1700 m 2011
Tanacetum albipannosum
Erzurum; Aşkale, Erzincan yolu, 2011
5. km, Step
Centaurea depressa
Ankara; Gölbaşı, Hacı Hasan 2011
köyü
3.1.2. Çalışmada kullanılan hücre hatları
Çalışmada kullanılan kolon kolorektal adenokarsinoma kanser hücre hattı (Caco-2)
ŞAP Enstitüsü’nden (Türkiye), kolon kolorektal adenokarsinoma kanser hücre hattı
(HT-29) ve servikal karsinoma hücre hattı (HeLa) Hamamatsu Üniversitesi Patoloji
bölümünden (Japonya), kontrol amaçlı kullanılan insan gingivial fibroblast hücre
hattı HGF-1 ise Gazi Üniversitesi Moleküler Biyoloji Araştırma ve Uygulama
Merkezi’nden (MOBAM) temin edilmiştir.
56
3.2. Metot
3.2.1. Bitki ekstraktlarının elde edilmesi
Çalışmada kullanılacak bitki örnekleri kurutularak toz haline getirilmiştir. Öğütülmüş
bitki örneklerinden 30 g alınmış metanol veya su çözücüleri (300 mL) ile soklet
cihazı (LabHeat) kullanılarak yaklaşık 4-6 saat kaynatılmıştır (Resim 3.1). Elde
edilen sıvı kısım filtreden geçirilmiş ve çözücüler kontrollü sıcaklık (60-80˚C), düşük
basınç ile dönen evaporatörde (Heidolph Laborota 4000) uzaklaştırılmıştır (Resim
3.2). Elde edilen bitki ekstraktları kullanıncaya kadar 4˚C’ de muhafaza edilmiştir
[Magesh ve ark., 2009].
Resim 3.1. Çalışmada kullanılan soklet cihazı
57
Resim 3.2. Çalışmada kullanılan evaporatör cihazı
3.2.2. Bitki ekstraktlarının farklı konsantrasyonlarda denenmesi
Çalışmada Centaurea depressa, Achillea sp. nova ve Tanacetum albipannosum
bitkilerinin metanol ve su ekstraktının 100, 250 ve 500 µg/mL konsantrasyonları
HeLa, HT-29 ve Caco-2 kanser hücre hatlarına muamele edilmiştir. Bitki
ekstraktlarının kanser hücre hatları üzerine antiproliferatif, apoptotik, antioksidan ve
antigenotoksik etkileri araştırılmıştır. Ekstraktların konsantrasyonları hücre gelişimi
için kullanılan besiortamı (DMEM) ile 1:1 oranında taze olarak hazırlanmıştır.
3.2.3. Hücrelerin geliştirilmesi için kullanılan besi ortamları ve gelişme şartları
Hücreler ticari olarak alınıp laboratuvara getirildikten sonra -196ºC’de sıvı nitrojen
tankında saklanmıştır. Çalışmada kullanılan hücre hatları gelişimini sağlamak
amacıyla 37˚C’deki sıcak su banyosunda bekletilmiştir. Hücreler, içerisinde hücre
besiortamı bulunan tüplere aktarılmıştır. Canlı hücre sayımı için 50 µl hücre
süspansiyonu eşit miktarda Tripan mavi boyası (Sigma) ilave edilerek iyice
58
karışması sağlanmıştır. Bu karışımın 50 μl’si alınıp thoma lamı üzerinde sayılmıştır.
İnverted mikroskopta (Leica, Germany) 16 kare sayılmıştır. Toplam sayı sulandırma
katsayısı ile çarpılarak 1 mL besiortamında ne kadar hücre olduğu bulunmuştur
[Oskay, 2008; Çetin, 2011].
İnsan gingival fibroblast (HGF-1)
Hücreler, hücre besiortamı Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM,
İnvitrogen) içerisine % 1 penisilin/streptomisin (Sigma), % 10 fetal sığır serumu
(FBS, Gibco), ve % 1 L-Glutamin (Sigma) katılarak hazırlanmış ve T25 ve T75
flasklarda, 37˚C’de % 5 CO2 içeren inkübatörde geliştirilmiştir (MCO-18AIC,
Sanyo). Besiortamı gün aşırı değiştirilerek hücre gelişimi takip edilmiştir. Flasklarda
% 80-90 yayılma gösteren (logaritmik büyüme gösteren) hücreler Tripsin/EDTA
(Gibco) ile kaldırılarak sayımı yapılmış ve 96 kuyulu mikroplaklara (Costar) 1x104
hücre/kuyu olacak şekilde aktarılmıştır [Weisburg ve ark., 2004; Kierklo ve ark.,
2012].
İnsan kolorektal adenokarsinoma kanser hücre hattı (Caco-2)
Hücreler, DMEM içerisine % 20 fetal sığır serumu, % 1 L-Glutamin ve % 1
penisilin/streptomisin katılarak hazırlanmış besiortamı ile flasklarda, 37˚C’de % 5
CO2 içeren inkübatörde geliştirilmiştir. Besiortamı gün aşırı değiştirilerek hücre
gelişimi takip edilmiştir. Flasklarda % 80-90 yayılma gösteren hücreler
Tripsin/EDTA ile kaldırılarak 96 ve 6 kuyulu mikroplaklara aktarılmıştır. 96 kuyulu
mikroplaklarda 1x104 hücre/kuyu yoğunluğundaki hücreler antiproliferatif ve
apoptotik etkiye bakılmak üzere; kit prosedürlerine göre 6 kuyulu mikroplaklarda da
0,5x106 hücre/kuyu yoğunluğundaki hücreler total antioksidan ve süperoksit
dismutaz etkiye bakılmak üzere çalışmaya alınmıştır [Hadjiakhoondi ve ark., 2013;
Souza ve ark., 2013].
59
İnsan kolorektal adenokarsinoma kanser hücre hattı (HT-29)
Hücreler, DMEM içerisine % 10 fetal sığır serumu, % 1 L-Glutamin, % 1
penisilin/streptomisin ve % 40 MCDB-201 katılarak hazırlanmış besiortamı içinde
flasklarda, 37˚C’de % 5 CO2 içeren inkübatörde geliştirilmiştir. Hücre besiortamı
gün aşırı değiştirilerek hücre gelişimi takip edilmiştir. Flasklarda % 80-90 yayılma
gösteren hücreler Tripsin/EDTA ile kaldırılarak 96 ve 6 kuyulu mikroplaklara
aktarılmıştır. 96 kuyulu mikroplaklarda 1x104 hücre/kuyu olacak şekilde hücreler
antiproliferatif ve apoptotik etkiye bakılmak üzere; kit prosedürlerine göre 6 kuyulu
mikroplaklarda 0,5x106 hücre/kuyu olacak şekilde hücreler total antioksidan ve
süperoksit dismutaz etkiye bakılmak üzere çalışmaya alınmıştır [Hadjiakhoondi ve
ark., 2013].
İnsan servikal karsinoma hücre hattı (HeLa)
Hücreler, DMEM içerisine % 10 fetal sığır serumu, % 1 L-Glutamin ve % 1
penisilin/streptomisin katılarak hazırlanmış besiortamı ile flasklarda, 37˚C’de % 5
CO2 içeren inkübatörde geliştirilmiştir. Hücre besiortamı gün aşırı değiştirilerek
hücre gelişimi takip edilmiştir. Flasklarda % 80-90 yoğunluğa ulaşmış hücreler
Tripsin/EDTA ile kaldırılarak 96 ve 6 kuyulu mikroplaklara aktarılmıştır. 96 kuyulu
mikroplaklarda 1x104 hücre/kuyu yoğunluğuna ulaşan hücreler antikanser ve
apoptotik etkiye bakılmak üzere; kit prosedürlerine göre 6 kuyulu mikroplaklarda da
0,5x106 hücre/kuyu yoğunluğuna ulaşan hücreler total antioksidan ve süperoksit
dismutaz etkiye bakılmak üzere çalışmaya alınmıştır [Nair ve Varalakshmi, 2011].
3.2.4. Bitki ekstraktlarının antiproliferatif etkilerinin belirlenmesi
Bitkilerin antiproliferatif etkisinin belirlenmesinde Tripan mavisi ile boyama
yöntemi kullanılmıştır. Bu yöntemin temel prensibi, canlı hücreler boyayı almaz iken
ölü hücrelerin almasıdır. Tripan mavisi ölü hücrelerin membranından içeri geçerek
onları boyar. Hücre süspansiyonu tripan mavisi ile karıştırıldığında ölü hücreler
büyük, şiş ve koyu mavi şekle gelirler. Centaurea depressa, Achillea sp. nova ve
60
Tanacetum albipannosum bitkilerinin metanol ve su ekstraktlarının HT-29, Caco-2
ve HeLa hücre hatları üzerindeki antiproliferatif etkisi araştırılmıştır. Bunun için tüm
bitki ekstraktları 100, 250 ve 500 µg/mL konsantrasyonlarda hazırlanmış ve kanser
hücrelerine muamele edilmiştir. Hücreler 37˚C’de, % 5 CO2’li etüvde 48 saat
inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonrasında kuyulara 50 µl % 0,4 tripan mavisi
(Sigma) çözeltisi eklenmiş ve 15 dk. 37˚C’de, % 5 CO2’li ortamda inkübe edilerek
ölü hücreler boyanmıştır. Fazla boya soğuk PBS ile yıkanarak uzaklaştırılmıştır.
Hücreler 200 µl % 1 sodyum dodesil sülfat (SDS) (Sigma) ile lizis edilerek 590 nm
dalga boyunda mikroplak okuyucuda (Epoch, Biotek) analiz edilmiştir (Resim 3.3).
Herhangi bir bitki ekstraktı muamele edilmemiş kanser hücreleri ise kontrol grubu
olarak kullanılmış ve besiortamından kaynaklanan sitotoksik etki de göz önüne
alınarak, kontrole bağlı yüzde (%) ölüm oranı hesaplanmıştır. Deney 5 paralelli 3
tekrarlı olarak yapılmıştır [Peres ve ark., 2009]. Bitki türlerinin kanser hücreleri
üzerine antikanser etkisine bakıldıktan sonra sağlıklı hücreler üzerine sitotoksik
etkilerinin olup olmadığı da araştırılmıştır. Bunun için sağlıklı hücrelere aynı
konsantrasyonlarda bitki ekstraktları muamele edilmiş ve sitotoksik etki tripan mavi
yöntemi ile belirlenmiştir. Sonuçların hesaplanmasında; % Ölüm = (Kontrol
Ortalama – Örnek Ortalama)/Kontrol Ortalama x 100 formülü kullanılmıştır.
Resim 3.3. Çalışmada kullanılan mikroplak okuyucu
61
3.2.5. Bitki ekstraktlarının antioksidan etkisinin belirlenmesi
Total antioksidan analizi
Bitki ekstraktlarının kanser hücrelerine total antoksidan aktivitesini belirlemek amacı
ile Total Antioksidan (Cayman) kiti kullanılmıştır. Yapılan analizde su ve yağda
çözünebilir antioksidanlar ayrılmamış, bu yüzden bileşenlerin total antioksidan
aktiviteleri belirlenmiştir. Analiz; antioksidanların hücrelerde ABTS (2, 2’- Azinodi-[3-ethylbenzthiazoline
sulphonate])‘nin
metmyoglobin
ile
ABTS®+‘ye
oksidasyonunu inhibe etme yeteneğine dayanır [Jackie ve ark., 2011]. Bitkilerin her
iki ekstraktlarının 250 ve 500 µg/mL konsantrasyonları ile çalışılmıştır. Bu
konsantrasyonlar antiproliferatif etkiyi belirlemek için yaptığımız çalışmada kanser
hücreleri üzerinde yüksek antikanserojenik etki gösteren konsantrasyonlardır. HeLa,
Caco-2 ve HT-29 kanser hücre hatlarına bitki ekstraktları muamele edilmiş ve
hücreler 37˚C’de, % 5 CO2’li etüvde 48 saat inkübasyona bırakılmıştır. Üretilen
ABTS miktarı 405 nm dalga boyunda mikroplak okuyucuda ölçülmüştür.
Süperoksit dismutaz (SOD) analizi
Bitki ekstraktlarının kanser hücreleri üzerine süperoksit dismutaz aktivitesinin olup
olmadığını belirlemek amacı ile süperoksit dismutaz analizinde Cayman kiti
kullanılmıştır. Prensipte ksantin oksidaz ve hipoksantin tarafından üretilen süperoksit
radikallerinin (O2-) belirlenmesi için tetrazoliyum tuzu kullanılır. Bir birim SOD;
süperoksit radikallerinin % 50 dismutasyonunu belirlemek için gerekli enzimin
miktarı olarak tanımlanır. Tetrazoliyum tuzunun formazan boyasına O2 tarafından
gerçekleştirilen oksidasyon oranı, SOD’un endojen aktivitesi ile ters orantılıdır.
Bitkilerin her iki ekstraktlarının 250 ve 500 µg/mL konsantrasyonları ile çalışılmıştır.
Bu konsantrasyonlar antiproliferatif etkiyi belirlemek için yaptığımız çalışmada
kanser hücreleri üzerinde yüksek antikanser etki gösteren konsantrasyonlardır. HeLa,
Caco-2 ve HT-29 kanser hücre hatlarına bitki ekstraktları muamele edilmiş ve
hücreler 37˚C’de, % 5 CO2’li etüvde 48 saat inkübasyona bırakılmıştır.
62
Kuyucuklardaki formazan boya yoğunluğu mikroplak okuyucu kullanarak 450 nm de
dalga boyunda mikroplak okuyucuda ölçülmüştür [Jackie ve ark., 2011].
3.2.6. Bitkilerin genotoksik ve antigenotoksik etkisinin belirlenmesi
Lenfosit izolasyonu
Bu test tekniğinde her bir bitki örneği için sağlıklı bireylerden alınan periferal kan
lenfositleri kullanılmıştır. Sigara, alkol ve rutin ilaç kullanmayan, herhangi bir
hastalığı olmayan sağlıklı bireyler seçilmiştir. Enjektör ile bireylerden alınan taze
kan üzerine heparin ilave edilerek pıhtılaşması önlenmiştir. Üzerine eşit miktarda
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) (Amresco) eklenmiştir. Kan, içinde
2 mL lenfosit ayırıcı solüsyon (Biocoll) (Biochrom) bulunan her bir tüpe eşit
miktarda dağıtılmış ve tüpler 4˚C’de 2,400 rpm’de 20 dk. santrifüj (Sigma 3-30K)
edilmiştir. Santrifüj sonrası tüplerin içinde oluşan eritrositlerin üzerindeki beyaz
bulutumsu halkanın 2 mL’si ayrı bir tüpe alınmış ve tüpler 4˚C’de 2,400 rpm’de 20
dk. D-PBS ile santrifüj edilerek yıkanmıştır (Resim 3.4). Bu işlem sonrasında
çalışma için hücre pelletleri 0,5 mL D-PBS içinde süspanse edilmiştir [Mosaffa ve
ark., 2006; Bhat ve ark., 2011].
Resim 3.4. Eritrositlerin üzerinde oluşan beyaz, bulutumsu lenfosit halkası
63
Bitki türlerinin genotoksik etkisinin belirlenmesi
Bu çalışmada temel amaç, bitki türlerinin lenfosit DNA’larında DNA hasarı
oluşturup oluşturmadığının belirlenmesidir. Comet tekniği, Singh ve arkadaşlarının
(1988) yaptığı çalışmalar dikkate alınarak ve bazı modifikasyonlar ile kullanılmıştır.
Bu amaçla taze kandan izole edilen lenfositler bitki ekstraktlarının çeşitli
konsantrasyonları (100, 250 ve 500 µg/mL) ile ependorf tüp içinde süspanse edilmiş
ve 37˚C etüvde 1 saat inkübasyona bırakılmıştır. Ependorf tüpler inkübasyon sonrası
2,400 rpm’de 5 dk. santrifüj edilmiş ve santrifüj sonrası üst kısım atılmıştır. Düşük
erime ısılı agarozun (LMA) (Amresco) 100 µl’si, 50 µl lenfosit ile karıştırılmış,
önceden normal erime ısılı agaroz (NMA) ile kaplanan lamların üzerine damlatılmış
ve 24X60 mm’lik lamel ile kapatılarak preparatlar 15-20 dk. buzda bekletilmiştir.
Lamlar, içerisinde lizis solüsyonu bulunan şale içerisine konulup ve +4˚C’de 1 saat
bekletilmiştir. Liziz işlemi sonrasında lamlar, içinde elektroforez tamponu (pH>13)
bulunan tanka (SciePlus) yerleştirilmiş ve 20 dk. bekletilmiştir (Resim 3.5). Daha
sonra 25 V ve 300 mA’da 20 dk. elektroforez (Tanon EPS 300) yapılmıştır. Lamlar,
15 dk. nötralizasyon tamponu (pH 7,5) ile muamele edilmiş ve sonrasında lamlar
sırası ile % 50, % 75 ve % 99’luk alkol serilerinde 3-5’er dk. bekletilmiştir. Lamlar
üzerine 50 µl, 20 µg/mL etidyum bromür (Sigma) yayılmış ve üzeri 24x60 mm’lik
lamel ile kapatılmıştır. Yapılan bu işlemler, çevreden kaynaklı olabilecek DNA
hasarını önlemek amacı ile karanlık ortamda yapılmıştır.
Resim 3.5. Comet elektroforez tankı
64
Bitki türlerinin antigenotoksik etkisinin belirlenmesi
Buradaki amaç bitki türlerinin H2O2 indüklenmesi ile oluşacak bir DNA hasarını ne
derecede engelleyebildiğini analiz etmektir. Noroozi ve arkadaşlarının (2008) yapmış
olduğu çalışma referans alınarak yapılan denemelerde lenfosit hücrelerinde yüksek
genetik hasar oluşturan H2O2 (pozitif kontrol) derişimi 50 µM olarak bulunmuştur.
Negatif kontrol olarak lenfosit hücrelerine hiçbirşey muamele edilmemiştir. Çözücü
kontrol olarak da bitki ekstraktlarının çözüldüğü ortam olan DMEM kullanılmıştır.
Lenfosit hücreleri, belirlenmiş konsantrasyondaki (genotoksik etki göstermeyen
konsantrasyonlarda, 500 µg/mL) bitki ekstraktları ile 1 saat inkübasyona
bırakılmıştır. İnkübasyon sonrası 15 dk. H2O2 (50 µM)’ e maruz bırakılmış ve
sonraki işlemlere genotoksisite prosedüründeki gibi devam edilmiştir.
Görüntü analizi
Boyanan preparatlar 546 nm eksitasyon ve 590 nm bariyer filtreli Leica DFC425C
floresan mikroskop (Leica, Germany) (Resim 3.6) altında 40X büyütmede
incelenmiştir. Kullanılan her bir bitki örneği preparatı için 200 hücre sayılmış ve
bilgisayarlı görüntüleme sistemi ile (Comet Analysis Software, version 4.0, π
Perceptive Instruments Ltd., UK) incelenmiştir. Sonuçlar kuyruk yoğunluğu, kuyruk
momenti ve kuyruk uzunluğu cinsinden değerlendirilmiştir. % Kuyruk DNA hasarı =
[DNA kuyruk yoğunluğu/(DNA baş yoğunluğu + DNA kuyruk yoğunluğu)] formülü
kullanılarak hesaplanmıştır [Soltani ve ark., 2009].
65
Resim 3.6. Boyanan preparatların incelendiği floresan mikroskobu
Bitkilerin H2O2’in DNA’da yaratmış olduğu genetik hasarı inhibe edici yüzdesi
hesaplanmıştır [Kaur ve arkadaşları, 2009].
