cinsiyet farkının radyoterapiye bağlı akut akciğer toksisite üzerine
advertisement
T.C. TRAKYA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ RADYASYON ONKOLOJİSİ ANABİLİM DALI Tez Yöneticisi Yrd. Doç. Dr.Ruşen COŞAR CİNSİYET FARKININ RADYOTERAPİYE BAĞLI AKUT AKCİĞER TOKSİSİTE ÜZERİNE ETKİSİNİN GENETİK PREDİKTÖR OLAN ATAKSİ TELENJİEKTAZİ MUTASYON, TGF-1 VE SOD2 PANELİ İLE ARAŞTIRILMASI (Uzmanlık Tezi) Dr. Deniz ÇELİK EDİRNE – 2013 TEŞEKKÜR Uzmanlık eğitimim süresince yetişmemde büyük katkı ve emeği geçen, bilgi ve tecrübeleri ile her zaman yol gösterici olan tez yöneticim ve değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Ruşen COŞAR, değerli öğretim üyeleri Prof.Dr. Cem UZAL, Prof. Dr. Zafer KOÇAK, Doç Dr. Murat ÇALOĞLU, Doç. Dr. Vuslat YÜRÜT ÇALOĞLU, Doç. Dr. Mert SAYNAK, Uzm. Dr. Alaattin ÖZEN, Araş. Gör. Suat ÇAKINA, Deney Hayvanları Laboratuvarı’ndan Vet. Dr. Ziya ÇUKUR ve tüm çalışma arkadaşlarıma sonsuz teşekkürlerimi sunarım. İÇİNDEKİLER GİRİŞ VE AMAÇ......................................................................................................... 1 GENEL BİLGİLER ..................................................................................................... 2 AKCİĞERLERİN ANATOMİSİ ............................................................................... 2 RADYASYONUN CANLIDAKİ ETKİ MEKANİZMASI VE AŞAMALARI......... 4 RADYOTERAPİYE BAĞLI AKCİĞER TOKSİSİTESİ ......................................... 8 RADYOTERAPİNİN OLUMSUZ ETKİLERİNİN GENETİK PREDİKTÖRLERİ .................................................................................................... 21 GEREÇ VE YÖNTEMLER ...................................................................................... 28 BULGULAR .................................................................................................................. 40 TARTIŞMA.................................................................................................................... 46 SONUÇLAR ................................................................................................................... 51 ÖZET ............................................................................................................................... 52 SUMMARY .................................................................................................................... 54 KAYNAKLAR .............................................................................................................. 56 EKLER SİMGE VE KISALTMALAR ATM : Ataksi Telenjiektazi Mutasyon DNA : Deoksirübonükleik asit dNTP : Dinükleotid trifosfat Gy : Gray IL : İnterlökin mRNA : Mesajcı ribonükleik asit RNA : Ribonükleik asit RT : Radyoterapi SOD2 : Süperoksit Dismutaz 2 SOR : Serbest oksijen radikalleri TGF-β : Transforme edici büyüme faktörü-β TGF-1 : Transforme edici büyüme faktörü-β1 TNF-α : Tümör nekroz faktör-α 3D-CRT : 3 Boyutlu-komformal radyoterapi GİRİŞ VE AMAÇ İyonlaştırıcı radyasyon birçok tümör çeşidinin tedavisinde etkili olup kanserli hastaların %50-60’ında tedavinin önemli bir parçasıdır (1,2). Radyoterapinin amacı, normal dokuyu mümkün olduğunca korurken, tümör dokusuna maksimum dozu vermektir. Radyoterapi dozu artırıldıkça, lokal tümör kontrolünde de buna paralel bir artış elde edilir. Ancak, normal dokudaki komplikasyon riski de bununla birlikte artar. Dolayısıyla tümör kontrolü, bir anlamda normal dokunun radyoterapiye toleransına bağlıdır (2,3). Kanser tedavisinde, her geçen gün yeni gelişmelere paralel olarak hastaların sağkalım süreleri uzamaktadır. Bununla beraber, yeni kemoterapötik ilaçlara ve yeni radyoterapi cihaz ve tekniklerinin gelişmesine rağmen, tedaviye bağlı komplikasyonlar hala yüksek orandadır. Radyoterapi alan hastalarda, tedavi alanında tümörle birlikte, sağlıklı dokuların da bir kısmı ışınlandığından, radyoterapinin çeşitli yan etkileri ortaya çıkmakta ve bu durum kanser hastalarının yaşam kalitesinde bozulmaya neden olabilmektedir (2,3). Radyoterapiye bağlı gelişen akut ve kronik dönem akciğer toksisitesi de hastaların yaşam kalitesini bozan önemli yan etkilerden biridir. Biz bu çalışmamızda radyoterapiye bağlı gelişen akut akciğer toksisitesinin oluşumunda cinsiyet farkının etkisinin olup olmadığını perditör olarak ataksi telenjiektazi mutasyon (ATM), transforme edici büyüme faktörü-β1 (TGF-1) ve süperoksit dismutaz 2 (SOD2) panelini kullanarak değerlendirmeyi amaçladık. 1 GENEL BİLGİLER AKCİĞERLERİN ANATOMİSİ Üst solunum sistemi; burun, paranazal sinüsler, nasofarenks ve larenks’ten oluşur (4). Alt solunum sistemi trakea ve akciğerlerden oluşmaktadır. Solunum sisteminin en önemli organı akciğerlerdir. Göğüs boşluğunda en büyük yeri işgal eden akciğerler, kalbin de bulunduğu mediastinumun her iki yanında yer alırlar. Akciğerler süngerimsi elastik bir yapıya sahiptir. Koni şeklindedirler. Apeks pulmonis denilen bir tepesi, basis pulmonis denilen bir tabanı vardır. Facies costalis, facies mediastinalis, facies diaphragmatica (basis pulmonis) ve facies interlobaris olmak üzere dört yüzü bulunmaktadır (4) (Şekil 1). Sağ akciğer oblik (majör) ve horizontal (minör) fissürlerle ayrılmış üst, orta ve alt loblardan oluşur. Sol akciğer tek fissürle ayrılmış iki lobdan oluşur. Sol üst lobun lingular bölümü sağ taraftaki orta loba uymaktadır. Akciğerlerin hilusu; kan damarları, lenfatik damarlar ve sinirlerin akciğere girdiği ve çıktığı yerdir. Mediastinum ise iki akciğer arasındaki boşluktur ve içerisinde kalp, timus, özofagus, ana damarlar ve lenfatikler bulunmaktadır (5) (Şekil 1). Akciğerin lenfatikleri pek çok şekilde sınıflandırılır. TNM sistemine göre; anatomik olarak, mediastinal ve intrapulmoner olarak gruplandırılırlar. Mediastinal nodlar süperior ve inferior mediastinal olmak üzere ikiye ayrılır ve sayı ve yerleşime göre ayrıca sınıflandırılır. Süperior mediastinal nodlar; üst mediastinal, üst paratrakeal, pretrakeal ve alt paratrakeal (azigos nodları dahil) nodlardan oluşur. Alt mediastinal nodlar; subkarinal, paraözofajeal (karinanın aşağısı) ve pulmoner ligamandan oluşur. Diğer majör lenf nodu grupları, aortik, subaortik, aortikopulmoner pencere, paraaortik (asendan aortik veya frenik), hiler, intralobar, lobar, segmental ve subsegmental nodlardır (5) (Şekil 2). 