İnhibisyon (%) = (T1 - TC/Tl - T0) x 100
Tl = H2O2 ile indüklenen DNA’daki kuyruk yoğunluğu (Pozitif kontrol; D-PBS +
lenfosit)
TC = H2O2 varlığında lenfosit hücrelerine uygulanan bitki ekstraktlarının DNA’daki
kuyruk yoğunluğu
T0 = Negatif kontroldeki DNA yoğunluğu (D-PBS + lenfosit)
3.2.7. Apoptozun Belirlenmesi
Bitki ekstraktlarının kanser hücreleri üzerine apoptozu uyarıp uyarmadığı Cell Death
Detection ElisaPLUS (Roche) kiti kullanarak belirlenmiştir. Bu kit hücrede apoptozun
indüklenmesi sonrasında hücre sitoplazması dışındaki histon ile kompleks
oluşturmuş DNA fragmentlerinin miktarsal tayinine dayanır. Bitkilerin her iki
66
ekstraktlarının 500 µg/mL konsantrasyonları ile çalışılmıştır. Bu konsantrasyon
antiproliferatif etkiyi belirlemek için yaptığımız çalışma başta olmak üzere total
antioksidan, SOD çalışmalarında kanser hücreleri üzerinde yüksek antikanserojenik
etki gösteren, genotoksisite ve antigenotoksisite çalışmalarda ise en etkili olan
konsantrasyondur. Bitkiler HeLa, Caco-2 ve HT-29 kanser hücre hatlarına muamele
edilmiş ve hücreler 37˚C’de, % 5 CO2’li etüvde 48 saat inkübasyona bırakılmıştır.
İnkübasyon sonrasında hücre lizatı oluşturulmuştur. Optik yoğunluk 405 nm dalga
boyunda mikroplak okuyucuda ölçülmüştür [Zysk ve ark., 2000].
3.2.8. Apoptotik İndeksin Belirlenmesi
Hücre kültürlerindeki apoptotik ve nekrotik hücrelerin belirlenmesi Hoechst 33342
boyası ile gerçekleşmiştir. Hoechst boyası canlı hücrelerde DNA’ya bağlanırlar ve
ışıma yaparlar. Bitkilerin her iki ekstraktlarının 500 µg/mL konsantrasyonu HeLa,
Caco-2 ve HT-29 kanser hücre hatları ile muamele edilmiş ve hücreler 37˚C’de % 5
CO2’li etüvde 48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonrası hücreler
toplanmış ve 15 dk. boyama solüsyonu (2 µg/mL Hoechst 33342 boyası (Sigma), 1
ng/mL propidyum iyodür (Sigma), 100 µg/mL DNAaz free RNAaz) ile 37˚C’de % 5
CO2’li etüvde inkübasyona bırakılmıştır [Türk ve ark., 2011]. Apoptotik ve nekrotik
hücreler inverted floresan mikroskobu ile görüntülenmiştir. Apoptotik indeks
floresan mikroskobunda sayılan 150 hücre ile yüzde (%) olarak belirlenmiştir
(apoptotik hücrelerin sayısı / total hücrelerin sayısı x %100) [Jackisch ve ark., 2000].
3.2.9. Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC)
Ekstraktlar, Gazi Üniversitesi Moleküler Biyoloji Araştırma ve Uygulama
Merkezi’nde kuersetin (Chem Service), kamferol (Sigma), apigenin (Sigma),
biochanin a (Sigma), luteolin (Sigma), kateşin (Sigma) ve rutin hidrat (Dr.
Ehrenstorfer) flavonoidleri bakımından HPLC ile analiz edilmiştir. Tüm çalışmalar
Agilent 1200 seri HPLC sisteminde yapılmıştır (Resim 3.7). 10 mg/mL
konsantrasyonlarındaki bitki türlerinin (C. depressa, T. albipannosum ve A. sp. nova)
su ve metanol ekstraktları 0,45 µm membran filtreden geçirilmiştir. Manuel
67
enjeksiyonlu sistemde, Quart Pompa ve UV dedektör kullanılarak bazı flavonoidler
tek başlarına bazıları ise beraber aynı anda analiz edilmişlerdir. 250/4,6 ACE C18
100-5 kolon oda sıcaklığında kullanılmıştır. Çalışılan flavonoidler, mobil fazları,
dalga boyları ve akış hızları Çizelge 3.2’de verilmiştir [Kumar ve Kuppast, 2012].
Resim 3.7. Çalışmada kullanılan HPLC cihazı
68
Çizelge 3.2. Çalışılan flavonoidler, mobil fazları, dalga boyları ve akış hızları
Flavonoid
Mobil faz
Dalga boyu
Akış hızı
(%)
(nm)
(mL/dk.)
280
1
262
1
280
1
280
0,5
254
1
280
1
Su: 42
Kuersetin ve Kamferol
HAc: 8
MeOH: 50
Su: 60
Biochanin A
Metanol: 30
Asetonitril: 38
Orto-H3PO4: 1
Asetonitril: 15
Kateşin ve Apigenin
Su: 40
Metanol: 45
Asetonitril: 60
Rutin Hidrat
Su: 40
Asetonitril: 1
Luteolin
Su: 1
Asetonitril: 60
Genistein
Su: 40
69
3.2.10. İstatiksel Analizler
Tüm çalışmalar her çalışma için paralel sayısı değişmekle beraber, üç tekrarlı
yapılmıştır. İstatiksel analizlerde SPSS Inc Software (16.0 versiyon; SPSS Inc.,
Chicago, IL, USA) kullanılmıştır. Bitki türlerinin antiproliferatif-antigenotoksik
aktivite, antiproliferatif-apoptoz, antiproliferatif-total antioksidan aktivite ve
antiproliferatif-süperoksid dismutaz aktivite oranları arasında korelasyon olup
olmadığı Spearman Brown korelasyonuna göre incelenmiştir.
Antiproliferatif, antioksidan ve apoptoz çalışmalarında bitki türlerine ait ekstraktlar
arası farka tek yönlü varyans analizi (ANOVA) post host Dunnett çoklu karşılaştırma
testi (Dunnett T3 testi) ile bakılmıştır. Dunnett T3 testine göre antiproliferatif
çalışmasında 3 farklı bitki örneklerine ait su ve metanol ekstraktlarından (100, 250 ve
500 µg/mL), total antioksidan ve süperoksit dismutaz aktivite çalışmasında 3 farklı
bitki örneklerine ait su ve metanol ekstraktlarından (250 ve 500 µg/mL), apoptoz
çalışmasında 3 farklı bitki örneklerine ait su ve metanol ekstraktlarından (500
µg/mL) elde edilen ölçümler değerlendirilmiştir.
Comet deneyinde (tek hücre jel elektroforezi), lenfositlerde oluşan DNA hasarının
istatistiksel değerlendirmesi Kruskall Wallis testi kullanılarak yapılmıştır. Sonuçlar
negatif kontrol (D-PBS+lenfosit) ve pozitif kontrol (H2O2+lenfosit+D-PBS) ile
karşılaştırılmıştır.
Tüm çalışmalardan elde edilen veriler çalışılan tekrarların ortalaması ± standart
sapma şeklinde verilmiştir.
70
4. DENEYSEL BULGULAR
4.1. Bitki Türlerine Ait Ekstraktların Verimleri
Türkiye’de yetişen yaygın Centaurea depressa Bieb.; endemik Achillea sp. nova ve
Tanacetum albipannosum Hub.-Mor. & Grierson bitki türlerinin her bir çözücüden
(metanol ve su) elde edilen ekstrakt verimleri Çizelge 4.1’de belirtilmiştir.
Çizelge 4.1. Bitki ekstraktların verimleri (% w/w), (Centaurea depressa, Achillea sp.
nova, Tanacetum albipannosum)
Bitkiler
C. depressa
A. sp. nova
T. albipannosum
Su
37,57
40,17
36,77
Metanol
20,6
13,73
17,63
Ekstraktlar
Bitkilerden elde edilen ekstraktlar yüzde verimlerine göre karşılaştırıldığında, su ile
elde edilen ekstraktların veriminin metanol ile elde edilen ekstraktlara göre daha
yüksek olduğu bulunmuştur. Elde edilen verim bitki türlerine ait su ekstraktları
arasında birbirlerine yakın oranlarda olmuştur. En yüksek verimin A. sp. nova su
ekstraktında (% 40,17) ve en düşük verimin ise (% 13,73) A. sp. nova bitkisinin
metanol ekstraktında olduğu tespit edilmiştir.
4.2. Bitkilerin Antiproliferatif Etkisinin Araştırılması
Çalışmada Centaurea depressa, Achillea sp. nova ve Tanacetum albipannosum bitki
ekstraktlarının kanser hücre hatları üzerinde antiproliferatif etkisi tripan mavi metodu
ile belirlenmiştir. Çalışmada bitkilerin su ve metanol ekstraktları üç farklı
konsantrasyonda (100, 250 ve 500 µg/mL) üç farklı kanser hücre hattına (HT-29,
HeLa ve Caco-2) ve sağlıklı hücre hattına (insan gingivial fibroblast, HGF-1)
muamele edilmiştir. Kontrol grubu olarak kanser hücre hatlarına bitki muamele
edilmemiş ve hücrelere sadece gelişme ortamı olan medium eklenmiştir.
71
Hesaplamalar kontrol grubunda bulunan hücrelerdeki ölüm oranı göz önüne alınarak
yapılmıştır. Konsantrasyon artışına bağlı olarak bitkilerin kanser hücre hatlarında
antiproliferatif etkisinin arttığı bulunmuştur. Kanser hücre hatları antiproliferatif etki
bakımından karşılaştırıldığında bitkilerin HeLa hücre hattında, Caco-2 ve HT-29
hücre hattına göre daha yüksek antiproliferatif etki gösterdiği belirlenmiştir.
Bitkilerin kanser hücreleri üzerine antiproliferatif etkisinin yanında bu bitkilerin
kullanımında kanser hücrelerinde etkisi beklenen ajanların seçiminde sağlıklı
hücrelerde sitotoksik etkisinin olması önemli bir kriterdir. Bu sebeple araştırmada
sağlıklı hücre kontrolü olarak insan gingivial fibroblast hücresi (HGF-1)
kullanılmıştır. Bu hücreler Centaurea depressa, Achillea sp. nova ve Tanacetum
albipannosum ekstraktları ile çeşitli konsantrasyonlarda muamele edilmiştir. Tüm
bitki ekstraktlarında denenen hiçbir konsantrasyonun (100, 250 ve 500 µg/mL) HGF1 hücre hattı üzerine sitotoksik etki göstermediği belirlenmiştir.
100
90
Hücre ölümü (%)
80
70
60
HT-29
50
HeLa
40
Caco-2
30
HGF-1
20
10
0
Kontrol
100
250
500
Metanol Ekstraktı
/
100
250
500
Su Ekstraktı (µg/ml)
Şekil 4.1. Centaurea depressa bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29, HeLa
ve Caco-2 hücre hatları üzerine antiproliferatif etkisi
Şekil 4.1’de görüldüğü gibi C. depressa bitkisinin her iki ekstraktında artan
konsantrasyonuna bağlı olarak kanser hücreleri üzerine antiproliferasyonda artış
72
olduğu görülmüştür. En iyi etki 500 µg/mL konsantrasyonda belirlenmiştir.
Bitkinin su ekstraktı HT-29 hücre hattı üzerine, metanol ekstraktı ise HeLa hücre
hattı üzerine en yüksek antiproliferatif etkiyi göstermiştir. Su ekstraktı (500
µg/mL) HT-29 hücre hattı üzerine % 77 (hücre ölüm oranı) ve metanol ekstraktı
(500 µg/mL) HeLa hücre hattı üzerine aynı hücre ölüm oranı (% 77) ile
antiproliferatif etki gösterdiği tespit edilmiştir (p<0,05). En düşük antiproliferatif
etkiyi bitkinin su ekstraktı HeLa hücre hattı üzerine göstermiştir. Bitkinin kanser
hücresi üzerinde gösterdiği antiproliferatif etkisinin yanında, sağlıklı hücre
kontrolü olarak kullanılan HGF-1 hücre hattı üzerine sitotoksik etki göstermemesi
önemli bir sonuç olup özellikle bu ekstraktların antikanser ajanı olarak
Hücre ölümü (%)
kullanımında önemlidir.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HT-29
HeLa
Caco-2
HGF-1
Kontrol
100
250
500
100
250
500
Metanol Ekstraktı / Su Ekstraktı (µg/ml)
Şekil 4.2. Tanacetum albipannosum bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29,
HeLa ve Caco-2 hücre hatları üzerine antiproliferatif etkisi
73
T. albipannosum bitkisinin 500 µg/mL konsantrasyondaki metanol ve su
ekstraktlarının birbirine yakın oranlarda antiproliferatif etki gösterdiği tespit
edilmiştir. Bitkinin her iki ekstraktı da en yüksek antiproliferatif etkiyi Caco-2 hücre
hattı üzerine göstermiştir. Antiproliferatif etkiyi bitkinin su ekstraktı % 60 ve
metanol ekstraktı % 58 oranında gösterdiği belirlenmiştir (p<0,05) (Şekil 4.2).
100
90
Hücre ölümü (%)
80
70
60
HT-29
50
HeLa
40
Caco-2
30
HGF-1
20
10
0
Kontrol
100
250
500
100
250
500
Metanol Ekstraktı / Su Ekstraktı (µg/ml)
Şekil 4.3. Achillea sp. nova bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29, HeLa ve
Caco-2 hücre hatları üzerine antiproliferatif etkisi
Şekil 4.3’de görüldüğü gibi A. sp. nova, en yüksek antiproliferatif etkiyi Caco-2
hücre hattı üzerine göstermiştir. Caco-2 hücre hattı üzerine antiproliferatif etkiyi
bitkinin metanol ekstraktının (500 µg/mL) % 67 oranında gösterdiği bulunmuştur
(p<0,05). Yüksek antiproliferatif etkinin yanında A. sp. nova’nın metanol ve su
ekstraktlarının
hiçbir
konsantrasyonu
sağlıklı
hücrelere
sitotoksik
etki
göstermemiştir.
Bu sonuçlar doğrultusunda üç kanser hücre hattı antiproliferatif etki bakımından
karşılaştırıldığında bitki ekstraktındaki konsantrasyon artışına paralel olarak
74
antiproliferatif etkinin de artış gösterdiği görülmüştür. Kanser hücreleri arasında en
yüksek antiproliferatif etki HeLa ve HT-29 hücre hatlarında tespit edilmiştir. Bu
etkiyi HeLa hücre hattında C. depressa (% 77 hücre ölümü) metanol ekstraktı (500
µg/mL) ve HT-29 hücre hattında ise yine C. depressa (% 77 hücre ölümü) su
ekstraktı (500 µg/mL) göstermiştir. İkinci derecede yüksek antiproliferatif etkinin A.
nova’nın metanol ekstraktı (500 µg/mL) Caco-2 kanser hücrelerine gösterdiği
belirlenmiştir. Tüm bitki ekstraktlarında genel olarak metanol ekstraktı, su
ekstraktına göre kanser hücrelerine daha yüksek antiproliferatif etki göstermiştir.
Örnekler arasında anlamlı fark olup olmadığı veri sayısı dikkate alınarak incelenmiş
ve istatistiksel analizler, SPSS 16.0 programı tek yönlü varyans analizi (ANOVA)
post host Dunnett çoklu karşılaştırma testi (Dunnett T3 testi) kullanılarak yapılmıştır.
Elde edilen sonuçlara göre HeLa hücre hattında en yüksek ölçümlerin bulunduğu
örnek C. depressa metanol ekstraktı (500 µg/mL) ve HT-29 hücre hattında en yüksek
ölçümlerin bulunduğu örnek C. depressa su ekstraktıdır.
4.3. Bitkilerin Antioksidan Etkilerinin Belirlenmesi
4.3.1. Total antioksidan aktivitesinin belirlenmesi
Bitkilerin çeşitli ekstraktlarının kanser hücre hatları üzerine total antioksidan
aktivitesi total antioksidan kiti ile belirlenmiştir. Kit prensibine göre yapılan analizde
su ve yağda çözünebilir antioksidanlar ayrılamadığı için tüm bileşenlerin total
antioksidan aktiviteleri değerlendirilmiştir. Analiz; antioksidanların örneklerde
ABTS (2, 2’- Azino-di-[3-etilbenzotiyozolin sülfanat])’ nin metmiyoglobin aracılığı
ile ABTS®+’ ye oksidasyonunu inhibe etme yeteneğine dayanmaktadır. Örneklerdeki
total antioksidan kapasitesi suda çözünebilen tokoferol analoğu olan trolox ile
karşılaştırılmakta ve mM trolox eşitliği olarak hesaplama yapılmaktadır. Buna göre
uygulamada, kontrol grubu olarak bitki örnekleri muamele edilmemiş HeLa, HT-29
ve Caco-2 hücre hatları, medium içerisinde kullanılmıştır. Çalışmada Centaurea
depressa, Achillea sp. nova ve Tanacetum albipannosum ekstraktlarının (su ve
metanol) 250 ve 500 µg/mL konsantrasyonlarda HT-29, HeLa ve Caco-2 hücre
hatları üzerine total antioksidan kapasitesine bakılmıştır.
75
Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında HeLa hücre hattı üzerine A. sp. nova’ nın su
ekstraktı (500 µg/mL), HT-29 hücre hattı üzerine A. sp. nova’ nın metanol ekstraktı
(500 µg/mL) ve Caco-2 hücre hattı üzerine yine A. sp. nova’ nın metanol ekstraktı
(500 µg/mL) en yüksek total antioksidan aktivite göstermiştir. HeLa ve Caco-2
kanser hücre hatları üzerine A. sp. nova aynı oranlarda fakat düşük total antioksidan
aktivite gösterirken, C. depressa ve T. albipannosum bitki ekstraktları ise bu hücre
hatları üzerine total antioksidan aktivite göstermemiştir.
0,5
Trolox (mM)
0,4
0,3
HT-29
HeLa
0,2
Caco-2
0,1
0
Kontrol
250
500
250
500
Metanol Ekstraktı / Su Ekstraktı (µg/mL)
Şekil 4.4. C. depressa bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29, HeLa ve Caco-2
kanser hücre hatları üzerine total antioksidan etkisi
Şekil 4.4’te görüldüğü gibi kontrol grubu ile karşılaştırıldığında tüm hücrelerde C.
depressa’nın sadece 500 µg/mL konsantrasyondaki su ekstraktının HT-29 hücre hattı
üzerine antioksidan etki gösterdiği belirlenmiştir. HT-29 hücre hattı için kullanılan
kontrol grubunda antioksidan kapasite 0,28 mM trolox’ tur. Buna göre bitkinin su
ekstraktının HT-29 hücre hattı üzerinde gösterdiği total antioksidan kapasitesi 0,41
mM trolox olarak hesaplanmıştır (p<0,05). HeLa ve Caco-2 hücre hatları üzerine
76
bitkinin su ve metanol ekstraktlarının hiçbir konsantrasyonu total antioksidan aktivite
göstermemiştir.