2 Şekil 1. Solunum sistemine genel bakış (4) Şekil 2. Akciğerlerin lenfatikleri (5) Sağ üst lob lenfleri hiler ve trakeobronşial lenf nodlarına dökülür. Sol üst lobun lenfleri aynı taraf venöz açıyla ve sağ süperior mediastene doğru ilerler. Sağ ve sol alt lob lenfatikleri, inferior mediasten ve subkarinal lenf nodlarına ve buradan da sağ superior mediastene (sol alt lob sol superior mediastene de direne olabilir) direne olur (6) (Şekil 3). 3 Şekil 3. Akciğer lenfatiklerinin drenaj yönü (6) Akciğerlerin Solunum İşlevi Solunumun amacı; dokulara ihtiyacı olan oksijeni sağlamak ve karbondioksiti atmaktır. Solunum 4 bölümde incelenebilir: 1. Havanın atmosfer ve akciğer alveolleri arasında içe ve dışa akımı; ventilasyon 2. Alveoller ve alveolleri saran damarlardaki kan arasında oksijen ve karbondioksitin yer değiştirmesi; difüzyon 3. Oksijeni dokulara taşımak ve oluşan karbondioksiti dokulardan uzaklaştırmak için kanda ve vücut sıvılarında oksijen ve karbondioksit taşınması 4. Solunum regülasyonu (7). RADYASYONUN CANLIDAKİ ETKİ MEKANİZMASI VE AŞAMALARI İyonlaştırıcı radyasyon birçok tümör çeşidinin tedavisinde etkili olup kanserli hastaların %50-60’ında tedavinin önemli bir parçasıdır (1,2). Tıpta radyoaktif izotoplar ve radyasyon çeşitli hastalıkların tanı ve tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Radyoterapide, yüksek enerjili X ışını kaynakları, partikül akselaratörleri ve Kobalt-60 kaynaklarından elde edilen iyonlaştırıcı radyasyonlar kullanılmaktadır. Bir atom veya molekülden bir elektronun kopmasına neden olan radyasyon tipine iyonlaştırıcı radyasyon adı verilir. İyonlaştırıcı radyasyonlar, X ve gama ( ) gibi elektromagnetik radyasyonlar ve alfa (α), beta (β) partikülleri, elektronlar, protonlar ve nötronlar gibi partiküler radyasyonlar olmak üzere iki gruba ayrılır (8,9). 4 İyonlaştırıcı radyasyonların canlıda biyolojik bir etkiye yol açabilmesi için radyasyonun canlıyı olusturan hücreler ve dokular tarafından absorblanması ve bu enerjinin dokularda dağılması gerekir (8,9). Biyolojik bir sistemde radyasyon etkisi ile oluşan tüm bu olaylar zinciri, eğer radyasyon enerjisinin, örneğin DNA ya da bir enzim molekülü gibi özel bir biyolojik yapı tarafından absorplanması ile başlamışsa, bu etkiye radyasyonun “direkt etkisi” denir. Radyasyonun direkt etkisi biyolojik etkinin bir bölümünden (1/3) sorumludur. Yüklü atom parçacıklarının oluşturduğu etki bu yolladır. Bu biyolojik moleküller içinde bulunduğu ortamın molekülleri tarafından radyasyon enerjisinin absorplanması ile değişikliğe uğrayarak bu olaydan indirekt olarak etkilenirler. Bu etkiye ise radyasyonun “indirekt etkisi” denir (Şekil 4). Biyolojik etki asıl bu indirekt mekanizma ile oluşur. X ve gama ( ) ışınları genellikle indirekt yolla etki ederler (2,3,8,9). Şekil 4. İyonlaştırıcı radyasyonun direkt ve indirekt etkileri (9) Radyasyonun canlıda oluşturduğu etkiler ayrıntılı bir şekilde incelendiğinde, radyasyon enerjisinin absorblanması ile biyolojik etkinin ortaya çıkışı arasındaki sürede birbirini izleyen olaylar zinciri fiziksel, kimyasal ve biyolojik kademeler olarak bilinen üç aşamada gerçekleşir. Radyasyon etkisinin ilk aşaması olan fiziksel aşama, iyonlaştırıcı radyasyonlar ile canlı dokuları oluşturan atom ve moleküller arasındaki ilk etkileşimleri içerir. 5 Radyasyon enerjisi maddeye transfer edilir. Çok hızlı bir elektron, 10-18 saniyede DNA molekülünden, 10-14 saniyede de bir hücreden geçebilir. Bu esnada DNA molekülü ya da hücredeki diğer moleküllerde iyonlaşma ve uyarılma (eksitasyon) olayları meydana gelir. Bu iyonlaşmalar sonucunda oluşan serbest elektronlar, diğer komşu atomlarda da iyonlaşmalara yol açarlar ve böylece zincirleme bir iyonlaşma olayı meydana gelir. Bu kademede oluşan yeni ürünler, genellikle son derece kararsızdırlar ve çok kısa bir süre içinde sekonder reaksiyonların oluşmasına yol açarlar (8,9). İkinci aşama olan kimyasal aşamada, radyasyon tarafından hasar görmüş atom ve moleküller diğer hücresel yapılar ile zincirleme reaksiyonlara girerek serbest oksijen radikallerinin oluşmasına yol açarlar. Serbest oksijen radikalleri (SOR) çok reaktif yapılar olduğundan hem kendileri ile hem de ortamdaki diğer moleküllerle reaksiyona girmeye devam ederler (8,9). İyonlaştırıcı radyasyonun temel etki mekanizması, DNA’da yaptığı hasara bağlı olarak hücre ölümüne yol açmasıdır. DNA’daki ölümcül (letal) hasar DNA molekülünün fırlatılmış bir elektron ile direkt iyonizasyonu sonucu meydana gelebilir. Ortamdaki suyun iyonizasyonuna bağlı olarak gelişen SOR oluşumu DNA’daki ölümcül hasarın asıl sorumlusudur (8,9). Sekonder reaksiyonlar da oluşan SOR’un miktarının artmasına yol açar. DNA’nın yanı sıra lipid ve proteinler de iyonlaştırıcı radyasyona bağlı serbest radikallerden etkilenir. Lipid peroksidasyonunun, hücre membranlarındaki hasarın önemli nedenlerinden biri olduğu ve SOR’a bağlı doku hasarının gelişmesine katkıda bulunan bir diğer faktör olduğu gösterilmiştir (9,10). Üçüncü aşama; biyolojik aşamadır. Bu süreçte canlıda meydana gelen olaylar, radyasyonun son biyolojik etkisinin ortaya çıkmasına sebep olurlar. Çeşitli hasarlara yol açan enzim reaksiyonları ile başlar. Bu arada DNA moleküllerinde hasarlar oluşmaya devam eder ve bunların bir kısmı onarılabilir. Onarılamayan hasarlar ise hücrenin ölümüne yol açarlar. Eğer ölüm kök hücrelerinde meydana gelirse, ışınlamadan birkaç hafta ya da birkaç ay sonra ortaya çıkan erken doku ölümleri meydana gelir. İnce bağırsak ve kemik iliğinde oluşan hasarlar, bu tip olaylara örnektir. Bunun yanı sıra radyasyon, genetik bozukluklar ve kanser oluşumu gibi geç biyolojik etkilere de neden olabilir (8,9). İyonlaştırıcı radyasyonların canlıda oluşturduğu etki kademeleri ile bu kademelerde oluşan bozukluklar ve bütün bu olayların meydana gelme süreleri Tablo 1’de gösterilmiştir. Başlatıcı reaksiyonların tamamen fiziksel nitelikli oldukları bu tabloda da net bir şekilde görülmektedir. Bu canlı bir sistem olabileceği gibi, cansız bir sistem de