0,5
Trolox (mM)
0,4
0,3
HT-29
HeLa
0,2
Caco-2
0,1
0
Kontrol
250
500
Metanol Ekstraktı
250
/
500
Su Ekstraktı (µg/mL)
Şekil 4.5. T. albipannosum bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29, HeLa ve
Caco-2 kanser hücre hatları üzerine total antioksidan etkisi
T. albipannosum bitkisi C. depressa ile benzer sonuçlar göstermiş ve yakın oranlarda
total antioksidan aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur (Şekil 4.5). T. albipannosum
kontrol grubu ile karşılaştırıldığında en yüksek total antioksidan aktiviteyi HT-29
hücre hattı üzerine göstermiştir. Bitkinin su ekstraktının (500 µg/mL) HT-29 hücre
hattı üzerine gösterdiği total antioksidan kapasitesi 0,43 mM trolox olarak
hesaplanmıştır
(p<0,05). HeLa ve Caco-2
hücre hatları üzerine ise
T.
albipannosum’un su ve metanol ekstraktlarının hiçbir konsantrasyonu total
antioksidan aktivitesi tespit edilememiştir.
77
0,5
Trolox (mM)
0,4
0,3
HT-29
HeLa
0,2
Caco-2
0,1
0
Kontrol
250
500
250
500
Metanol Ekstraktı / Su Ekstraktı (µg/mL)
Şekil 4.6. A. sp. nova bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29, HeLa ve Caco-2
kanser hücre hatları üzerine total antioksidan etkisi
A. sp. nova bitkisi kontrol grubu ile karşılaştırıldığında en yüksek total antioksidan
aktiviteyi HT-29 hücre hattı üzerine göstermiştir. Bitkinin su ekstraktının (500
µg/mL) HT-29 hücre hattı üzerinde gösterdiği total antioksidan kapasitesi 0,48 mM
trolox’ tur (p<0,05). HeLa ve Caco-2 hücre hatları üzerine ise A. sp. nova’ nın su ve
metanol ekstraktlarının 500 µg/mL konsantrasyonu düşük total antioksidan aktivite
göstermiştir (Şekil 4.6).
Elde edilen veriler değerlendirildiğinde üç kanser hücre hattında total antioksidan
aktivite karşılaştırıldığında doz artışına paralel olarak bitkiler sadece HT-29 hücre
hattı üzerine yüksek antioksidan etki göstermiştir (p<0,05). HT-29 hücre hattı
üzerine en yüksek antioksidan etkiyi A. sp. nova’ nın metanol ekstraktı (500 µg/mL)
göstermiştir. Bu etki 0,48 mM trolox olarak bulunmuştur. C. depressa ve T.
albipannosum HeLa ve Caco-2 hücre hatları üzerine antioksidan etki göstermeyip
HT-29 hücre hattı üzerinde düşük total antioksidan etki göstermiştir.
78
4.3.2. Süperoksit dismutaz analizi
Çalışmada süperoksit dismutaz (SOD) aktivitesi SOD analiz kiti ile belirlenmiştir.
Kit prensibine göre ksantin oksidaz ve hipoksantin aracılığı ile üretilen süperoksit
radikallerinin (O2-) belirlenmesi için tetrazoliyum tuzu kullanılır. Süperoksit
radikalleri tetrazoliyum tuzu ile reaksiyona girerek formazan boyasını oluşturmuştur.
SOD ise süperoksit radikallerini ortamdan uzaklaştırarak formazan reaksiyonunu
inhibe etmiştir. Uygulamada, kontrol grubu olarak bitki örnekleri muamele
edilmemiş HeLa, HT-29 ve Caco-2 hücre hatları, medium içerisinde kullanılmıştır.
Çalışmada Centaurea depressa, Achillea sp. nova ve Tanacetum albipannosum
ekstraktlarının (su ve metanol) 250 ve 500 µg/mL konsantrasyonlarda HT-29, HeLa
ve Caco-2 hücre hatları üzerine süperoksit dismutaz aktivitesine bakılmıştır. Çalışma
sonucunda kontrol grubu ile karşılaştırıldığında tüm bitkiler HeLa ve HT-29 hücre
hatları üzerine SOD aktivitesi göstermiş olup Caco-2 hücre hattı üzerine SOD
aktivitesi göstermemişlerdir. HeLa hücreleri üzerine A. nova’ nın su ekstraktının
(500 µg/mL), HT-29 hücreleri üzerine T. albipannosum’ un su ekstraktının (500
µg/mL) yüksek SOD aktivitesi gösterdiği belirlenmiştir. En yüksek SOD aktivitesini
HeLa hücreleri üzerine A. nova’ nın su ekstraktının gösterdiği tespit edilmiştir.
3
SOD (U/mL)
2,5
2
HT-29
1,5
HeLa
1
Caco-2
0,5
0
Kontrol
250
500
Metanol Ekstraktı
/
250
500
Su Ekstraktı (µg/mL)
Şekil 4.7. C. depressa bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29, HeLa ve Caco-2
kanser hücre hatları üzerine SOD aktivitesi (U/mL)
79
C. depressa bitkisi kontrol grubu ile karşılaştırıldığında üç kanser hücresi arasında en
yüksek SOD aktivitesini HeLa hücreleri üzerine göstermiştir (Şekil 4.7). 250 ve 500
µg/mL konsantrasyonda su ekstraktının her ikisinde de SOD aktivitesinin HeLa
hücresinde arttığı tespit edilmiştir. Ancak en yüksek SOD aktivitesinin bitkinin su
ekstraktının (500 µg/mL) gösterdiği, bu aktivitenin de 2,36 U/mL olduğu
görülmüştür (p<0,05). Bitki HT-29 hücreleri üzerine de SOD aktivitesini arttırmıştır
ve bu aktivite HeLa hücreleri üzerindeki SOD aktivitesine göre düşük değerdedir.
HT-29 hücrelerinde en iyi SOD aktivitesi 500 µg/mL metanol ekstraktında (1,75
U/mL)
belirlenmiştir.
Caco-2
hücreleri
üzerine
C.
depressa’
nın
hiçbir
konsantrasyonu SOD aktivitesi göstermemiştir.
3
SOD (U/mL)
2,5
2
HT-29
1,5
HeLa
Caco-2
1
0,5
0
Kontrol
250
500
Metanol Ekstraktı /
250
500
Su Ekstraktı (µg/mL)
Şekil 4.8. T. albipannosum bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29, HeLa ve
Caco-2 kanser hücre hatları üzerine SOD aktivitesi (U/mL)
Şekil 4.8’de görüldüğü gibi T. albipannosum kontrol grubuna göre en yüksek SOD
aktivitesini HT-29 hücre hattı üzerine göstermiştir. 250 ve 500 µg/mL
konsantrasyonda su ekstraktının her ikisinde de SOD aktivitesinin HT-29 hücresinde
arttığı tespit edilmiştir. Ancak en yüksek SOD aktivitesinin bitkinin su ekstraktının
(500 µg/mL) gösterdiği, bu aktivitenin de 1,9 U/mL olduğu görülmüştür (p<0,05).
80
Bitki HeLa hücreleri üzerine de SOD aktivitesini arttırmıştır ve bu aktivite HT-29
hücreleri üzerindeki SOD aktivitesine göre düşük değerdedir. HeLa hücrelerinde en
iyi SOD aktivitesi 500 µg/mL su ekstraktında (1,62 U/mL) belirlenmiştir. Caco-2
hücreleri üzerine T. albipannosum’ nın hiçbir konsantrasyonu SOD aktivitesi
göstermemiştir.
3
SOD (U/mL)
2,5
2
HT-29
1,5
HeLa
Caco-2
1
0,5
0
Kontrol
250
500
Metanol Ekstraktı /
250
500
Su Ekstraktı (µg/mL)
Şekil 4.9. A. sp. nova bitkisinin metanol ve su ekstraktının HT-29, HeLa ve Caco-2
kanser hücre hatları üzerine SOD aktivitesi (U/mL)
A. sp. nova’ nın, kontrol grubuna göre en yüksek SOD aktivitesi gösterdiği hücre
hattı HeLa olmuştur (Şekil 4.9). 500 µg/mL konsantrasyonda su ekstraktının SOD
aktivitesinin HeLa hücresinde arttığı tespit edilmiştir. Ancak en yüksek SOD
aktivitesinin bitkinin su ekstraktının (500 µg/mL) gösterdiği, bu aktivitenin de 2,56
U/mL olduğu görülmüştür (p<0,05). Bitkinin metanol ekstraktının (500 µg/mL) en
yüksek SOD aktivitesi de yine HeLa hücreleri üzerine olmuştur. Bu aktivite 2,34
U/mL’ dir. Bitki HT-29 hücreleri üzerine de SOD aktivitesini arttırmıştır ve bu
aktivite HeLa hücreleri üzerindeki SOD aktivitesine göre düşük değerdedir. HT-29
hücrelerinde en iyi SOD aktivitesi 500 µg/mL su ekstraktında (1,71 U/mL)
81
belirlenmiştir. Caco-2 hücreleri üzerine C. depressa’ nın hiçbir konsantrasyonu SOD
aktivitesi göstermemiştir.
Genel olarak kanser hücre hatları üzerine SOD aktivitesi bitkilerin artan
konsantrasyonuna bağlı olarak da artış göstermiştir. Bitki ekstraktları arasında su
ekstraktının gösterdiği SOD aktivitesi metanol ekstrakta oranla çok daha yüksek ve
etkili olmuştur. Kanser hücreleri arasında en yüksek SOD aktivitesinin görüldüğü
hücre hattı ise HeLa olmuştur. Bitkilerin kanser hücreleri üzerindeki antioksidan
etkilerini belirlemek amacı ile hem total antioksidan etkiye hem de SOD aktivitesine
bakarak elde ettiğimiz sonuçlara göre bitkilerin antioksidan aktiviteleri hücreye göre
değişiklik göstermiştir. Total antioksidan aktivitede en yüksek etki HT-29
hücrelerinde, SOD aktivitesinde en yüksek etkinin HeLa hücrelerinde olduğu tespit
edilmiştir. Üç bitki arasında karşılaştırma yapıldığında A. sp. nova her iki antioksidan
aktivite için de yüksek etki göstermiştir. Elde edilen diğer bir sonuç da hiçbir bitki
ekstraktının hem total antioksidan kapasitesi bakımından hem de SOD aktivitesi
bakımından Caco-2 hücreleri üzerine etki göstermediğidir.
4.4. Bitkilerin Genotoksik ve Antigenotoksik Etkisi
Çalışmamızda C. depressa, T. albipannosum ve A. sp. nova türlerinin metanol ve su
ekstraktlarının insan lenfositlerinde olası genotoksik ve H2O2 tarafından oluşturulan
oksidatif DNA hasarını engelleyici antigenotoksik etkileri comet yöntemi ile
araştırılmıştır. Genotoksik etki için bitki ekstraktlarının 100, 250 ve 500 μg/mL
konsantrasyonları ve antigenotoksik etki için bitki ekstraktlarının 500 μg/mL
konsantrasyonu ile çalışma yapılmıştır. Bu çalışmalar sonucu elde edilen veriler
Çizelge 4.2 ve Çizelge 4.3’de verilmiştir.
82
Çizelge 4.2. Bitki türlerinin insan lenfositleri üzerindeki genotoksik etkisi
Test Maddesi
Konsantrasyon
Kuyruk
Kuyruk
Kuyruk
(µg/mL)
uzunluğu (µm)
momenti
yoğunluğu (%)
Negatif kontrol1
-
28,8 ± 1,6
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
Pozitif kontrol2
-
74,1 ± 1,9
18,3 ± 0,1
54,2 ± 2,4
C. depressa
100
28,1 ± 1,1
0,0 ± 0,0
0,1 ± 0,00
250
28,5 ± 1,4
0,0 ± 0,0
0,1 ± 0,00
500
30,1 ± 1,1
0,3 ± 0,1
0,8 ± 0,00
100
30,3 ± 1,2
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
250
31,2 ± 1,2
0,1 ± 0,0
0,3 ± 0,0
500
33,5 ± 1,1
0,2 ± 0,1
0,5 ± 0,0
100
32,2 ± 1,1
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
250
29,2 ± 1,3
0,0 ± 0,0
0,1 ± 0,0
500
34,5 ± 1,1
0,0 ± 0,0
0,2 ± 0,0
100
29,1 ± 0,8
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
250
29,4 ± 2,3
0,1 ± 0,1
0,2 ± 0,0
500
35,1 ± 1,1
0,1 ± 0,0
0,4 ± 0,0
100
33,3 ± 1,1
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
250
34,6 ± 0,3
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
500
28,1 ± 1,3
0,1 ± 0,0
0,1 ± 0,0
100
32,4 ± 1,6
0,0 ± 0,0
0,1 ± 0,0
250
32,6 ± 1,9
0,0 ± 0,0
0,1 ± 0,0
500
35,6 ± 1,1
0,0 ± 0,0
0,1 ± 0,0
metanol ekstraktı
C. depressa
su ekstraktı
A. sp. nova
metanol ekstraktı
A. sp. nova
su ekstraktı
T. albipannosum
metanol ekstraktı
T. albipannosum
su ekstraktı
1
2
Negatif kontrol, D-PBS ve lenfosit içerir. H2O2 ve bitki ile muamele yapılmamıştır.
Pozitif kontrol, D-PBS, lenfosit ve 50 μM H2O2 içerir. H2O2 uygulanarak, genetik hasar yaratılmıştır.
83
C. depressa, T. albipannosum ve A. sp. nova su ve metanol ekstraktlarının
genotoksik etkisi incelendiğinde, kuyruk yoğunluğu ve kuyruk uzunluğuna göre bu
ekstraktların 100, 250 ve 500 μg/mL konsantrasyonlarının hiçbirisinin herhangi bir
DNA hasarına neden olmadığı belirlenmiştir. H2O2 muamelesi sonucu oluşan hasarlı
lenfositlerde kuyruk yoğunluğunun % 54,2 ± 2,4 olduğu tespit edilmiştir. Ancak bitki
ekstraktları muamele edilmiş lenfositlerde kuyruk yoğunluğu en düşük 0,0 ± 0,0
(genotoksik etki yok) ve en yüksek 0,4 ± 0,0 (önemsenmeyecek derecede düşük
genotoksik etki) olduğu görülmüştür.
Çizelge 4.3. Bitki türlerinin H2O2 ile muamele edilmiş insan lenfositleri üzerindeki
antigenotoksik etkisi
Test Maddesi
1
2
Konsantrasyon
Kuyruk
Kuyruk
Kuyruk
(µg/mL)
uzunluğu (µm)
momenti
yoğunluğu (%)
Negatif kontrol1
-
28,8 ± 1,6
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
Pozitif kontrol2
-
74,1 ± 1,9
18,3 ± 0,1
54,2 ± 2,4
*CME + H2O2
500
60,1 ± 1,4
10,2 ± 0,5
31,2 ± 0,7
*CSE + H2O2
500
28,3 ± 1,1
4,3 ± 0,7
13,3 ± 0,3
*AME + H2O2
500
36,2 ± 1,5
5,6 ± 0,5
17,4 ± 0,5
*ASE + H2O2
500
32,4 ± 1,7
5,1 ± 0,8
15,2 ± 0,6
*TME + H2O2
500
40,2 ± 1,2
6,3 ± 0,8
19,1 ± 0,2
*TSE + H2O2
500
50,1 ± 1,4
7,9 ± 0,6
24,2 ± 1,1
Negatif kontrol, D-PBS ve lenfosit içerir. H2O2 ve bitki ile muamele yapılmamıştır.
Pozitif kontrol, D-PBS, lenfosit ve 50 μM H2O2 içerir. H2O2 uygulanarak, genetik hasar yaratılmıştır.
*CME; C. depressa metanol ekstraktı, CSE; C. depressa su ekstraktı, AME; A. sp. nova metanol
ekstraktı, ASE; A. sp. nova su ekstraktı, TME; T. albipannosum metanol ekstraktı, TSE; T.
albipannosum su ekstraktı
84
Resim 4.1. Bitki türlerinin su ve metanol ekstraktlarının (500 µg/mL) H2O2 ile
muamele edilmiş insan lenfosit hücrelerine karşı gösterdiği genetik hasarı
önleyici etkisinin kuyruk yoğunluğuna göre belirlenmesi
Bitki ekstraktlarının hücrelerde H2O2 ile yaratılan DNA hasarına karşı koruyucu
etkisi (antigenotoksisite) comet yöntemi ile belirlenmiştir. Negatif kontrol grubunda,
herhangi bir H2O2 uygulaması yapılmamış olup bu kontrol grubunda hasarsız lenfosit
hücrelerinin yuvarlak, kenarlarının daha az yoğun ve çekirdek kısmının parlak bir
ışık görünümüne sahip olduğu görülmüştür. Bu şekilde görünen hücreler kuyruksuz
olarak değerlendirilmiştir. H2O2 ile muamele edilen lenfosit hücrelerinin bulunduğu
pozitif kontrol grubunda ise DNA’da oluşan kırıklardan dolayı çekirdek dışına
göçünün de başlaması sebebi ile kenarları düzensiz bir görünüm kazanmış lenfositler
85
kuyruklu yıldız görüntüsü almışlardır. Merkezden kenara doğru hasar şiddetine göre
uzama meydana gelmektedir. Bu kuyruk uzunluğu oluşan hasar ile doğrudan ilişkili
olup kuyruktaki floresan yoğunluğu da hasarın derecesi ile paralellik gösterir. H 2O2
ile birlikte bitki ekstraktlarının uygulandığı deney gruplarında ise sadece düzensiz bir
kenar oluşumu mevcut olup, pozitif kontrol grubundaki lenfositler gibi bir kuyruk
oluşumu yoktur (Resim 4.1). Çizelge 4.3’ deki kuyruk yoğunluğu verilerine göre,
antigenotoksik etki bakımından en iyi sonucu C. depressa su ekstraktı (500 µg/mL)
(% 13,3 ± 0,3) göstermiştir. Bitki ekstraktlarının hasarlı lenfositlerin kuyruğundaki
DNA yoğunluğunda ve kuyruk uzunluğunda azalmaya neden olduğu görülmüştür.
Buna göre bitki ekstraktları H2O2’in indüklediği oksidatif DNA hasarını önemli
oranda azaltmışlardır (p<0,05).
H2O2’in indüklediği oksidatif DNA hasarı pozitif kontrol grubunda % 54,2 ± 2,4
olarak bulunmuştur. Bu hasarı C. depressa su ekstraktı % 76 ± 2,1 ve A. sp. nova su
ekstraktı % 72 ± 2,2 oranında inhibe ettiği görülmüştür. En düşük inhibisyon oranı C.
depressa metanol ekstraktı (% 43 ± 2,5 inhibisyon) olduğu tespit edilmiştir (Şekil
4.10). Buna göre bitkilerin DNA da yaratılan hasara karşı hasarı en yüksek oranda
inhibe eden bitkilerin C. depressa (su ekstraktı) ve A. sp. nova (metanol ekstraktı)
olduğu görülmüştür. Tüm bitkilerde su ve metanol ekstraktları arasında yaratılan
DNA hasarını en iyi inhibe etme özelliğini ise su ekstraktı göstermiştir. Ayrıca
kanser hücreleri üzerine en iyi antiproliferatif etki bakımından yüksek % ölüm oranı
gösteren bitkiler arasında C. depressa su ekstraktı ve A. sp. nova metanol ekstraktı ön
plana çıkmıştır. Bu sonuçlar doğrultusunda lenfosit hücrelerinde yaratılan DNA
hasarına karşı en yüksek inhibisyon oranı gösteren C. depressa (su ekstraktı) ve A.
sp. nova (metanol ekstraktı) bitkilerinin antigenotoksik etkileri ile antiproliferatif etki
arasında korelasyon olduğu görülmüştür.
86
100
90
% İnhibisyon
80
70
60
50
40
30
20
10
0
CSE
ASE
AME
TME
TSE
CME
Şekil 4.10. H2O2’in indüklediği DNA hasarına bağlı oluşan genotoksisitenin
bitki ekstraktları tarafından inhibisyonu
4.5. Bitkilerin Apoptotik Etkisinin Belirlenmesi ve Morfolojik Olarak
Değerlendirilmesi
Bitki ekstraktlarının kanser hücrelerini apoptoza götürüp götürmediği Cell Death
Detection
ELİSAPlus
kiti
kullanılarak
belirlenmiştir.
Bu
çalışmada
bitki
ekstraktlarının yüksek antiproliferatif etkiye sahip konsantrasyonu olan 500 µg/mL
ile çalışılmıştır. Bitkilerin her iki ekstraktı (500 µg/mL) HeLa, Caco-2 ve HT-29
kanser hücre hatları ile muamele edilmiştir. Örneklerden elde edilen hücre lizatı,
tabanı streptavidin kaplı mikroplağa eklenmiş ardından anti-histon ve anti-DNAperoksidaz (anti-DNA-POD) da ilave edilerek inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon
esnasında anti-histon antikoru nükleozomların histon bileşiklerine bağlanmış ve
immünokompleks oluşmuştur. Anti-DNA-POD ise nükleozomların DNA’ları ile
reaksiyona girmiştir. İmmünokompleksteki POD aracılığı ile de nükleozomların
miktarı belirlenmiştir. Optik yoğunluk 405 nm de ölçülmüştür. Apoptotik etki
nükleozomların miktarı ile orantılı olup çıkan sonuç zenginleştirme faktörü olarak
değerlendirilmiştir.
87
Bu analiz sonucunda en yüksek apoptotik etkinin HT-29 hücre hattı üzerine A. sp.
nova türünün su ekstraktı (500 µg/mL) ile olduğu görülmüştür. Bu etki 3,93zenginleştirme faktörü olup bunu takiben aynı hücre hattında T. albipannosum
türünün metanol ekstraktının apoptotik etkisi 3,69- zenginleştirme faktörüdür
(p<0,05). En düşük apoptotik etkiyi HT-29 hattı üzerine C. depressa metanol
ekstraktı göstermiştir. Bu etki 1,10- zenginleştirme faktörüdür.
C. depressa türünün su ve metanol ekstraktı arasında karşılaştırma yapıldığında
bitkinin su ekstraktının kanser hücreleri üzerinde gösterdiği apoptotik etki metanol
ekstraktınkinden yüksek olmuştur (Şekil 4.11). Bitki kanser hücreleri arasında en
yüksek etkiyi HeLa hücreleri üzerine göstermiştir. Gösterdiği bu etki 3,11zenginleştirme faktörüdür (p<0,05). En düşük apoptotik etki ise HT-29 hücresi
üzerine olmuştur. Bu etki 1,1- zenginleştirme faktörüdür.
Zenginleştirme Faktörü
5
4
3
Kontrol
CME
2
CSE
1
0
HT-29
Caco-2
HeLa
Şekil 4.11. C. depressa metanol ve su ekstraktının kanser hücre hatları (HeLa, HT-29
ve Caco-2) üzerine apoptotik etkisi
A. sp. nova türünün metanol ve su ekstraktlarının kanser hücreleri üzerine olan
etkilerine bakıldığında en etkili ekstraktın su ekstraktı olduğu görülmüştür (Şekil
88
4.12). Bitki kanser hücreleri arasında en yüksek etkiyi HT-29 hücreleri üzerine
göstermiştir. Gösterdiği bu etki 3,93- zenginleştirme faktörüdür (p<0,05). En düşük
apoptotik etki ise Caco-2 hücresi üzerine olmuştur. Bu etki 1,08- zenginleştirme
faktörüdür.
Zenginleştirme Faktörü
5
4
3
Kontrol
AME
2
ASE
1
0
HT-29
Caco-2
HeLa
Şekil 4.12. A. sp. nova metanol ve su ekstraktının kanser hücre hatları (HeLa, HT-29
ve Caco-2) üzerine apoptotik etkisi
T. albipannosum türünün kanser hücreleri üzerine en yüksek apoptotik etkiyi diğer
bitki türlerinde olduğu gibi yine su ekstraktı göstermiştir (Şekil 4.13). Su ekstraktı bu
etkiyi A. sp. nova türünde olduğu gibi HT-29 hücre hattı üzerine göstermiştir.
Gösterdiği bu etki 3,93- zenginleştirme faktörüdür (p<0,05). En düşük apoptotik etki
ise Caco-2 hücresi üzerine olmuştur. Bu etki 1,18- zenginleştirme faktörüdür.
89
Zenginleştirme Faktörü
5
4
3
Kontrol
TME
2
TSE
1
0
HT-29
Caco-2
HeLa
Şekil 4.13. T. albipannosum metanol ve su ekstraktının kanser hücre hatları (HeLa,
HT-29 ve Caco-2) üzerine apoptotik etkisi
4.6. Apoptotik İndeksin Belirlenmesi
Bitkilerin su ve metanol ekstraktının 500 µg/mL konsantrasyonu kanser hücreleri
(HeLa, HT-29 ve Caco-2) ile muamele edilerek apoptotik indeks belirlenmiştir.
Kontrol grubu olarak kanser hücrelerine bitki muamele edilmemiştir. Buna göre bitki
türleri arasında en yüksek apoptotik indeks oranını C. depressa su ekstraktı ve en
düşük apoptotik indeks oranını ise yine aynı bitkinin metanol ekstraktı HT-29 hücre
hattı üzerine göstermiştir. En yüksek apoptotik indeks % 70 oranında iken, en düşük
apoptotik indeks % 10 oranındadır.
Şekil 4.13 de kanser hücreleri üzerine C. depressa’ nın metanol ve su ekstraktlarının
apoptotik indeks oranları belirtilmiştir. Bitkinin metanol ekstraktının HT-29, HeLa
ve Caco-2 hücreleri üzerine apoptotik indeks oranı sırasıyla % 10, % 37, % 47; su
ekstraktının HT-29, HeLa ve Caco-2 hücreleri üzerine apoptotik indeks oranı
sırasıyla % 70, % 38 ve % 60’dır.
90
70
Apoptotik İndeks (%)
60
50
40
AME 500 µg/mL
30
ASE 500 µg/mL
20
10
0
HeLa
Caco-2
HT-29
Şekil 4.14. A. sp. nova metanol ve su ekstraktlarının HeLa, HT-29 ve Caco-2
üzerine apoptotik indeksi
Kanser hücreleri üzerine A. sp. nova’nın metanol ve su ekstraktlarının apoptotik
indeks oranları Şekil 4.14’de belirtilmiştir. Bitkinin metanol ekstraktının HT-29,
HeLa ve Caco-2 hücreleri üzerine apoptotik indeks oranı sırasıyla % 10, % 37, %
47; su ekstraktının HT-29, HeLa ve Caco-2 hücreleri üzerine apoptotik indeks oranı
sırasıyla % 70, % 38 ve % 60’dır.
91
70
Apoptotik İndeks (%)
60
50
40
TME 500 µg/mL
30
TSE 500 µg/mL
20
10
0
HeLa
Caco-2
HT-29
Şekil 4.15. T. albipannosum metanol ve su ekstraktlarının HeLa, HT-29 ve Caco-2
üzerine apoptotik indeksi
T. albipannosum türünün metanol ve su ekstraktlarının apoptotik indeks oranları
Şekil 4.15’te belirtilmiştir. Bitkinin metanol ekstraktının HT-29, HeLa ve Caco-2
hücreleri üzerine apoptotik indeks oranı sırasıyla % 35, % 25, % 65; su ekstraktının
HT-29, HeLa ve Caco-2 hücreleri üzerine apoptotik indeks oranı sırasıyla % 65, %
31 ve % 58’dir.
92
80
Apoptotik İndeks (%)
70
60
50
40
CDME 500 µg/mL
30
CDSE 500 µg/mL
20
10
0
HeLa
Caco-2
HT-29
Şekil 4.16. C. depressa metanol ve su ekstraktlarının HeLa, HT-29 ve Caco-2
üzerine apoptotik indeksi
Apoptotik indeksi en düşük bitki ise C. depressa metanol ekstraktıdır. Bu oran % 10
olup, etki gösterdiği hücre ise HT-29 dur. En düşük apoptotik etkiyi ise sırasıyla %
10, % 37 ve % 70; su ekstraktının HT-29, HeLa ve Caco-2 hücreleri üzerine %
apoptotik indeksi sırasıyla % 70, % 38 ve % 60’dır. Bu sonuç özellikle apoptozun
belirlenmesi deneyinin sonucu ile benzerlik göstermiş olup çalışmayı desteklemiştir.
Bitki türlerinin kanser hücreleri üzerine apoptotik etkisinin belirlenmesini takiben
kanser hücreleri üzerine apoptotik etkinin hücre zarındaki bozulmalar göz önünde
bulundurularak morfolojik olarak Hoechst 33342 boyası ile değerlendirilmesi
yapılmıştır. Bitkiler ile muamele olan kanser hücrelerinde hem nekroz hem de
apoptoz ölüm çeşitleri görülmüştür. Apoptoza uğrayan hücrelerde hücre zar
yapısında degredasyon ile birlikte hücrenin küçüldüğü gözlemlenmiştir. Şekil 4.17
A’ da bitki ile muamele edilmemiş kanser hücreleri, Şekil 4.17 B’ de bitki muamele
edilmiş kanser hücreleri parlak mavi renkte olup bu hücreler apoptoza uğramış
hücrelerdir; soluk mavi renkteki hücreler ise canlı hücrelerdir. Şekil 4.17 C’ de bitki
muamele edilmiş kanser hücreleri parlak turuncu renkteki hücreler ise nekrotik
hücrelerdir.
93
Şekil 4.17. Hoechst 33342 boyası ile apoptotik ve nekrotik HeLa hücrelerinin
floresan mikroskobu ile görüntüsü
94
4.7. Bitki Türlerinde Flavonoidlerin Araştırılması
Tüm bitki türlerinin su ve metanol ekstraktlarında flavonoidler bakımından araştırma
yapılmıştır. Bu sonuçlar Çizelge 4.4’de verilmiştir.
(µg/mL)
Apigenin
(µg/mL)
Kateşin
(µg/mL)
Genistein
(µg/mL)
Kamferol
(µg/mL)
Kuersetin
(µg/mL)
Rutin
(µg/mL)
Biochanin A
Ekstraktları
(µg/mL)
Bitki
Luteolin
Çizelge 4.4. C. depressa metanol ekstraktında (CME), C. depressa su ekstraktında
(CSE), T. albipannosum metanol ekstraktında (TME), T. albipannosum
su ekstarktında (TSE), A. sp. nova metanol ekstraktında (AME), A. sp.
nova su ekstraktında (ASE) araştırılan flavonoidler
CSE
0,78
Nd*
45
11
2,5
Nd
Nd
0,056
CME
1,1
Nd
33
15
2,1
Nd
Nd
0,14
TSE
0,75
Nd
30
13
1,6
Nd
Nd
Nd
TME
0,57
Nd
25
14
4,75
Nd
Nd
Nd
AME
0,86
Nd
33
10
2
Nd
26
0,17
ASE
0,63
Nd
40
11
0,9
Nd
11
0,075
* Nd: Negatif değer, flavonoid miktarı bulunmamıştır.
Flavonoidler arasında rutin, kuersetin, kamferol ve apigenin flavonoidleri ön plana
çıkmıştır. Biochanin a ve genistein hiçbir bitki türünde rastlanmamıştır. C. depressa
türünün su ekstraktında rutin flavonoidi yüksek miktarda bulunmuştur. Bitki türleri
arasında yüksek antiproliferatif etki oranına sahip C. depressa su ekstraktının içerdiği
rutin
miktarının
söylenebilmektedir.
yüksek
olmasına
bağlı
olarak
bu
etkiyi
gösterdiği
95
5. TARTIŞMA VE SONUÇ
Kanser, hücre büyümesini ve bölünmesini kontrol eden genlerin hasar görmesi ile
ortaya çıkan kompleks bir hastalıktır [Pal ve Nayak, 2010]. Günümüzde kanser tüm
dünya ülkelerinde büyük sorun teşkil eden hastalıkların başında gelmektedir.
Gelecek 20 yıl için Dünya Sağlık Örgütüne (WHO) bağlı Uluslararası Kanser
Araştırmaları Kurumunun (IARC) öngörüsü dünyadaki ölüm nedenlerinin arasında
kanserin birinci sırada olacağıdır [Tuncer, 2008].
Serviks (rahim ağzı) kanseri, kanser türleri arasında kadınlarda en sık rastlanan
meme kanserinden sonra ikinci sırada yer almaktadır [Parkin ve ark., 2005]. Kolon
kanseri ise görülme sıklığı bakımından tüm kanserler arasında 4. sırada yer
almaktadır [Hassen ve ark., 2012]. Kanser gelişimine neden olan etmenler arasında
sigara dumanı ve katranında bulunan kimyasal ve karsinojenik ajanlar, radyasyon ve
güneş ışığından gelen zararlı ultraviyole ışınlar, ağır metaller bulunmaktadır [Doll ve
Peto, 1981]. Bu zararlı etmenlere ek olarak; vitaminler, mineraller ve antioksidan
bileşikleri içeren gıdaların yetersiz tüketilmesi ile hücrelerin zararlı moleküllere ve
serbest radikallere karşı koruyucu, detoksifiye edici sistemlerinin ve savunma
mekanizmalarının zayıflaması da hücre hasarının artmasına yol açmakta ve böylece
kanser gelişimini tetiklemektedir.
Kanser tedavisinde kullanılan kemoterapik ilaçlar tedaviye bağlı olarak ağır yan
etkiler göstermektedir. Kanser tedavisinde mevcut kanser ilaçlarının dışında
kullanılan radyoterapi, cerrahi tedavi ve hormon terapisi gibi yöntemler tedavi
sonucunun başarı olasılığının düşük olması ve yan etkiler göstermeleri nedeni ile
tedavide kullanılabilecek başka yöntemlere arayışları arttırmıştır [Tekin ve ark.,
2012]. Yapılan klinik, epidemiyolojik ve deneysel çalışmalarda kanserin tedavisine
yönelik alternatif ve tamamlayıcı ilaçların ve tedavi yöntemlerinin ortaya
konulmasının önemi vurgulanmaktadır. Bitkiler kanserin birçok formunun tedavisi
için yüksek derecede etkili geleneksel ilaçların birincil kaynağını oluşturmaktadır.
Antikanser terapisi için kullanılan % 60’tan fazla antikanser ajanı bitki, deniz ya da
mikroorganizmalardan türevlidir [Jain ve ark, 2011]. Son yıllarda yapılan
96
epidemiyolojik çalışmalar insanlarda yüksek miktarda flavonoid alımının düşük
kanser prevalansı ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Flavonoidlerin kansere karşı
etki mekanizmaları karsinojen inaktivasyonu, antiproliferasyon, hücre döngüsünün
askıya alınması, apoptoz ve farklılaşmanın indüksiyonu, anjiyogenezin baskılanması,
antioksidasyon ve çoklu ilaç direncinin azaltılması ya da tüm bu mekanizmaların
kombinasyonu oluşturmaktadır [Vauzour ve ark., 2010; Jain ve ark., 2011].
Çalışmamız bu sebeple, kanser tedavisinde alternatif bir yöntem olarak bitkisel
kaynakların kolon ve serviks kanser hücrelerinin proliferasyonunu ve lenfositlerde
mutajen ajanların genotoksisitesini inhibe etmedeki rolü ve bu etkilerini hangi
mekanizma ile sağladığının anlaşılmasına yöneliktir. Bu düşünceden yola çıkarak
Türkiye’de yetişen ve Asteraceae familyasına ait endemik Tanacetum albipannosum
ve Achillea sp. nova; yaygın Centaurea depressa türlerinden elde edilen su ve
metanol ekstraktları ile kolorektal adenokarsinoma hücreleri olan HT-29 ve Caco-2
kanser hücre hatları; servikal kanser hücresi olan HeLa kanser hücre hattı
kullanılmıştır. Tüm bitkilerin su ve metanol ile elde edilen ekstraktları verim
bakımından karşılaştırıldığında, su ekstraktların veriminin metanol ekstraktınkine
göre daha yüksek olduğu bulunmuştur. Buna göre en yüksek verim A. sp. nova su
ekstraktında % 40,17 olarak hesaplanmıştır.
Çalışmamızda bitki türlerinden elde edilen su ve metanol ekstraktlarının üç kanser
hücre hattında da etkili olduğu belirlenmiştir. Literatür araştırmalarında, pek çok
bitki ekstraktlarının, kültür edilmiş kanser hücrelerinin gelişimini inhibe ettiği
bildirilmiştir. Yapılan mevcut çalışmalar kanser hücrelerinin canlılığının inhibisyonu
ya da azaltılması ve tümör büyüklüğünün düşürülmesi üzerine odaklanmıştır. Kwon
ve arkadaşları (2006), Pterocarpus santalinus bitki türünden elde edilen metanol
ekstraktlarının 5, 25, 50 ve 75 µg/mL konsantrasyonlarda HeLa serviks kanser hücre
hattına antiproliferatif
etkisini
araştırmışlardır.
Bu bitki
türü
en
yüksek
antiproliferatif etkiyi 75 µg/mL konsantrasyonu ile % 97 oranında en düşük
antiproliferatif etkiyi ise 5 µg/mL konsantrasyonu ile % 17 oranında göstermiştir.
Moringa oleifera bitkisine ait su, metanol ve hekzan ekstraktlarının HeLa hücreleri
üzerine yapılan antikanser çalışmasında antiproliferatif etki araştırılmıştır. Kullanılan
bitki konsantrasyonları 1, 10 ve 100 µg/mL olup bitkinin hekzan ve metanol
97
ekstraktları hücreler üzerine antiproliferatif etkisinin olmadığı tespit edilmiştir.
Ancak su ekstraktının 100 µg/mL konsantrasyonun % 60 oranında antiproliferatif
etki gösterdiği belirlenmiştir. HT-29 hücrelerinin canlılığı üzerine Pisonia aculeata
metanol ekstraktının etkisine bakılmıştır. Bu bitki türüne ait 5 farklı konsantrasyon
(62,5, 125, 250, 500 ve 1000 µg/mL) çalışılmış ve artan dozlara paralel olarak hücre
canlılığının azaldığı tespit edilmiştir. Çalışılan 250, 500 ve 1000 µg/mL
konsantrasyonlarda hücre ölümünün sırasıyla % 57, % 69 ve % 89,65 oranında
olduğu bildirilmiştir [Ghode ve ark., 2011]. Bu çalışmalardan yola çıkarak
çalışmamızda kullandığımız bitki türlerine ait metanol ve su ekstraktlarının kanser
hücrelerine antiproliferatif etkisi araştırılmıştır. Bitki ekstraktlarının kanser hücreleri
üzerine antiproliferatif etkisi Tripan mavisi yöntemi ile belirlenmiş ve Bkz.Şekil 4.1,
Şekil 4.2 ve Şekil 4.3’de ölü hücre yüzdesi olarak verilmiştir. Elde edilen sonuçlara
göre en yüksek antiproliferatif etkiyi Caco-2 hücreleri üzerine A. sp. nova metanol
ekstraktının (500 µg/mL) % 67 oranında, HT-29 hücreleri üzerine C. depressa su
ekstraktının (500 µg/mL) % 77 oranında ve HeLa hücreleri üzerine yine C. depressa
su ekstraktının (500 µg/mL) % 77 oranında gösterdiği tespit edilmiştir. Bu konuda
yapılan pek çok çalışma incelendiğinde sitotoksik aktivitenin çalışılan bitki ekstrakt
yoğunluğuna, etken maddelerin yoğunluğuna, kanser hücrelerinin tipine ve
kullanılan yönteme göre değişiklik gösterdiği görülmektedir. Sonuçlar doğrultusunda
metanol ve su ekstraktları antiproliferatif etki bakımından karşılaştırıldığında su
ekstraktının kanser hücreleri üzerine daha etkili olduğu değerlendirilmiştir. Bu sonuç
bitki ekstraktlarından elde edilen verim sonuçları ile paralellik göstermiştir.