olabilir. Her iki durumda da olayların gidişatı aynı olmasına rağmen, biyomoleküler ve biyolojik 6 bozuklukların ortaya çıkmasına yol açan kimyasal ve biyolojik olaylar sadece canlı bir sistemde mümkün olabilir. Tablo 2’de memeli hayvanlarda bu kademelerde hangi önemli radyasyon etkilerinin hangi biyolojik organizasyon düzeyinde meydana geldiği gösterilmiştir (8,9). Tablo 1. Canlıda radyasyon hasarına yol açan olaylar (8,9) Tablo 2. İyonlaştırıcı radyasyona bağlı görülen bazı radyobiyolojik bozukluklar (8,9) Radyasyon DNA molekülünde birçok lezyona neden olur ve bu radyasyon hasarının oluşmasındaki kritik noktadır. Bu lezyonlara, tek-sarmal kırıklar, çift-sarmal kırıklar ve DNAprotein çapraz bağları gibi örnekler sıralanabilir. Çift-sarmal kırıklar ve çift-sarmal kırıklar ile ilişkili veya çift-sarmal kırıklarının bir sonucu olarak gelişen kromozom aberasyonları hücre ölümüyle sonuçlanan ana hasarlardır (11). Hem subletal hem de potansiyel olarak letal radyasyon hasarı onarılabilmektedir (12,13). Subletal hasar tamiri hızlı bir süreçtir ve 4-6 saat içinde tamamlanır. Fraksiyone radyoterapide iki ışınlama arası zaman aralığı DNA’ daki 7 radyasyona bağlı çift-sarmal kırıklarının tekrar birleşmesi ve tamirine imkan sağlar. Subletal hasar tamiri, hücre sağkalım eğrisindeki omuzun bir sonraki doz için kompanse edilmesi şeklinde açıklanabilir. Çevresel faktörlerin hücre bölünmesini birkaç saatliğine önlediği durumlarda potansiyel olarak letal hasar tamiri gerçekleşebilmektedir (Örneğin in vitro olarak büyüyen hücrelerin ışınlama sonrası plato fazda kalması gibi). Işından birkaç saat sonra gerçekleşecek olan DNA replikasyonu sırasında oluşabilecek DNA hasarının tamiri eğer bölünme engellenirse, replikasyon olmadan mümkün olabilecektir. Tamir, hasarlı moleküllerin okside olmuş substratlara elektron aktaran türlerin redüksiyonu ile restorasyonu veya homolog ve non-homolog rekombinant DNA çift-sarmal kırık tamiri, baz hasarının baz eksizyon tamiri ve DNA-protein çapraz bağlarının nükleotid eksizyon tamiri şeklinde gerçekleşmektedir (14,15). Hem radyasyon hem de kemoterapötikler; prolifere olan hücrelere olmayanlardan daha fazla etkilidir ve sitotoksik etkileri hücrelerin hücre siklusundaki bulundukları fazla ilişkilidir. Radyasyona yanıtın hücre siklusuna bağımlı oluşu ilk defa 30 yıl önce Terasima ve Tolmach tarafından bildirilmiştir (16). Buna göre radyoduyarlılık, hücrenin ışınlandığı sırada içinde bulunduğu hücre siklusuna bağlı olarak değişkenlik göstermektedir ve G2 ve M fazındaki hücreler S fazındaki hücrelerden en az 3 kat daha radyoduyarlıdır (17,18). RADYOTERAPİYE BAĞLI AKCİĞER TOKSİSİTESİ Radyoterapiye bağlı toksisitede uygulanan radyoterapi dozu ve ışınlanan hacim önemli rol oynamaktadır. Spinal kord, özefagus, trakea, bronşlar ve sinirler gibi fonksiyonel alt birimleri birbirine seri bağlı dokularda her bir alt birimin önemli rolü vardır. Bu nedenle seri bağlı organların küçük bir noktasının bile yüksek doz alması ciddi yan etkilere neden olabilmektedir. Akciğerler gibi fonksiyonel alt birimleri