Çalışmada kullandığımız bitki türleri ile Caco-2, HT-29 ve HeLa kanser hücreleri
üzerine antiproliferatif etkinin araştırıldığı bir çalışmanın olmadığı ve elde ettiğimiz
sonuçlarımızın başka bitki türlerinin Caco-2, HT-29 ve HeLa kanser hücreleriyle
yapılan çalışmalarda kullanılan konsantrasyonlarla karşılaştırıldığında antiproliferatif
etkinin yüksek ve önemli oranda olduğu tespit edilmiştir.
Bitkilerin kanser hücreleri üzerine antiproliferatif etkisinin yanında bu bitkilerin
kullanımında herhangi bir yan etkinin olup olmadığını belirlemek amacı ile sağlıklı
hücre hatları (insan gingivial fibroblast, HGF-1) üzerine sitotoksik etkisine
bakılmıştır. Bitki ekstraktlarının denenen tüm konsantrasyonlarda (100, 250 ve 500
98
µg/mL) sağlıklı hücreler üzerine herhangi bir sitotoksik etki göstermediği, ancak
kanser hücreleri üzerine bitki ekstraktlarının farklı oranlarda antiproliferatif etki
gösterdiği tespit edilmiştir. Tüm bitki ekstraktlarında genel olarak metanol ekstraktı,
su ekstraktına göre kanser hücreleri üzerine daha yüksek antiproliferatif etki ile ön
plana çıkmıştır. Konsantrasyon artışına paralel olarak üç bitki ekstraktının da her üç
kanser hücre hattına antiproliferatif etkisinin artış gösterdiği belirlenmiştir. Pek çok
antikanser ajanı piyasada mevcut olup kanser tedavisinde kullanımlarında tümör
hücrelerini inhibe etmeleri ya da oluşumlarını engellemelerinin yanında sağlıklı
hücrelerde sitotoksik etki yaratarak bu hücrelerin yok olmasına da neden
olmaktadırlar. Bitkilerin kanser hücre hatları üzerine yüksek antiproliferatif etki
göstermesi yanında sağlıklı hücre hattı üzerine herhangi bir sitotoksik etki
göstermemiş olması önemli bir sonuç olup böylelikle antikanser ajan olarak
kullanımlarını da mümkün kılabilmektedir.
Oksidatif stres, birçok kanser ve kardiyovasküler rahatsızlıkları içine alan ölümcül
hastalıklar ve Alzheimer’s, Parkinson gibi nörodejeneratif rahatsızlıklara neden olan
etmenlerin başında gelmektedir. Oksidatif stres, hücredeki serbest radikal üretimi ve
antioksidan sistem arasındaki dengenin bozulması sonucu oluşmaktadır [Kopani,
2006; Akan ve Garip, 2011]. Reaktif oksijen türevleri hücresel solunum ve normal
metabolizma esnasında oluşan reaktif moleküller olup bu ürünler birçok biyolojik
moleküle zarar verebilmektedir. Bunlar proteinlerin fonksiyonlarını değiştirebildiği
gibi DNA’da hasar oluşturmakta ve hücre zarlarında lipid peroksidasyonuna neden
olmaktadır [Kulbacka ve ark., 2009]. Bitkilerin içerdikleri flavonoid, fenolik asit gibi
fenolik bileşiklerin özellikle serbest radikallerin verdiği bu hasarlara karşı hücreyi
korumaya yardımcı olmaları bakımından farklı biyolojik aktiviteye sahip olduğu
bilinmektedir. Bu antioksidan etkiler süperoksit dismutaz (SOD), katalaz, glutatyon
peroksidaz,
glutatyon,
vitamin
E
ve
C
gibi
antioksidan
enzimler
ile
ilişkilendirilmektedir. Süperoksit dismutaz enzimi, oksijen toksisitesine karşı önemli
ve en etkin hücre içi antioksidanlardan biridir. Moleküler oksijenin fazladan bir
elektron alması sonucu oluşan reaktif oksijen metaboliti yani süperoksit radikalinin
(O2) ortadan kaldırılması, SOD enziminin katalize ettiği dismutasyon reaksiyonu ile
gerçekleşir. Bu dismutasyon reaksiyon esnasında SOD enzimi hücrelerde oluşan
99
yüksek toksisiteye sahip oksijen türlerinden süperoksit anyonunu (O2‾), hidrojen
peroksit (H2O2) ve oksijene dönüştürürek bu radikallerin etkisini azaltmaktadır
[Tardieu ve ark., 2000; Özelçi Kavas, 1994]. Dolayısıyla SOD’un hücrede artışı ile
serbest
radikal oluşumunda azalma olmakta ve oksidatif stres
oluşumu
engellenmektedir. Bu konuda yapılan çalışmalar mevcuttur. Pandey ve arkadaşları
(2011) yaptıkları çalışmada Datura innoxia su ekstraktını çeşitli konsantrasyonlarda
(50, 100 ve 200 µg/mL) HeLa hücreleri üzerine muamele etmişler ve SOD
aktivitesini belirlemek için hücreleri 24 ve 48 saat inkübe etmişlerdir. Buna göre
hücrelerin
SOD
aktivitesinin
arttığı
belirlenmiştir.
İnkübasyon
süreleri
karşılaştırıldığında ise 48 saat inkübasyon süresinin daha etkili olduğunu tespit
etmişlerdir. Kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında SOD aktivitesindeki artış önem
arz etmektedir. 2011 yılında yapılan bir çalışmada Terminalia arjuna su ekstraktının
çeşitli konsantrasyonlarda (25, 50 ve 100 µg/mL) ve farklı inkübasyon sürelerinde
(4, 8, 12, ve 24 saat) insan hepatoma kanser hücre hattı (HepG2) üzerine SOD
aktivitesini incelemişlerdir. Çalışma sonucunda konsantrasyon ve inkübasyon
sürelerinin artışına paralel olarak SOD aktivitenin arttığı; en yüksek aktiviteyi 24 saat
inkübasyon süresi ile 100 µg/mL konsantrasyonun sağladığı belirlenmiştir
[Shivananjappa ve Joshi, 2011]. Bizim çalışmamız sonucunda kontrol grubu ile
karşılaştırıldığında tüm bitkiler HeLa ve HT-29 hücre hatları üzerine SOD aktivitesi
göstermiş olup Caco-2 hücre hattı üzerine SOD aktivitesi göstermemişlerdir. HeLa
hücreleri üzerine A. sp. nova’ nın su ekstraktının 500 µg/mL konsantrasyonu (2,56
U/mL), HT-29 hücreleri üzerine T. albipannosum’ un su ekstraktının 500 µg/mL
konsatrasyonu (1,9 U/mL) yüksek SOD aktivitesi gösterdiği belirlenmiştir. En
yüksek SOD aktivitesini HeLa hücreleri üzerine A. sp. nova’ nın su ekstraktının
gösterdiği tespit edilmiştir. Bu şekilde oksidatif hasara ya da oluşan oksidatif hasar
sonucu kanser başta olmak üzere, kalp ve nörodejeneratif rahatsızlıklar gibi çeşitli
hastalıklara neden olan reaktif oksijen türlerinin metabolizmasının inhibe edilmesi ya
da engellenmesi konusunda antioksidan sistemlerini indükleyici bitkisel ajanların var
oluşu indirekt olarak antikanser mekanizmasında önemli ve etkin rol oynamaktadır.
Spanou ve arkadaşları (2010) Leguminosae familyasına ait Lathyrus laxiflorus ve
Phaseolus vulgaris bitkilerinden elde ettikleri su ekstraktlarının HeLa türevli Hep2
kanser hücre hattının gelişimine etkisini ve yine bu bitki ekstraktlarının antioksidan
100
savunma sistemine olan etkisini değerlendirmek amacıyla çalışma yapmışlardır.
Ekstraktların hücrelerdeki antioksidan savunma sistemine olan etkisi total
antioksidant kapasitesi (TAC) ile değerlendirilmiştir. Lathyrus laxiflorus ve
Phaseolus vulgaris bitkilerinin su ekstraktlarının farklı konsantrasyonlarını (100,
400, 800 µg/mL) Hep2 kanser hücre hattına muamele etmişlerdir. Sadece 400 ve 800
µg/mL konsantrasyonlardaki Lathyrus laxiflorus bitkisi kanser hücre gelişimini
engellemiştir. Phaseolus vulgaris bitkisinin ekstraktının hiçbir konsantrasyonu hücre
gelişimine etki göstermemiştir. Elde edilen sonuçlara göre yalnız L. laxiflorus
ekstraktı özellikle 2 ve 12 saat inkübasyon sonrası TAC aktivitesi ile hücrelerde
oksidatif stresi indüklediği bildirilmiştir. P. vulgaris ekstraktı 2 saat inkübasyon
sonrası yalnız TAC ile oksidatif stresi indüklemiştir.
Bizim çalışmamızda total antioksidan aktiviteyi belirlemek amacı ile trolox eşitliğine
(TEAC) dayalı yöntem kullanılmıştır. TEAC deneyi uzun ömürlü radikal anyonu
olan ABTS’ ye karşı antioksidanların süpürücü yeteneğini temel almaktadır
[Gonçalves ve ark., 2010]. Bu çalışmada metmyoglobin ile ABTS ABTS®·+ ‘ye
okside edilmiştir. Test örneklerinde üretilen ABTS miktarı bize total antioksidan
kapasitesini
göstermiştir.
Buna
göre
çalışmamızda
250
ve
500
µg/mL
konsantrasyonlarda Centaurea depressa, Achillea sp. nova ve Tanacetum
albipannosum ekstraktlarının (su ve metanol) HT-29, HeLa ve Caco-2 hücre hatları
üzerine total antioksidan kapasitesine bakılmıştır. Analiz sonucunda kontrol grubu ile
karşılaştırıldığında HeLa hücre hattı üzerine A. nova’ nın su ekstraktı 500 µg/mL
konsantrasyonu ile (0,35 µM trolox),
HT-29 hücre hattı üzerine A. nova’ nın
metanol ekstraktı 500 µg/mL konsantrasyonu (0,48 µM trolox) ve Caco-2 hücre
hattı üzerine yine A. sp. nova’ nın metanol ekstraktı 500 µg/mL konsantrasyonu
(0,35 µM trolox) en yüksek total antioksidan aktivite göstermiştir. HeLa ve Caco-2
kanser hücre hatları üzerine A. sp. nova aynı oranlarda fakat düşük total antioksidan
aktivite gösterirken C. depressa ve T. albipannosum bitki ekstraktları ise bu hücre
hatları üzerine total antioksidan aktivite göstermemiştir. Kanser hücreleri arasında
HT-29 hücrelerine tüm bitkiler antioksidan etki göstermiştir. Bu etkilerin bitki
ekstrakt çeşidine göre değişiklik gösterdiği tespit edilmiştir. Bitkiler daha çok
metanol ekstraktı ile ön plana çıkmıştır. Bitkilerin total antioksidan kapasiteleri, SOD
101
aktiviteleri ve antiproliferatif etkilerinin arasında korelasyon bulunmamıştır. Fakat
antioksidan etki ayrı olarak değerlendirildiğinde kontrol gruplarına göre yüksek etki
görülmüştür.
İyonize radyasyon, UV ışınları gibi fiziksel etkenler ve ksenobiyotikler, alkilleyiciler
gibi kimyasal ajanlar canlıda DNA moleküllerinde hasar oluşturmakta ve oluşan bu
hasar tamir edilemediğinde kansere ve yaşlanmaya yol açmaktadır [Debeleç Bütüner
ve Kantarcı, 2006; Dinçer ve Kankaya, 2010]. Genotoksik etkileri ile kanser nedeni
olan kimyasallara karşı koruyucu etki gösteren, antikanserojen, bitkisel bir ajan
olması kanserin gelişiminin önlenmesi bakımından oldukça önemlidir. Yapılan
araştırmalarda bitki türlerinden elde edilen ekstraktların kimyasal ajanlar ile
oluşturulan DNA hasarını azalttığı bildirilmiştir. Hidrojen peroksit (H2O2),
hücrelerde oksidatif strese bağlı genotoksiste çalışmalarında sıklıkla kullanılan
kimyasal bir ajandır. Bu amaçla insan lenfositlerine bir reaktif oksijen türevi olan
H2O2, bitki ekstraktlarının değişen konsantrasyonları ile birlikte muamele edilmiştir.
Bitki ekstraktlarının insan lenfositlerinde in vitro oksidasyona bağlı hücresel hasar ve
DNA hasarına karşı koruyucu etkisi tek hücre jel elektroforez comet yöntemiyle
belirlenmiştir. Çalışma sonucunda bitki ekstraktlarının antigenotoksik etkileri ortaya
çıkartılmıştır. 50 μM H2O2 kimyasal ajanı ile rat lenfositlerinde yaklaşık % 48 oranda
DNA hasarı yaratılmıştır. Bu hasara karşı Ferula persica bitkisinden elde edilen
persikasülfit A (PSA) maddesi ile lenfositlerdeki DNA hasarının yaklaşık % 20’ ye
düşürüldüğü bulunmuştur [Noroozi ve ark., 2008]. Çalışmamızda insan lenfositleri
kullanılmış olup, H2O2 ile yaratılan DNA hasarı yaklaşık % 43 olarak elde edilmiştir
(Çizelge 4.2 ve Çizelge 4.3). Bu DNA hasarını bitki ekstraktları önemli derecede
azaltmıştır. Soltani ve arkadaşları (2009) Ferula szowitsiana bitkisinden elde edilen
umbelliferin fitokimyasalının insan periferal lenfositleri üzerine antigenotoksik
etkisini araştırmışlardır. H2O2 ile lenfosit DNA’ sında oluşturulan % 70 oranındaki
genotoksik hasar, umbelliferin maddesinin (400 µM) lenfosit hücrelerine muamelesi
sonucunda % 50 olmuştur. Bizim çalışmamızda H2O2’in indüklediği oksidatif DNA
hasarı hiçbir bitki ekstraktı muamele edilmemiş lenfosit hücrelerinde % 54,2
oranında bulunmuştur. Bu hasarı C. depressa su ekstraktı % 76, A. sp. nova su
ekstraktı % 72, A. sp. nova metanol % 69, T. albipannosum metanol ekstraktı % 65,
102
T. albipannosum su ekstraktı % 55 ve C. depressa metanol ekstraktı % 43 oranında
inhibe etmiştir (Şekil 4.9). Barcelos ve arkadaşlarının (2007) yaptığı çalışmada
Anacardium occidentale L. (Kaju) bitkisinden elde edilen metanol ekstraktının Çin
Hamster akciğer fibroblastı (V79 hücreleri) üzerine genotoksik ve antigenotoksik
aktivitesi değerlendirilmiştir. Genotoksik değerlendirmede A. occidentale L.
bitkisinden elde edilen metanol ekstraktın (500, 1000 ve 2000 µg/mL) V79 hücre
kültürüne genotoksik etkisinin olmadığı gösterilmiştir. Bizim çalışmamızda
kullandığımız
konsantrasyonlar
konsantrasyonlarda
herhangi
100,
bir
250
ve
genotoksik
500
µg/mL
hasara
neden
olup
düşük
olmamıştır.
Antigenotoksik değerlendirme için Comet deneyi ile DNA hasarını indükleyen
mekanizmalar karşılaştırılmış ve bunun için metil metansülfanat (MMS) ajanı ile
hücrelerde genotoksik hasar yaratılmıştır. Çalışma sonucunda A. occidentale L.
ekstraktının
antigenotoksik
etkisinin
olduğu
belirlenmiştir.
Bu
etkinin
değerlendirilmesinde hücreler sınıflandırılmıştır. Buna göre MMS ile indüklenen
hücreler sınıf 3 ve 4’de yer alırken, A. occidentale L. muamelesi (500 µg/mL) sonucu
hücreler sınıf 2 ve 3’de, 1000 µg/mL ve 2000 µg/mL konsantrasyonda muamele
edilen hücreler ise sınıf 1 ve 2’de yer almıştır (Hasarsız DNA (sınıf 0), az DNA
hasarı (sınıf 1), orta DNA hasarı (sınıf 2), yüksek DNA hasarı (sınıf 3), oldukça
yüksek DNA hasarı (sınıf 4)). Bizim çalışmamızda ise, DNA hasar derecesi
bilgisayarlı görüntüleme sistemi ile belirlenmiş ve sonuçlar kuyruk yoğunluğu,
kuyruk momenti ve kuyruk göçü cinsinden değerlendirilmiştir.
Çeşitli çalışmalarda kullanılan H2O2 gibi kanser yaratıcı mutajen ajan, bitki ekstraktı,
ve bitki konsantrasyon farklılıkları göz önüne alındığında, çalışmamızda elde
ettiğimiz sonuçların önemli derecede anlamlı olduğu görülmektedir. Buna göre C.
depressa, T. albipannosum ve A. sp. nova metanol ve su ekstraktların 100, 250 ve
500 μg/mL konsantrasyonlarının insan lenfositlerinde herhangi bir DNA hasarına
neden olmadıkları ve hasar oluşturmayan konsantrasyonlarda oksidatif DNA hasarını
da azalttıkları bulunmuştur. Bitkiler arasında yaratılan DNA hasarına karşı en yüksek
inhibisyon oranına sahip bitki C. depressa’ nın su ekstraktı (% 76 inhibisyon)
olmuştur. Bitki türlerinden elde edilen flavonoid, polifenol gibi birçok biyoaktif
bileşiğin antioksidan özellik göstermeleri nedeniyle reaktif oksijen türevlerin
103
oluşturduğu hasara karşı organizmayı korumada ve bu hasara bağlı olarak meydana
gelen rahatsızlıkların tedavisinde rolleri büyüktür. C. depressa su ekstraktının DNA
üzerinde hem genotoksik hasara neden olmaması hem de kanserojen bir kimyasal
olan H2O2 ile yaratılan hasara karşı yüksek oranda inhibisyon etkiye sahip olması bu
bitkiyi ön plana çıkarmaktadır. Ayrıca bitki ekstraktlarının antiproliferatif etkisi ile
antigenotoksik etkileri arasında önemli oranda korelasyon olduğu ve yüksek
antiproliferatif etkiye sahip bitki türünün yine C. depressa su ekstraktı olduğu tespit
edilmiştir. Bu çalışma, kanser yaratıcı kimyasal bir karsinojene karşı bitki
ekstraktlarının özellikle C. depressa su ekstraktının göstermiş olduğu antigenotoksik
etkilerin indirekt olarak kanserden koruyucu özelliklerinin ortaya konulması
bakımından
önem
taşımakta
ve
çalışma
sonucunda
elde
edilen
veriler
değerlendirildiğinde bu bitkinin yan etkiye neden olmayan bir ajan olarak
kullanılması ve böylece insan sağlığı ve yaşam kalitesinin arttırılması mümkün
olmaktadır.
Apoptoz, normal hücre büyümesi ve homeostazisi için gerekli bir süreçtir. Son
yıllarda yapılan çalışmalarla bu dengenin bozulması sonucu apoptozun kontrolünde
oluşan anormalliklerin kanser başta olmak üzere birçok önemli hastalığın
patogenezinde rol aldığı gösterilmiştir [Gökçe ve ark., 2011; Mcphie ve ark., 2003].
Doğal
fenoliklerin
apoptozun indüklenmesini
sağlayarak tümör hücresinin
eliminasyonunda ve kanserde görev aldığı bildirilmiştir. Bu özellik güçlü bir
antikanser ajanı olarak geliştirmek için taranan bileşiklerin belirleyicisi olarak
kullanılmaktadır. 2007 yılında yapılan bir çalışmada insan prostat kanser hücre
hatlarına (LNCaP, PC-3 ve DU145) Matricaria chamomilla bitkisinin su (2000
μg/mL) ve metanol ekstraktı (200 μg/mL) muamele edilmiş ve 48 saat inkübasyona
bırakılmıştır. İnkübasyon sonrasında bitkinin her iki ekstraktının tüm hücrelere
apoptotik etkisi olduğu bildirilmiştir. Çalışmada bitkinin su ekstraktı LNCaP
hücreleri üzerine yüksek apoptotik etki (3,1- zenginleştirme faktörü) göstermiştir
[Srisvasta ve Gupta, 2007]. Kim ve arkadaşlarının 2005 yılında yaptığı çalışmada
Rubus coreanum su ekstraktını (100, 200 ve 400 µg/mL) HT-29 hücre hattına
muamele etmişler ve apoptozu indükleyip indüklemediğini araştırmışlardır. Bitki
ekstraktının artan konsantrasyonlarda kanser hücre hattı üzerine apoptotik etkisinin
104
de artış gösterdiğini tespit etmişlerdir. En yüksek apoptotik etkiyi 400 µg/mL
konsantrasyonu göstermiştir [Kim ve ark., 2005]. Bizim çalışmamız sonucunda en
yüksek apoptotik etkinin HT-29 hücre hattı üzerine A. sp. nova türünün su ekstraktı
(500 µg/mL) ile olduğu görülmüştür. Bu etki 3,93- zenginleştirme faktörü olup bunu
takiben aynı hücre hattında T. albipannosum türünün metanol ekstraktının apoptotik
etkisi 3,69- zenginleştirme faktörüdür. En düşük apoptotik etkiyi HT-29 hattı üzerine
C. depressa metanol ekstraktı göstermiştir. Bu etki 1,10- zenginleştirme faktörüdür.
A. sp. nova bitkisinin su ekstraktının düşük konsantrasyonlarda apoptotik etki
göstermesi önemli bir sonuçtur. Çalışmamızda elde ettiğimiz sonuçlara göre kontrol
grubu ile karşılaştırıldığında bitkilerin apoptotik etkilerinin arttığı görülmüştür.
Antiproliferatif etki ile apoptotik etki arasında bir korelasyon bulunmaktadır
(p<0,05). Buna göre HT-29 hücreleri üzerine % 67 oranında antiproliferatif etki ile
A. sp. nova bitkisinin su ekstraktı aynı zamanda apoptotik etki ile ön plana
çıkmaktadır.
Bitki
türlerinin
kanser
hücreleri
üzerine
apoptotik
etkisinin
belirlenmesini takiben kanser hücreleri üzerine apoptotik etkinin hücre zarındaki
bozulmalar göz önünde bulundurularak morfolojik olarak değerlendirilmesi
yapılmıştır. Bunun için bitki ekstraktlarının apoptotik indeksleri tespit edilmiştir.
Bitkiler ile muamele olan kanser hücrelerinde hem nekroz hem de apoptoz ölüm
çeşitleri görülmüştür. Apoptoza uğrayan hücrelerde hücre zar yapısında degredasyon
ile birlikte hücrenin küçüldüğü gözlemlenmiştir. Bitki türleri arasında apoptotik
indeks oranları değerlendirildiğinde ise en yüksek oran C. depressa su ekstraktı ve en
düşük apoptotik indeks oranı ise yine aynı bitkinin metanol ekstraktı HT-29 hücre
hattı üzerine göstermiştir. En yüksek apoptotik indeks % 70 oranında iken, en düşük
apoptotik indeks % 10 oranındadır. Apoptotik indeks ile apoptotik etki paralellik
göstermemiştir. Bitkiler luteolin, biochanin A, rutin, kuersetin, kamferol, genistein,
kateşin ve apigenin flavonoidleri bakımından taranmıştır. Flavonoidler arasında
rutin, kuersetin, kamferol ve apigenin elde edilen değerler literatürler ile
karşılaştırıldığında yüksek bulunmuştur. C. depressa su ekstraktında rutin miktarının
değeri (45 µg/mL) yüksek çıkmıştır. Genel sonuç değerlendirmelerine göre ön plana
çıkan bitkiler başta C. depressa su ekstraktı olmak üzere bir de A. sp. nova su
ekstraktıdır. Rutin flavonoidinin aracılığı ile antikanser mekanizmasını kanser
hücreleri üzerine etkili olduğu düşünülmektedir. Sitotoksik aktiviteye bağlı olarak
105
antiproliferatif etkinin ve bu etkinin apoptoz mekanizması ile doğrulanması; hücrede
meydana gelen oksidatif hasarın bitki konsantrasyonuna bağlı olarak uyarılması ve
SOD aktiviteleri bakımından bu bitki türleri ile bu kapsamda yapılmış bir çalışma
mevcut değildir. Bu nedenle bu alanda yapılacak çalışmalara önemli bir kaynak
olabilecektir. Ayrıca çalışmada elde edilen bulgular çok önemli olup, devam
çalışmaları ile başka çalışmalara temel oluşturabilecektir. Tüm bu sonuçlar
doğrultusunda sadece kanserde koruma ya da tedaviye yönelik değil aynı zamanda
ürogenital rahatsızlıklara karşı koruyucu; yeni ve etkin ilaçlara etken madde olarak
kullanılmaları da mümkündür. Böylece literatüre bu konuda ışık tutulmakta ve farklı
bilimsel araştırmalara oluşturulabilmektedir.
106
Tez çıkarımı ve öngörüler
1) Bitki türlerinin in vitro deneylerde tümör hücre gelişimini inhibe ettiği ve hayvan
denemelerinde ise kanser gelişimini engellediği bulunmuştur. Bu çalışmada bitki
türlerine ait su ve metanol ekstraktlarının antiproliferatif, süperoksit dismutaz
aktivite, total antioksidan kapasite, antigenotoksik ve apoptotik özellikleri ve bu
özelliklerin arasındaki ilişki ayrıntılı bir şekilde incelenmiştir.
2) Çalışmamızda Centaurea depressa, Tanacetum albipannosum ve Achillea sp.
nova bitkilerinin metanol ve su ekstraktlarının in vitro kültürde HT-29, HeLa ve
Caco-2 hücreleri üzerinde sitotoksik etkiye sahip olduğu belirlenmiştir. Bitkilerin
artan konsantrasyonlarına paralel olarak kanser hücreleri üzerine antiproliferatif
etkilerinin de arttığı bulunmuştur. Çalıştığımız konsantrasyonların literatürlere göre
çok yüksek konsantrasyonlar olmaması çalışmayı bu yönüyle de önemli kılmaktadır.
Düşük konsantrasyonlarda yüksek antiproliferatif etkinin görülmesi önem arz eden
olumlu bir sonuçtur. Böylece alternatif olarak ilaç formülasyonunda düşük
dozajlarda kullanılması insan sağlığı açısından da mümkün olabilecektir.
3) Bitki ekstraktlarının kanser hücrelerini öldürmelerinin yanında sağlıklı hücreleri
de öldürüp öldürmediğine bakılmıştır ve bunun sonucunda herhangibir ölüm oranın
olmadığı tespit edilmiştir. Bu özellik antikanser ajan seçiminde çok önemlidir. Pek
çok antikanser ajanın kanser tedavisinde kullanımında yan etkilere sahip olduğu ve
tümör hücrelerini öldürmeleri yanında sağlılı hücreler de zarar verdiği bilinmektedir.
Ancak çalışmamız elde ettiğimiz sonuçlar ile birlikte herhangibir yan etkiye neden
olmayan, yeni ve alternatif ilaçların temelini oluşturma amacı ile bir basamak
oluşturabilmektedir.
4) Üstün özelliğe sahip bitki ekstraktları klinikte uygulamaları için preparat haline
getirilebilir.
5) A. sp. nova ve C. depressa türlerinin preparat olarak kullanılması halinde yan
etkiye neden olmadan kolon ve serviks kanser hücrelerinin proliferasyonunu
önleyebileceklerini öngörmekteyiz.
6) Antikanser ajanı olarak kullanımı planlanan bitki ekstraktlarının (su ve metanol)
HT-29, HeLa ve Caco-2 kanser hücreleri üzerine süperoksit dismutaz aktivitesi ve
total antioksidan kapasitesi değerlendirilmiştir. Süperoksit dismutaz aktivite ile ön
107
plana çıkan bitki A. sp. nova’ nın su ekstraktı; total antioksidan kapasitesi ile ön
plana çıkan bitki ise yine A. sp. nova olup bitkinin metanol ekstraktıdır.
7) İyonize radyasyon, UV ışınları gibi fiziksel etkenler ve ksenobiyotikler,
alkilleyiciler gibi kimyasal ajanlar ve yanlış beslenme alışkanlıkları canlıda oksidatif
DNA hasarına yol açmaktadır. Bu hasar tamir edilemediğinde ise kansere ve
yaşlanmaya yol açmaktadır. Antikanser ajanı olarak kullanımı planlanan bitki
ekstraktlarının (su ve metanol), insan lenfosit hücreleri üzerinde genetik hasar
oluşturmadığı comet yöntemiyle belirlenmiştir. A. sp. nova ve C. depressa su
ekstraktları antigenotoksik aktiviteleri ile canlıda oksidatif dengeyi düzenleyebilecek
özelliğe sahiptirler.
6) Kimyasal bir ajan olan H2O2 ile oksidatif DNA hasarına uğratılmış insan lenfosit
hücrelerinde, bitki türlerine ait su ve metanol ekstraktların antigenotoksik aktivitesi
comet yöntemiyle ortaya konulmuştur.
7) Antikanserojenik etkisi belirlenen bitki ekstraktlarının bu etkisini hangi moleküler
mekanizmalar ile gösterdiğinin açığa çıkarılması amacı ile bitkilerin kanser hücreleri
üzerine apoptotik etkisine bakılmıştır. Çalışmamızda HT-29, HeLa ve Caco-2 kanser
hücrelerinde A. sp. nova su ekstraktının yüksek apoptotoik etkiye sahip olduğu
belirlenmiştir.
9) Bitki türleri flavonoidler bakımından taranmış ve taranan flavonoidler arasında
rutin, kuersetin ve kamferol bileşiklerinin yüksek oranda olduğu tespit edilmiştir.
Bitkiler arasında C. depressa su ekstraktı ön plana çıkmıştır. Bu bitki türü en yüksek
değerde rutin flavonoidini içermektedir. Bitki türleri arasında metanol ve su
ekstraktları ile antiproliferatif, total antioksidan kapasite ve süperoksit dismutaz
aktivite, antigenotoksik ve apoptotik etkinin değerlendirildiği antikanserojenik
özellikli yapılan bu çalışmaların sonucu genelde C. depressa türüne ait su
ekstraktının etkin özellik göstermesi içerdiği rutin flavonoidinden kaynaklı
olabileceği düşünülmektedir.
10) Bitki ekstraktları arasında verim bakımından karşılaştırma yapıldığında en
yüksek verimin A. sp. nova su ekstraktına ait olduğu belirlenmiştir. Bu sonuca paralel
olarak yapılan diğer çalışmalarda da bitkinin su ekstraktının yüksek etkiye sahip
olduğu görülmüştür. Bu sonuç su ve metanol çözücüler arasında doğal ve kimyasal
olmayan bir kaynak olması bakımında önemli bir sonuç sayılmaktadır.
108
11) Sonuçlara göre C. depressa ve A. sp. nova bitki türleri kanser hücrelerinin
proliferasyonunu önleyici etkiye sahip, süperoksit dismutaz aktivite, total antioksidan
kapasite, antigenotoksik ve apoptotik etki bakımından öne çıkmıştır.
12) Genel olarak bu çalışmada C. depressa yaygın ve A. sp. nova ve T. albipannosum
endemik bitki türlerinin kullanılacak olması ve bu bitki türlerinden özellikle
antikanser çalışmaların olmaması, yeni bir antikanser ajanı bulma açısından bu
araştırmayı önemli kılacağı düşünülmekte ve bu bitki ekstraktlarının antikanser
etkilerinin yanı sıra antikanser mekanizmasının ortaya konulması, daha etkin ve
hedefe yönelik koruyucu ve tedavi edici ilaç formülasyonlarının geliştirilmesini
sağlanmasına basamak olabilecektir.
Bu şekilde etki mekanizması tam olarak ortaya konmuş bir ajanın, ilaç olarak
kullanım oranı ve etkinliğini daha fazla artırmak mümkün olabilecektir. Diğer bir
taraftan çalışmamız ile elde edilen sonuçlar bu alanda bundan sonra yapılacak yeni
çalışmalara, projelere kaynak teşkil edecek ve konuyu daha ileri düzeye taşımada
önemli rol oynayacaktır. Diğer taraftan çalışmamızda seçtiğimiz bitkiler literatürde
ilk defa antiproliferatif, antigenotoksik, apoptotik ve antioksidan etkileri bakımından
bir arada değerlendirilmiştir. Bu sebep ile de Türkiye’de ve Dünya’daki ilk çalışma
olmuştur.
109
KAYNAKLAR
Ahmed, R. G., Incerpi, S., Ahmed, F., Gaber, A., “The Developmental and
Physiological Interactions between Free Radicals and Antioxidant Defense System:
Effect of Environmental Pollutants”, Journal of Natural Sciences Research, 3 (13):
2224-3186 (2013).
Akan, Z., Garip A., “Protective Role Of Quercetin: Antioxidants May Protect Cancer
Cells From Apoptosis and Enhance Cell Durability”, Webmed Central Research
articles, 1-11 (2011).
Akbulut, H., Akbulut, K. G., “Tıbbi onkoloji”, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi,
Antıp Yayınları, 23 (2005).
Akgün, H., Balkan, A., Bilgin, A. A., Çalış, Ü., Dalkara, S., Erdoğan, H., Erol, D. D.,
Ertan, M., Özkanlı, F., Palaska, E., Saraç, S., Şafak, C., “Antikanser ilaçlar”,
Farmasötik Kimya, (1): 1180-1219 (2000).
Akhan, S. E., “Ülkemizde Servikal Kanser Epidemiyolojisi ve HPV Serotipleri”,
Ankem Dergisi, 21 (Ek 2): 96-98 (2007).
Algier, L. A., Hanoglu, Z., Özden, G., Kara, F., ‘‘The use of complementary and
alternative (non-conventional) medicine in cancer patients in Turkey’’, European
Journal of Oncology Nursing, 9 (2): 138-46 (2005).
Al-Gubory, K. H., Garrel, C., Delatouche, L., Heyman, Y., Palmer, P., ‘‘Antioxidant
adaptive responses of extraembryonic tissues from cloned and non-cloned bovine
conceptuses to oxidative stress during early pregnancy’’, Reproduction, 140: 175–
181 (2010).
Altunkaynak, B. Z., Özbek, E., ‘‘Programlanmış hücre ölümü: apoptoz nedir?’’ Tıp
Araştırmaları Dergisi, 6 (2): 93 -104 (2008).
Ameisen, J. C., “The origin of programmed cell death”, Science, 272 (5266): 12781279 (1996).
Arıca, S., Nazlıcan, E., Özer, C., Şilfeler, D., Arıca, V., Özgür, T., Özaydın, Ü.,
“Hatay ilinde 2008 yılı kanser vakaları sıklığı ve dağılımı’’, Klinik ve Deneysel
Araştırmalar Dergisi, 2 (2): 192-195 (2011).
Arabacı, T., “Türkiye’de yetişen Achillea L. (Asteraceae) cinsinin revizyonu’’,
Doktora Tezi, İnönü Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Malatya, 25-27 (2006).
Arvas, M., “Human papillomavirüs enfeksiyonu ve aşısı’’, Sürekli Tıp Eğitimi
Etkinlikleri, 59: 25-31 (2007).
110
Astley, S. B., “Dietary antioxidants-past, present and future?’’, Trends in Food
Science & Technology, 14 (3): 93–98 (2003).
Atagün, G., Eren, Z., Gürkanlı, İ., “Apoptoziste mitokondrinin rolü’’, Türk Bilimsel
Derlemeler Dergisi, 4 (2): 49-53 (2011).
Atik, A. D., Öztekin, M., Erkoç, F., “Biyoçeşitlilik ve Türkiye’deki endemik bitkilere
örnekler’’, Gazi Eğitim Fakültesi Dergisi, 30 (1): 219-240 (2010).
Atlı Şekeroğlu, Z., Şekeroğlu, V., “Genetik toksisite testleri”, Tübav Bilim Dergisi, 4
(3): 221-229 (2011).
Avcı, M., “Çeşitlilik ve endemizm açısından Türkiye’nin bitki örtüsü”, Coğrafya
Dergisi, 13: 27-55 (2005).
Ayad, R., Ababsa, Z. E. A., Belfadel, F. Z., Akkal, S., Leon, F., Brouard, I.,
Medjroubi, K., “Phytochemical and biological activity of Algerian Centaurea
melitensis”, International Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 2 (1): 151154 (2012)
Aydemir, M., “Değişik yörelerden toplanan Tanacetum parthenium L. türünde
parthenolide’ in kısmi en küçük kareler spektroskopik kalibrasyon (PLS) yöntemiyle
miktar tayini ve ince tabaka kromatografisi yöntemiyle karşılaştırılması”, Yüksek
Lisans Tezi, Yıldız Teknik Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, İstanbul, 2-4
(2005).
Balcı, O., Çapar, M., “Vajinal Enfeksiyonlar”, Türk Jinekoloji Ve Obstetrik Derneği
Dergisi, 2 (5): 14-20 (2005).
Barcelos, G. R. M., Shimabukuro, F., Maciel M. A. M., Colus I. M. S., “Genotoxicity
and antigenotoxicity of cashew (Anacardium occidentale L.) in V79 cells’’,
Toxicology in Vitro, 21, 1468 – 1475 (2007).
Bhat, M. S., Parimala, P., RamaLakshmi ,S., Muthuchelian, K., “In-Vitro cytotoxic
and genotoxicity studies of cry1Ac toxin isolated from bt cotton (RCH2 Bt) on
human lymphocytes”, Academic Journal of Plant Sciences, 4 (3): 64-68 (2011).
Benzie I. F. F., “Evolution of dietary antioxidants’’, Comparative Biochemistry and
Physiology Part A., 136: 113-126 (2003).
Bicha, S., Chalard, P., Hammoud, L., León, F., Brouard, I., Garcia, V. P., Lobstein,
A., Bentamene, A., Benayache, S., Bermejo, J., Benayache, F., “Maroccanin: A New
g-lactone and Other Constituents from Centaurea maroccana Ball. (Asteraceae)’’,
Records Of Natural Products, 7 (2): 114-118 (2013).
111
Bodeker, G., Kronenberg, F. A., “Public health agenda fortraditional,
complementary, and alternative medicine”, American Journal of Public Health, 92
(10): 1582-91 (2002).
Braca, A., Sortino, C., Politi, M., Morelli, I., Mendez, J., “Antioxidant activity of
flavonoids from Licania licaniaeflora”, Journal of Ethnopharmacology, 79 (3):
379-381 (2002).
Brannon-Peppas, L., “Novel vaginal drug release applications”, Advanced Drug
Delivery Reviews, 11 (1): 169-177 (1993).
Debeleç Bütüner, B., Kantarcı, G., “Mutasyon, DNA hasarı, onarım mekanizmaları
ve kanserle ilişkisi’’, Ankara Eczacılık Fakültesi Dergisi, 35 (2): 149-170 (2006).