paralel bağlı organlarda ise her bir alt birimden ziyade ışınlanan hacim daha önemlidir (19). Tablo 3’te normal doku tolerans dozları özetlenmiştir (20). Tüm bu tolerans dozları eş zamanlı uygulanacak kemoterapötik ajanlar ile daha da düşmektedir. Radyasyona en hassas dokulardan biri akciğer dokusudur. Damarlar ve alveol epiteli radyasyona karşı duyarlı iken kıkırdak dokusu ve plevra dirençlidir (9). Radyasyona bağlı pulmoner toksisite; radyasyon pnömonisi, pulmoner fibrozis ve pulmoner fonksiyonlarda azalma ile karşımıza çıkabilir. Akciğerlerde meydana gelen radyasyon hasarı, ışınlanan akciğer dokusu hacmine, uygulanan toplam doz ve fraksiyon şemasına bağlıdır (21,22). 8 Tablo 3. Radyasyon normal doku tolerans dozları (20). TD 5/5: Beş yılda %1-5 komplikasyon oluşturan radyasyon dozu, TD oluşturan radyasyon dozu , Dozlar santigray cinsinden yazılmıştır. 50/5 : Beş yılda %50 komplikasyon Radyoterapiye bağlı akciğer toksisitesi sık olup, özellikle belli bir dozun üzerine çıkıldığında uygulanacak radyoterapi dozlarını önemli ölçüde sınırlamaktadır. Akciğer kanseri, meme kanseri, lenfoma ve timoma nedeni ile radyoterapi uygulanan hastaların %30’unda radyoterapiye bağlı akciğer şikayetleri meydana gelir (23). Hodgkin lenfoma, özefagus kanseri ve total vücut ışınlaması sonrası kemik iliği transplantasyonu gibi kombine tedavi modalitelerinin uygulandığı durumlarda da radyoterapiye bağlı pulmoner toksisite sıklıkla görülür (3,24). İyonlaştırıcı radyasyona bağlı akciğer hasarının mekanizması tam olarak bilinmese de sitokin aktivitesi ve oksidatif strese bağlı olduğuna dair çalışmalar vardır (24,25). SOR’u inhibe eden veya “scavenger” (temizleyici, süpürücü, toplayıcı) etki gösteren antioksidan ilaçlar iyonlaştırıcı radyasyona bağlı normal dokulardaki hasarı azaltabilir (10). İyonlaştırıcı radyasyona bağlı oluşan oksidatif hasarı en aza indirmek için radyasyondan koruyucu ajanlar (radyoprotektörler) üzerinde yapılan çalışmalar son yıllarda giderek yaygınlaşmıştır (9). Normal dokularda radyoterapiye bağlı gelişen yan etkiler akut, subakut ve geç radyasyon komplikasyonlarıdır. Akciğerde akut/subakut radyasyon hasarı olarak radyasyon pnömonisi; geç radyasyon hasarı olarak da radyasyon fibrozisi, kronik radyasyon pnomonisi, kor pulmonale ve sağ kalp yetmezliği görülebilmektedir (2,3,26,27). Akut faz ve subakut faz tedavi zamanıyla ilişkilidir. Radyasyon pnömonisi bu iki fazda ve genellikle tedavi başlangıcından 3-6 ay sonra; kronik faz ise bir yıl ve sonrasında görülmektedir (9) (Tablo 4). 9 Tablo 4. Radyoterapi sonrası akciğerde meydana gelen akut değişiklikler (28) Radyasyon pnömonisi akut bir komplikasyondur. Genel kural olarak ortalama akciğer dozu 10-20 Gray (Gy)’in üzerinde ise veya 13 Gy üzerinde doz alan akciğer volumü akciğerin %40’ından fazla ise veya 20 Gy üzerinde doz alan akciğer volumü akciğerin %20-30’undan fazla ise veya 30 Gy üzerinde doz alan volum akciğerin %10-15’inden fazla ise radyasyon pnömonisi gelişme riski artar (29). Standart fraksiyon ve dozlarda (1,5/2 Gy/fraksiyon/gün) tüm akciğere 18-20 Gy