Chahar, M. K., Sharma, N., Dobhal, M. P., Joshi, Y. C., “Flavonoids: A versatile
source of anticancer drugs’’, Pharmacognosy Reviews, 5 (9): 1-12 (2011).
Cheeseman, K. H., Slater, T. F., “An introduction to free radical biochemistry’’
British Medical Bulletin, 49 (3): 481-93 (1993).
Chen, A. M., Wei, D., Zhang, M., Stueber, D., Taratula, O., Minko, T., He H., “Codelivery of doxorubicin and Bcl-2 siRNA by mesoporous silica nanoparticles
enhances the efficacy of chemotherapy in multidrug-resistant cancer cells’’, Drug
Delivery, 5 (23): 673–2677 (2009).
Christmann, M., Kaina, B., “Transcriptional regulation of human DNA repair genes
following genotoxic stress: trigger mechanisms, inducible responses and genotoxic
adaptation’’, Nucleic Acids Research, 1-18 (2013).
Croce, C. M., “Oncogenes and cancer”, The New England Journal Of Medicine,
358 (5): 502-511 (2008).
Coşkun T., “Fonksiyonel besinlerin sağlığımız üzerine etkileri”, Çocuk Sağlığı ve
Hastalıkları Dergisi, 48: 69-84 (2005).
Çavdar, C., Sifil, A., Çamsarı, T., “Reaktif oksijen partikülleri ve antioksidan
savunma”, Türk Nefroloji Diyaliz ve Transplantasyon Dergisi, 3-4: 92-95 (1997).
Çetin, E. S., “Asmada hücre süspansiyon kültürleri ile sekonder metabolit üretimi
üzerine araştırmalar”, Doktora Tezi, Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstitüsü, Isparta, 3-19 (2010).
Çapanoğlu Güven, E., Otkun, G. T., Boyacıoğlu, D., “Flavonoidlerin
biyoyararlılığını etkileyen faktörler”, Gıda, 35 (5): 387-394 (2010).
Çolakoğulları M., “Bcl-2
incelenmesi”, 16 (2007).
proteininin
apoptoz
yolakları
üzerine
etkisinin
112
Dai, J., Mumper, R. J., “Plant phenolics: extraction, analysis and their antioxidant
and anticancer properties”, Molecules, 15 (10): 7313-7352 (2010).
Dalle-Donne, I., Rossi, R., Giustarini, D., Milzani, A., Colombo, R., “Protein
carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress”, Clin. Chim. Acta., 329: 23-38
(2003).
Dinçer, Y, Akçay, T., “DNA hasarı’’, Türk Biyokimya Dergisi, 25 (2): 73-79 (2000).
Dinçer, Y., Kankaya, S., “DNA hasarının belirlenmesinde Comet Assay’’, Türkiye
Klinikleri Tıp Bilimleri Dergisi, 30 (4): 1365-1373 (2010).
Dönmez, M., Cankurtaran, M., Diken, F., Günendi, P., ‘‘Gıda beslenmesi ve kanser
ilişkisi’, Ulusal Meslek Yüksekokulları Öğrenci Sempozyumu, Düzce (2010).
Doll, R., Peto, R., ‘‘The causes of cancer: quantitative estimates of avoidable risks of
cancer in the United States today’’, Journal Of The National Cancer Institute, 66 (
6): 1191-1308 (1981).
Duenas Gonzalez, A. D., Lizano, M., Landelaria, M., Letina, L., Arce, C., Cervera,
E., “Epigenetics of cervical cancer: an overview and therapeutic perspectives”,
Biomed Central, 4 (38): (2005).
Ekmekçi, A., Konaç, E., Önen, H. İ., ‘‘Gen polimorfizmi ve kansere yatkınlık’’,
Marmara Medical Journal, 21 (3): 282-295 (2008).
Eren, H., “Serviksin prekanseröz lezyonlarındaki human papilloma virus prevalansı”,
Uzmanlık Tezi, S.B. Göztepe Eğitim ve Araştırma Hastanesi İnfeksiyo Hastalıkları
ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği, İstanbul, (2007).
Erol-Dayi, Ö., Pekmez, M., Bona, M., Aras-Perk, A., Arda, N., “Total phenolic
contents, antioxidant activities and cytotoxicity of three Centaurea species: C.
calcitrapa subsp. calcitrapa, C. ptosimopappa and C. spicata”, Free Radicals And
Antioxidant, 1 (2): 31-36 (2011).
Eröz, R., Karataş, A., Alkoç, O. A., Baltacı, D., Oktay, M., Çolakoğlu, S.,
“Apoptozis Hakkında Bilinenler”, Düzce Tıp Dergisi, 14 (2): 87-101 (2012).
Ernst, E., Cassileth, B., “The prevalence of complementary/alternative medicine in
cancer: A systematic review”, Cancer, 83 (4): 777-782 (1998).
Ferreira, J. F, Luthria, D. L, Sasaki, T., Heyerick, A., “Flavonoids from Artemisia
annua L. as antioxidnts and their potential synergism with artemisinin against
malaria and cancer”, Molecules, 15 (5): 3135-70 (2010).
Fışkın, K., “Genetik kavramlar’’, Saufalar, 635-651 (2002).
113
Fresco, P., Borges, F., Diniz, C., Marques, M. P., “New insights on the anticancer
properties of dietary polyphenols”, Medicinal Research Review, 26 (6): 747-766
(2006).
Gerber, M., Boutron-Ruault, M. C., Hercberg, S., Riboli, E., Scalbert, A., Siess, M.
H., “Food and cancer: State of the art about the protective effect of fruits and
vegetables”, Bulletin Du Cancer, 89 (3): 293-312 (2002).
Ghode, S. P., Rajkapoor, B., Subbraju, T., “Antitumor Activity of Methanolic Extract
of Pisonia Aculeata Leaf”, International Journal of Phytomedicine, 3 (2): 172-181
(2011).
Gibellini, L., Pinti, M., Nasi, M., Montagna, P. J., Biasi, S. D., Roat, E., Bertoncelli,
L., Cooper, E. L., Cossarizza, A., “Quercetin and cancer chemoprevention”,
Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine (2011).
Gilman, A., Goodman, L. S., “Chemotherapy of Neoplastic Diseases”, The
Pharmacological Basis of Therapeutics, (8): 1240-1306 (1991).
Golstein, P., Kroemer, G., “Cell death by necrosis: towards a molecular definition”,
Trends in Biochemical Science, 32 (1): 37-43 (2007).
Gopal, P. K., Prasad, J., Smart, J., Gill, S. H., “In vitro adherence properties of
Lactobacillus rhamnosus DR20 and Bifidobacterium lactis DR10 starins and their
antagonistic activity against an enterotoxigenic Escherichia coli”, International
Journal of Food Microbiology, 67 (3): 207-216 (2001).
Gonçalves, S., Xavier, C., Costa, P., Alberício, F., Romano, A., “Antioxidant,
cytotoxic and apoptotic activity of Drosophyllum lusitanicum extracts”, Journal of
Medicinal Plants Research, 4 (15): 1601-1608 (2010).
Gökçe, Ö., Yılmaz, A., Gürbüz, V., Konaç, E., Ekmekçi, A., “İnsan servikal kanser
hela hücrelerinde vinorelbin’in apoptotik etkisi’’, DEÜ Tıp Fakültesi Dergisi, 25
(1): 05-14 (2011).
Grierson, A. J. C., “Tanacetum L. İn flora of Turkey and The East Aegian Islands’’
Edinburgh University Press, Edinburgh, V: 5 580 (1975).
Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B., “Antioxidants in nutrition, health and disease’’,
Oxford University Press. New York, 39 (5) (1994).
Gültekin, N., Karaoğlu, K., Küçükateş, E., “Hücrede apoptoz ve sağkalım
mekanizmalarının keşfedilmesi ve yeni potansiyel tedavi stratejileri’’, Türk
Kardiyoloji Derneği Arşivi, 36 (2): 120-130 (2008).
114
Gümüştaş, M. K., Atukeren, P., “Oksidatif ve nitrozatif stresin psikiyatrik
bozukluklarla ilişkisi’’, İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Sürekli Tıp
Eğitimi Etkinlikleri, Türkiye’de sık karşılaşılan psikiyatrik hastalıklar, Sempozyum
Dizisi, 62: 329-340 (2008).
Güner, H., Taşkıran, Ç., “Serviks kanseri epidemiyolojisi ve human papilloma
virüsü”, Türk Jinekoloji Ve Obstetrik Derneği, 4 (1): 11-19 (2007).
Hadjiakhoondi, F., Ostad, S. N., Khanavi, M., Hadjiakhoondi, A., Farahanikia, B.,
Salarytabar, A., “Cytotoxicity of Two Species of Glaucium from Iran”, Journal of
Medicinal Plants, 12 (45): 85-92 (2013).
Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C., “Free Radicals in Biology and Medicine”, 3rd ed,
Oxford University Press. Inc, London (1999).
Halliwell, B., “Free radicals and antioxidants: updating a personal view’’, Nutrition
Reviews, 70 (5): 257-265 (2012).
Hanahan, D., Weinberg, R. A., “The hallmarks of cancer”, Cell., 100 (1): 57-70
(2000).
Harlev, E., Nevo, E., Lansky, E. P., Lansky, S., Bishayee, A., “Anticancer attributes
of desert plants: a review”, Anticancer Drugs, 23 (3): 255-271 (2012).
Hassen, S., Ali, N., Chowdhury, P., “Molecular signaling mechanisms of apoptosis
in hereditary non-polyposis colorectal cancer”, World Journal Gastrointestinal
Pathophysiology, 3 (3): 7-79 (2012).
Haydaroğlu, A., “Ege Üniversitesi'nde kanser kayıt analizleri: 34134 Olgunun
değerlendirmesi”, Türk Onkoloji Dergisi, 22 (1): 22-28 (2007).
Herceg, Z., Hainaut, P., “Genetic and epigenetic alterations as biomarkers for cancer
detection, diagnosis and prognosis”, Molecular Oncology, 1 (1): 26-41 (2007).
Hirano, T., Gotoh, M., Oka, K., “Natural flavonoids and lignans are potent cytostatic
agents against human leukemic HL-60 cells”, Life Science, 55 (13): 1061–1069
(1994).
Hirano, R., Tokorozawa, S., Sasamoto, W., Matsumoto, A., Itakura, H., Igarashi, O.,
“Antioxidant ability of various flavonoids against DPPH radicals and LDL
oxidation”, Journal Nutritional Science And Vitaminology, 47 (5): 57–362 (2001).
Huang, W. Y., Cai, Y. Z., Zhnag, Y., “Natural phenolic compounds from medicinal
herbs and dietary plants: potential use for cancer prevention”, Nutrition and Cancer,
62 (1): 1-20 (2009).
115
Husain, N., Kumar, A., “Reactive oxygen species and natural antioxidants: a
review’’, Advances in Bioresearch, 3 (4): 164-175 (2012).
İnternet: “Servikste kanser gelişimi ve tümör dokusu oluşumu’’
http://www.womeningovernment.org (2013).
İnternet: “Kolonda tümör dokusunun oluşumu’’
http://www.healthcentral.com (2013).
İnternet: “Genetik değişikliklerin birikmesi sonucu kanser oluşumu’’
http://medschool.creighton.edu (2013).
İnternet: “Serbest radikallerin hücresel hasarı’’
http://www.spice-of-life.com (2013).
İnternet: “Karsinojenlerin metabolizmada oluşturduğu hasar ve kanser oluşumu’’
http://www.nature.com (2013).
İnternet: “Kolonun bölümleri’’
http://healthycolontips.com (2013).
İnternet: “HT-29 ve Caco-2 hücrelerinin mikroskobik görüntüsü’’
http://www.lgcstandards-atcc.org (2013).
İnternet: “Kadın ürogenital sistem’’
http://www.tupbebek-istanbul.com (2013).
İnternet: “HeLa kanser hücre hattınının mikroskobik görüntüsü’’
http://www.lgcstandards-atcc.org (2013).
İnternet: “Apoptoza maruz kalan bir hücrede hücre ölümünün aşamaları’’
http://ajprenal.physiology.org (2013).
İnternet: “Centaurea depressa’’
http://turkherb.ibu.edu.tr (2013).
İnternet: “Tanacetum albipannosum’’
http://turkherb.ibu.edu.tr (2013).
İnternet: “Achillea sp. nova’’
http://turkherb.ibu.edu.tr (2013).
Ignat, I., Volf, I., Popa, V. I., “A critical review of methods for characterisation of
polyphenolic compounds in fruits and vegetables’’, Food Chemistry, 126 (4): 18211835 (2011).
116
Jackie, T., Haleagrahara, N., Chakravarthi, S., “Antioxidant effects of Etlingera
elatior flower extract against lead acetate – induced perturbations in free radical
scavenging enzymes and lipid peroxidation in rat’’, Bio Med Central Research
Notes, 4 (67): (2011).
Jackisch, C., Hahm, H. A., Tombal, B., McCloskey, D., Butash, K., Davidson, N. E.,
Denmeade, S. R., “Delayed micromolar elevation in intracellular calcium precedes
induction of apoptosis in thapsigargin-treated breast cancer cells’’, Clinical Cancer
Research, 6 (7): 2844–2850 (2000).
Jain, D., Pathak, N., Khan, S., Raghuram, G. V., Bhargava, A., Samarth, R., Mishra,
P. K., “Evaluation of cytotoxicity and anticarcinogenic potential of Mentha leaf
extracts’’, International Journal of Toxicology, 30 (2): 225-36 (2011).
Kanbur, A., Çapık, C., “Servikal kanserden korunma, erken tanı-tarama yöntemleri
ve Ebe/Hemşirenin rolü”, Sağlık Bilimleri Fakütesi Hemşirelik Dergisi, 61-72
(2011).
Kandaş, Ö. N., “Apoptosis, programlanmış hücre ölümü”, Ankara
ÜniversitesiDikimevi Sağlık Hizmetleri Meslek Yüksekokulu Dergisi. 5 (1): (2004).
Kaur, P., Walia, A., Kumar, S., Kaur, S., “Antigenotoxic Activity of Polyphenolic
Rich Extracts from Aegle marmelos (L.) Correa in Human Blood Lymphocytes and
E.coli PQ 37”, Records Of Natural Products, 3 (1): 68-75 (2009).
Kav, S., Hanoğlu, Z., Algier, L., ‘‘Türkiyede kanserli hastalarda tamamlayıcı ve
alternatif tedavi yöntemlerinin kullanımı: literatür taraması’’, Uluslararası
Hematoloji-Onkoloji Dergisi, 18 (1): 32-8 (2008).
Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R., ‘‘Apoptosis: a basic biological phenomenon
with wide-ranging implications in tissue kinetics’’, British Journal of Cancer, 26
(4): 239-57 (1972).
Kılıç, E., “Tanacetum zahlbruckneri (Nãb.) Grierson bitkisi üzerinde fitokimyasal
araştırmalar”, Yüksek Lisans Tezi, Yıldız Teknik Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstitüsü, İstanbul, 4-10 (2007).
Kierklo, A., Pawinska, M., Tokajuk, G., Poplawska, B., Bielawska, A., “Cytotoxicity
evaluation of three light-cured dentin adhesive materials on human gingival
fibroblasts, ex vivo”, Advances in Medical Sciences, 57 (2): 385-390 (2012).
Kim, E. J., Lee, Y. J., Shin, H. K., Park, J. H. Y., “Induction of apoptosis by the
aqueous extract of Rubus coreanum in HT-29 human colon cancer cells”, Nutrition,
21 (11-12): 1141–1148 (2005).
Kinzler, K. W., Vogelstein, B., ‘‘Lessons from hereditary colorectal cancer’’, Cell,
87: 159–170 (1996).
117
Kopani, M., Celec, P., Danisovic, L., Michalka, P., Biro, C., ‘‘Oxidative stress and
electron spin resonance’’, Clinica Chimica Acta, 364 (1-2): 61-66 (2006).
Kopnin, B. P., “Targets of oncogenes and tumor suppressors: Key for understanding
basic mechanisms of carcinogenesis”, Biochemistry, 65 (1): 2-27 (2000).
Kramer, P. J., “Genetic Toxicology”, The Journal Of Pharmacy Pharmacology,
50 (4): 395-405 (1998)
Kirsch Volders, M., Vanhauwaert, A., Eichenlaub Ritter, U., Decordier, I., “Indirect
mechanisms of genotoxicity”, Toxicology Letters, 140-141: 63-74 (2003).
Kulbacka, J., Saczko, J., Chwilkowska, A., “Oxidative stress in cells damage
processes”, Polski Merkuriusz Lekarski, 27 (157): 44-7 (2009).
Kumar, K. V. S., Kuppast, I. J., “Evaluation of Antioxidant property and HPLC
Analysis of Quercetin in various extracts of Zizyphus Oenoplia fruits”, International
Journal of Pharma World Research, 3 (1): 1-15 (2012).
Kuntz, S., Wenzel, U., Daniel, H., “Comparative analysis of the effects of flavonoids
on proliferation, cytotoxicity, and apoptosis in human colon cancer cell lines”,
European Journal of Nutrition, 38 (3): 133–142 (1999).
Kürşat, M., Civelek, Ş., “Türkiye’de doğal olarak yetişen Artemisia L.(Asteraceae)
cinsine ait üç türün morfolojik özellikleri bakımından incelenmesi”, Artvin Çoruh
Üniversitesi Orman Fakültesi Dergisi, 12 (19): 15-25 (2011).
Kwon, H. J., Hong, Y. K, Kim, K. H., Han, C. H, Cho, S. H., Choi, J. S. , Kim B. W.,
“Methanolic extract of Pterocarpus santalinus induces apoptosis in HeLa cells”,
Journal of Ethnopharmacology, 105 (1-2): 229-334 (2006).
Lahtz, C., Pfeifer, G. P., “Epigenetic changes of DNA repair genes in cancer”,
Journal of Molecular Cell Biology, 3 (1): 51–58 (2011).
Leach, A. P., “Apoptosis molecular mechanism for physiological cell death in health
and disease”, Clinical Laboratory Science, 11 (6): 346-349 (1998).
Magesh, V., Yuvaraj, G. Deecaraman, M., Kalaichelvan, P. T., “Methanolic extract
of Indigofera tinctoria induces apoptosis in HCT116 cells”, Journal of Applied
Biosciences, 14: 768 – 774 (2009).
Mateuca, R., Lombaert, N., Aka, P. V., Decordier, I., Kirsch-Volder, M.,
“Chromosomalchanges: induction, detection, methods, andapplicability in human
biomonitoring”, Biochimie, 88: 1515-1531 (2006).
118
Memişlioğulları, R., “Diyabette serbest radikallerin rolü ve antioksidanların etkisi”,
Düzce Tıp Fakültesi Dergisi, 3: 30-39 (2005).
Meral, R., Doğan, İ. S., Kanberoğlu, G. S., “Fonksiyonel gıda bileşeni olarak
antioksidanlar”, Iğdır Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 2 (2): 45-50
(2012).
Mccord, J. M., “Human disease, free radicals and the oxidant/antioxidant balance”,
Clin Biochem, 26: 351–7 (1993).
Mcphie, D. L., Coopersmith, R., Peralta, A. H., Chen, Y., Ivins, K. J., Manly, S. P.,
Kozlowski, M. R., Neve, K. A., Neve, R. L., “DNA synthesis and neuronal apoptosis
caused by familial alzheimer disease mutants of the amyloid precursor protein are
mediated by the p21 activated kinase PAK3”, The Journal of Neuroscience, 23
(17): 6914–6927 (2003).
Michalak, A., “Phenolic compounds and their antioxidant activity in plants growing
under heavy metal stress”, Polish Journal Of Environmental Studies, 15 (4): 523530 (2006).
Montezano, A. C., Touyz, R. M., “Reactive Oxygen Species and Endothelial
Function – Role of Nitric Oxide Synthase Uncoupling and Nox Family Nicotinamide
Adenine Dinucleotide Phosphate Oxidases”, Basic & Clinical Pharmacology &
Toxicology, 110: 87–94 (2011).
Moon, Y. J., Wang, X., Morris, M. E., “Dietary flavonoids: Effects on xenobiotic
and carcinogen metabolism”, Toxicology İn Vitro 20(2): 187–210 (2006).
Moore, K. L., Agur, A. M. R., Dalley, A. F., “Dalley Pelvis ve Perineum, kliniğe
yönelik anatomi”, Nobel Kitabevi 4.Baskı, İstanbul, 385-8 (2007).
Mosaffa, F., Behravan, J., Karimi, G., Iranshahi, M., ‘‘Antigenotoxic effects of
Satureja hortensis L. on rat lymphocytes exposed to oxidative stress’’, Archives of
Pharmacal Research, 29 (2): 159-164 (2006).
Motavalizadehkakhky, A., Shafaghat, A., Zamani, H. A., Akhlaghi, H.,
Mohammadhosseini, M., Mehrzad, J., Ebrahimi, Z., ‘‘Compositions and the in vitro
antimicrobial activities of the essential oils and extracts of two Achillea species from
Iran’’, Journal of Medicinal Plants Research, 7 (19): 1280-1292 (2013).
Nair, S., Varalakshmi, K. N.,‘‘Anticancer, cytotoxic potential of Moringa oleifera
extracts on HeLa cell line’’, Journal of Natural Pharmaceuticals, 2 (3): 138-142
(2011).
Nehru, M. R., Singh, P. O., “Nanotechnology and Cancer Treatment” , Asian J. Exp.
Sci., 22 (2):45–50 (2008).
119
Nicotera, P., Bernassola, F., Melino, G., “Regulation of the apoptosis-necrosis
switch”, Oncogene, 23: 2757-2765 (2004).
Niki, E., “Role of vitamin E as a lipid-soluble peroxyl radical scavenger: in vitro and
in vivo evidence”, Free Radical Biology & Medicine, 8 (66) 3-12 (2013).
Nizamlıoğlu, N., Nas, S., “Meyve ve sebzelerde bulunan fenolik bileşikler”, Gıda
Teknoloji Elektron Dergisi, 5 (1): 20-35 (2010).
Noroozi, S., Mosaffa, F., Soltani, F., Iranshahi, M., Karimi, G., Malekaneh, M.,
Haghighi, F., Behravan, J., ‘‘Antigenotoxic effects of the disulfide compound
persicasulfide A (PSA) on rat lymphocytes exposed to oxidative stress’’, Planta
Medica, 75 (1): 32-6 (2008).
Oskay, M., Oskay, D., ‘‘Bitki sekonder metabolitlerinin biyoteknolojik önemi’’, EJournal of New World Sciences Academy Ecological Life Sciences, 4 (2): 31-41
(2009).
Ouyang, L., Shi, Z., Zhao, S., Wang, F. T., Zhou, T. T., Liu, B., Bao, J. K.,
‘‘Programmed cell death pathways in cancer: a review of apoptosis, autophagy and
programmed necrosis’’, Cell Proliferation, 45 (6): 487-98 (2012).
Oylar, Ö., Tekin, İ., ‘‘Kanserin teşhis ve tedavisinde nanoteknolojinin önemi’’,
Uludağ Üniversitesi Mühendislik-Mimarlık Fakültesi Dergisi, 16 (1): 147-154
(2011).
Öğüt, S., Atay, E., ‘‘Yaşlılık ve oksidatif stres’’, S.D.Ü Tıp Fakültesi Dergisi, 19
(2): 68-74 (2012).
Özbek, E., Özbek A., ‘‘Microscopic pathology of the liver in rats fed a Fusarium
graminearuminoculated diet’’, The Journal Of International Medical Research, 31
(5): 392-401 (2003).
Özcan, M., ‘‘Türkiye’ de Yetişen Psephellus pulcherrimus (syn: Centaurea
pulcherrima var. freynii) (Cardueae, Asteraceae)’ un Morfolojik ve Anatomik
Özellikleri’’, Artvin Çoruh Üniversitesi Orman Fakültesi Dergisi, 14 (1): 104-112
(2013).
Özçelik, H., Fadıloğlu, Ç., ‘‘Kanser hastalarının tamamlayıcı ve alternatif tedavi
kullanım nedenleri’’, Türk Onkoloji Dergisi, 24 (1):48-52 (2009).
Özden, T. A., Ömer, B., Saner, G., Saner, H., ‘‘Meme Kanserinde MDA, ZN ve
GSH Düzeyleri’’, Türk Klinik Biyokimya Dergisi, 2 (2): 59-64 (2004).
Özelçi Kavas, G., ‘‘Reaktif oksijen türevleine fizyopatolojik yaklaşım’’, Ankara Tıp
Dergisi, 47: 579-592 (1994).
120
Özmen, E., Kızılpınar, İ., Özüdoğru, B., Doğan, C., Erik, S., ‘‘Pollen morphology of
some taxa of aromatic genus tanacetum L. (Asteraceae)’’, FABAD Journal
Pharmacology Science, 34: 1–11 (2009).
Pal, D., Nayak, K. A., “Nanotechnology for targeted delivery in cancer therapeutics”,
International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 1 (1): 1-7
(2010 ).
Pandey, M., Saraswati, S., Agrawal, S. S., ‘‘Antiproliferative effects of Datura
innoxia extract in cervical HeLa cell line’’, Journal of Pharmacy Research 4 (4):
1124-1126 (2011).
Parrek, A., Suthar, M., Rathore, G. S., Bansal, V., ‘‘Feverfew (Tanacetum
parthenium L.): A systematic review’’, Pharmacognosy Review, 5 (9): 103-110
(2011).
Parkin, D. M., Bray F., Ferlay, J., Pisani, P., ‘‘Global cancer statistics, 2002’’, A
Cancer Journal for Clinicians, 55 (2): 74-108 (2005).
Pazarbaşı, A., Kasap, M., ‘‘Kanser genetiği’’, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dalı, Adana, 12-38 (2003).
Peres, V. F., Moura, D. J., Sperotto, A. R. M., Damasceno, F. C., Caramao, E. B.,
Zini, C. A., Saffi, J., ‘‘Chemical composition and cytotoxic, mutagenic and
genotoxic activities of the essential oil from Piper gaudichaudianum Kunth leaves’’,
Food and Chemical Toxicology, 47, 2389–2395 (2009).
Phillips, D. H., Arlt, V. M., ‘‘Genotoxicity: damage to DNA and its consequences’’,
Molecular, Clinical and Environmental Toxicology, 99 87-110 (2009).
Rahbari, R., Sheahan, T., Modes, V., Collier, P., Macfarlane, C., Badge, R. M., ‘‘A
novel L1 retrotransposon marker for HeLa cell line identification’’, Biotechniques,
46 (4): 277–284 (2009).
Ren, W., Qiao, Z., Wang, H., Zhu, L., Zhang, L., ‘‘Flavonoids: promising anticancer
agents’’, Medicinal Research Reviews, 23 (4): 519-534 (2003).
Saday, S., ‘‘Jurinea cass. (Compositae) üzerinde morfolojik, palinolojik ve anatomik
araştırmalar’’, Yüksek Lisans Tezi, Marmara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsi,
İstanbul, 2-7 (2005).
Saelens, X., Festjens, N., Walle, V. L, Gurp, M., Loo, G., Vandenabeele, P., ‘‘Toxic
proteins released from mitochondria in cell death’’, Oncogene, 23: 2861–74 (2004).
Saikumar, P., Dong, Z., Mikhailov, V., Denton, M., Weinberg, J. M.,
Venkatachalam, M. A., ‘‘Apoptosis definition, mechanism and relevance to
disease’’, The American Journal of Medicine, 107 (5): 489-506 (1999).
121
Salucci, M., Stivala, L. A., Maiani, G., Vannini, V., ‘‘Flavonoids uptake and their
effect on cell cycle of human colon adenocarcinoma cells’’, British Journal of
Cancer, 86 (10): 1645-1651 (2002).
Sandhar, H. K., Kumar, B., Prasher, S., Tiwari, P., Salhan, M., Sharma, P., ‘‘A
review of phytochemistry and pharmacology of flavonoids’’, Internationale
Pharmaceutica Sciencia, 1 (1): 25-41 (2011).
Saeidnia, S., Gohari, A. R., Mokhber-Dezfuli, N., Kiuchi, F., ‘‘A review on
phytochemistry and medicinal properties of the genus Achillea’’, Daru, 19 (3): 173–
186 (2011).
Sharififar, F., Dehghn-Nudeh, G., Mirtajaldini, M., ‘‘Major flavonoids with
antioxidant activity from Teucrium polium L.’’, Food Chemistry, 112 (4): 885-888
(2009).
Sharma, P., Jha, A. B., Dubey, R. S., Pessarakli, M., ‘‘Reactive Oxygen Species,
Oxidative Damage, and Antioxidative Defense Mechanism in Plants under Stressful
Conditions’’, Journal of Botany, 1-26 (2012).
Shivananjappa, M. M., Joshi, K. M., “Influence of aqueous extract of Arjuna
(Terminalia arjuna) on growth and antioxidant defense system of human hepatoma
cell line (HepG2)”, Journal of Medicinal Plants Research, Vol. 5(9): 1711-1721
(2011).
Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L., “A simple technique for
quantitation of low levels of DNA damage in individual cells”, Experimental Cell
Research, 175 (1): 184 -191 (1988).
Sillanpaa, J., ‘‘Tissue–adherence in lactic acid bacteria identification and
characterization of the collagen-binding S-layer protein of Lactobacillus crispatus’’,
Academic Disseration in General Micbiology, 1-57 (2001).
Soltani, F., Mosaffa, F., Iranshahi, M., Karimi, G., Malekaneh, M., Haghighi, F.,
Behravan, J., ‘‘Evaluation of antigenotoxicity effects of umbelliprenin on human
peripheral lymphocytes exposed to oxidative stres’’, Cell Biol Toxicol, 25:291–296
(2009).
Somer, A., ‘‘Human Papillomavirus Aşıları’’, ANKEM Dergisi, 23 (Ek 2): 96-101
(2009).
Souza, W. F., Fortunato Miranda, N., Robbs, B. K., Araujo, W. M., Freitas Junior, J.
C., Bastos, L. G., Viola, J. P. B., Morgado-Diaz, J. A., “Claudin-3 Overexpression
Increases the Malignant Potential of Colorectal Cancer Cells: Roles of ERK1/2 and
PI3K-Akt as Modulators of EGFR signaling’’, Plos One, 8 (9): (2013).
122
Spanou, C., Stagos, D., Aligiannis, N., Kouretas, D., “Influence of potent antioxidant
leguminosae family plant extracts on growth and antioxidant defense system of Hep2
cancer cell line’’, Journal Of Medicinal Food, 13(1): 149-55 (2010).
Srisvastava, J. K., Gupta, S., “Antiproliferative and apoptotic effects of chamomile
extract in various human cancer cells’’, Journal Of Agricultural And Food
Chemistry, 55 (23): 9470–9478 (2007).
Stevovic, S., Mikovilovic, V. S., Calic-Dragosavac, D., “Environmental adaptibility
of tansy (Tanacetum vulgare L.)’’, African Journal of Biotechnolog, 8 (22): 62906294 (2009).
Suematsu, N., Hosoda, M., Fujimori, Ko., “Protective effects of quercetin against
hydrogen peroxide-induced apoptosis in human neuronal SH-SY5Y cells’’,
Neuroscience Letters, 504 (3): 223-227 (2011).
Süslü, İ., Pehlivan, S., Ekni, M., Şenel, E., “Türkiye’nin Çeşitli Ballarına Kaynak
Oluşturan Composıtae (Asteraceae) Familyasında Inula Türlerinin Polen
Morfolojilerine İstatistiksel Bir Yaklaşım’’, Tübav Bilim Dergisi, 3 (2): 182-187
(2010).
Taneja, N., Tjalkens, R., Philbert, M. A., Rehemtulla, A., “Irradiation of
mitochondria initiates apoptosis in a cell free system’’, Oncogene, 20 (2): 167-77
(2001).
Tardieu, D, Jaeg, J. P., Deloly, A., “The COX-2 inhibitor nimesulide suppresses
superoxide and 8-hydroxy-deoxyguanosine formation and stimulates apoptosis in
mucosa during early colonic inflammation in rats’’. Carcinogenesis, 21 (5): 973-976
(2000).
Tekin, A., Kaya, E., Yazıcı, S., “Kanserle ilgili alternatif tıp içerikli web sitelerinin
içerik analizi’’, Mehmet Akif Ersoy Üniversitesi Sosyal Bilimler Enstitüsü Dergisi,
4 (6):14-34 (2012).
Thompson, C. B., “Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease”, Science,
267 (5203): 1456-1462 (1995).
Tripoli, E., Guardia, ML., Giammanco, S., Majo, D.D., Giammanco, M., “Citrus
flavonoids: Molecular structure, biological activity and nutritional properties”, Food
Chemistry, 104 (2): 466-479 (2007).
Trottier, H., Franco, E. L., “The epidemiology of genital human papillomavirus
infection”, Vaccine, 24 :4-15. (2006).
Tsujimoto, Y., “Role of Bcl-2 family of proteins in apoptosis, apoptosomes or
mitochondria?”, Genes Cell. 3 (11): 697-707 (1998).
123
Türk, M., Kaya, B., Menemen, Y., Oğuztüzün, S., “Apoptotic and necrotic effects of
plant extracts belonging to the genus Alchemilla L. species on HeLa cells in vitro.”,
Journal of Medicinal Plants Research 5 (18): 4566-4571 (2011).
Üzümlüoğlu Coşkun, M., “Şizofreni Etyopatogenezinde Oksidatif Stresin Rolü”,
Uzmanlık Tezi, Bakırköy Prof. Dr. Mazhar Osman Ruh Sağlığı ve Sinir
Hastalıkları Eğitim ve Araştırma Hastanesi, İstanbul (2008).
Valenta, C., “The use of mucoadhesive polymers in vaginal delivery”, Advanced
Drug Delivery Reviews, 3 (57): 1692-1712 (2005).
Vallor, A. C., Antonio, M. A. D., Hawes, S. E., Hillier, S. L., “Factors associated
with acquisition of, or persistent colonization by, vaginal lactobacilli: Role of
hydrogen peroxide production”, The Journal Infectius Diseases, 184 (11): 14311436 (2001).
Vauzour, D., Rodriguez-Mateos, A., Corona, G., Oruna-Concha, M. J., Spencer, J. P.
E., “Polyphenols and human health: prevention of disease and mechanisms of
action’’, Nutrients, 2 (11): 1106-1131 (2010).
Vermani, K., Garg, S., “The scope and potential of vaginal drug delivery”,
Pharmaceutical Science And Technology Today, 3 (10): 359-364 (2000).
Vincent Hubert, F., Arini, A., Gourlay France, C., “Early genotoxic effects in gill
cells and haemocytes of Dreissena polymorpha exposed to cadmium, B[a]P and a
combination of B[a]P and Cd”, Mutation Research, 723: 26–35 (2011).
Vural, N., “Toksikoloji’’, Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Yayınları, No:
73, Ankara, (2005).
Yeatman, T. J., “Colon Cancer’’, Encyclopedia Of Life Sciences, (2001).
Wagenitz, G., “Centaurea L. in flora of Turkey and The East Aegian Islands’’
Edinburgh University Press, Edinburgh, V: 5 271 (1975).
Wang, H., Cao, G., Prior R. L., “Oxygen radical absorbing capacity of
anthocyanins’’, Journal Agriculture Food Chemistry, 45 (2): 304–309 (1997).
Wang, S.Y., Stretch, A.W., “Antioxidant capacity in cranberry is influenced by
cultivar and storage temperature’’, Journal of Agricultural and Food Chemistry,
49: 969-974 (2001).
Weisburg, J. H., Weissman, D. B., Sedaghat, T., Babich, H., “In vitro Cytotoxicity of
Epigallocatechin Gallate and Tea Extracts to Cancerous and Normal Cells from the
Human Oral Cavity’’, Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 95: 191–200
(2004).
124
Willcox, J. K., Ash, S. L., Catignani, G. L., “Antioxidants and prevention of chronic
disease’’. Critical Reviews in Food Science And Nutrition, 44 (4): 275–295 (2004).
Wu, C., Chen, F., Rushing, J. W., Wang, H., Kim, H. J., Huang, G., Haley-Zitlin V.,
He, G., ‘‘Antiproliferative activities of parthenolide and golden feverfew extract
against three human cancer cell lines’’, Journal of Medicinal Food, 9(1): 55-61
(2006).
Zysk, G., Bejo, L., Schneider – Wald, B. K., Nau, R., Heinz H. P., “Induction of
necrosis and apoptosis of neutrophil granulocytes by Streptococcus pneumoniae’’.
Clinical and Experimental Immunology, 122 (1): 61-66 (2000).
125
EKLER
126
EK-1. Gazi Üniversitesi (girişimsel olmayan) klinik araştırmalar etik kurulu
değerlendirme formu
127
EK-1. (Devam) Gazi Üniversitesi (girişimsel olmayan) klinik araştırmalar etik kurulu
değerlendirme formu
128
EK-2. SPSS Analizi
129
EK-2. (Devam) SPSS Analizi
130
EK-2. (Devam) SPSS Analizi
131
EK-2. (Devam) SPSS Analizi
132
EK-2. (Devam) SPSS Analizi
133
EK-2. (Devam) SPSS Analizi
134
EK-2. (Devam) SPSS Analizi
135
EK-2. (Devam) SPSS Analizi
136
EK-2. (Devam) SPSS Analizi
137
EK-2. Kruskall Walls Testi
N
Std.
Ortalama
Sapma
Pozitif kontrol
2
54,2
2,4
Ornek1
4
13,3
0,3
Ornek2
4
31,3
0,7
Ornek3
4
15,2
Ornek4
4
17,4
Ornek5
4
24,2
1,1
Ornek6
4
19,1
0,3
0,6
0,5
Kruskal
walls
p
testi
5,063
0,08
138
ÖZGEÇMİŞ
Kişisel Bilgiler
Soyadı, adı
: TARANÇI, ÖZGE
Uyruğu
: T. C.
Doğum tarihi ve yeri : 29.08.1986, Ankara
Medeni hali
: Evli
Cep telefonu
: 0 (531) 295 80 94
e-mail
: ozzgeunlu@gmail.com
Eğitim Bilgileri
Derece
Eğitim birimi
Lisans
Ondokuz Mayıs Üniversitsi Fen Fakültesi 2010
Mezuniyet tarihi
Biyoloji Bölümü (2,58/4)
Lise
Mehmetçik Lisesi
2006
Yabancı Dil
İngilizce
Ulusal Sempozyum Bildirileri
1. Özge Ünlü, Selcen Babaoğlu Aydaş ve Belma Aslım, ‘‘Centaurea depressa Bieb.
(Asteraceae)’ nın antigenotoksik özelliklerinin ve çeşitli kanser hücre hatları üzerine
antiproliferatif, etkilerinin belirlenmesi’’, 21. Ulusal Biyoloji Kongresi, 3-7 Eylül
2012, İzmir, PC-097, Sayfa: 769 (Poster).