uygulandığında en az % 5 olguda radyasyon pnömonisi gözlenmektedir (2,3). Radyasyon pnömonisi gelişimi radyoterapi dozu, ışınlanan akciğer volümü, fraksiyonasyon şeması ve eş zamanlı kemoterapi uygulanması gibi tedavi ilişkili faktörlere ve önceden var olan akciğer hastalığı, kötü pulmoner kapasite, sigara öyküsü ve bozuk DNA tamir mekanizması ile bozuk büyüme faktör genleri gibi bilinmeyen genetik faktörler gibi hasta ilişkili faktörlere bağlıdır (30-33). Özellikle bazı kemoterapötik ajanlar riskin artmasına sebep olmaktadır. Bu ajanlar aktinomisin-D, doksorubisin, bleomisin, busulfan, siklofosfamid ve interferonlar ve taksan grubu ilaçlardır (29). “Radyasyon pnömopatisi” terimi akciğer radyoterapisi sonrasında başlayan ve devam eden bir süreci tanımlamaktadır. Bu birbirinden ayrı ve buna rağmen yakın ilişkili iki anormallikten oluşmaktadır (34). Bunlardan birisi akciğer radyoterapisi sonrası 12 hafta içinde oluşan, alveoler hücre harabiyetini ve interstisyel aralığa inflamatuvar hücre birikimini içeren erken inflamatuvar bir reaksiyon olan radyasyon pnömonisidir. İkincisi ise yakın geçmişe kadar irreversibl olarak tanımlanan, temel olarak fibroblast proliferasyonu, kollajen 10 birikimi ve normal akciğer dokusunun harabiyetinden ibaret olan ve geç bir yan etki olan radyasyon fibrozisidir (35). Radyasyon pnömopatisi süreci hiç şüphesiz en merak uyandırıcı radyobiyolojik fenomenlerden biridir. Akciğer fibrozisine yol açan ya da eşlik eden interstisyel inflamasyon, normal akciğer dokusunun kaybına yol açan proinflamatuvar ve profibrotik sitokinleri içeren kompleks bir süreçtir (36). Periferal akciğer parankimi respiratuvar bronşioller, alveoler kanallar ve alveollerden oluşmuştur. Alveoler duvar bir bazal membran yoluyla epitelle ilişki kuran endotelle kaplanmıştır. İnteralveoler interstisyel boşluk fibroblastlar, alveoler makrofajlar ve ekstrasellüler matriksten oluşmuştur (37). İki tip alveoler epitel hücresi vardır. Tip 1 pnömositler; alveoler epitel yüzeyinin %90’ından fazlasını kaplayan squamöz epitel hücreleridir. Hasar oluşurken, ilk etkilenen ve apoptozise ilk giden ve alveoler epiteli yeniden oluşturmak için Tip 2 epitel hücrelerinin proliferasyonunun hızlanmasına yol açan hücreler, Tip 1 pnömositlerdir. Tip 2 pnömositler (granuler pnömositler); sentez yapan ve alveoler yüzeyi kaplayarak yüzey gerilimini düzenleyen pulmoner sürfaktanı sekrete eden küboidal hücrelerdir (38). Tip 2 hücre hiperplazisi alveoler hasar ve onarımının nonspesifik bir belirtecidir. Bu hücreler radyoterapiden sonraki ilk 2-6 hafta boyunca alveoler sürfaktan üretimini arttırarak yanıt verirler (39). Kapiller endoteli oluşturan kapiller hücreler “tight junction”larla birbirlerine sıkıca bağlanmıştır. Gaz transferi intraalveoler havadan tip 1 hücrelere, bazal membrana, endotelyal hücrelere ve son olarak da vasküler boşluğa doğrudur. Bronkovasküler yapılar boyunca bol miktarda bulunan lenfatik endotel, alveoler duvarlarda bulunmamaktadır. Radyoterapi sonrası erken histopatolojik bulgular “diffüz alveoler hasar” olarak tanımlanır (40). Bu artan vasküler permeabilite ve alveoler boşlukta protein eksüdasyonuna bağlı gelişen alveoler duvar ödemini içerir (41). Damarlarda fokal nekrozla birlikte tromboz ve sonradan intraalveoler hemoraji gelişebilir. İnflamatuvar hücre infiltrasyonu (inflamasyon) belirgindir ve en azından deneysel modellerde günler içinde hızlıca yatışır. Alveoler epitel rejenerasyonu sürecinde Tip 1 pnömosit tükenmesi Tip 2 pnömosit hiperplazisine eşlik eder (42). İntraalveoler boşlukta olduğu gibi interstisyumda da fibroblast proliferasyonu ve artan kollajen birikimi patogenetik mekanizmanın anahtarıdır. Birkaç hafta içinde alveoler septa kalınlaşması ve fibrozis belirgin hale gelir (39). İnsanlarda doğrulanmamış olsa da lökosit infiltrasyonu fibrozis fazına eşlik edebilir (43). Şekil 5’de radyasyon pnömopatisinin şematizasyonu görülmektedir. 11 Şekil 5. Radyasyon pnömopatisinin şematizasyonu (39). İnterstisyumda normal koşullarda iki tip fibroblast bulunmaktadır. Bunlar epitele paralel yerleşen ve ekstrasellüler matriksin yapısal elementleriyle ve alveoler duvara dik yerleşmiş myofibroblastlarla çok yakından ilişkili olan en yaygın fibroblast tipleridir. Myofibroblastlar kontraksiyon yeteneğine sahiptir (44). Alveoler makrofajlar alveoler fizyolojide önemli rol oynarlar. Aktive makrofajlar, nötrofiller ve lenfositler için mitojenik ve kemotaktik özellikli çeşitli sitokinler üretirler, ayrıca fibroblastlar ve endotelyal hücreler üzerinde direkt rol oynarlar. Alveoler duvarın 12 ekstrasellüler matriksi bazal membran ve fibroblastlar ile damarlar arasındaki interstisyel matriksten oluşur. Ekstrasellüler matriks proteoglikanlar, fibronectin, laminin, entactin, Tip 4 ve Tip 7 kollajen içerir (45). Alveoler epitelyal ve endotelyal hücreler sentez yaparlar ve bazal membranı korurlar. Literatürde radyasyon pnömopatisi boyunca ekstrasellüler matriksin miktar ve kalitesinde değişiklikler oluştuğu gösterilmiştir. Tip 1/3/4 kollajen ve fibronectin seviyelerinde yükselme gösterilmiş ve radyoterapi uygulanmasının ardından 8 hafta boyunca bu yükselmenin devam ettiği belirtilmiştir (46). En dramatik yükselme endotel bazal membranının önemli bir komponenti olan Tip 4 kollajende görülür. Radyasyon pnömonisi değerlendirilmesi güç bir antitedir. Geniş akciğer volümleri ışınlandığında ya da yüksek dozlar uygulandığında (<50 Gy) özellikle de radyoterapi kemoterapiyle kombine edildiğinde semptomların oranı ve şiddeti artar. Erken gelişen radyasyona bağlı akciğer toksisitesi, kortikosteroid ve antibiyotik tedavisiyle kontrol altına alınabilecek, düşük ateş, hafif öksürük ya da hafif dispne gibi nonspesifik respiratuvar semptomlardan ibarettir. Akut pnömoni fazı radyoterapiden sonraki 12 haftalık zaman dilimi içinde oluşur. Akciğere radyoterapi uygulanan hastaların %50-90’ında radyografik ve solunum fonksiyon testi anormallikleri oluşur (39,47). Akciğeri, mediastinal lenfatikleri ve memesi ışınlanan hastalarda sırasıyla %5-50, %510 ve %1-5 oranında klinik olarak anlamlı semptomatik radyasyon pnömonisi oluşur ve bu hastalardaki en yaygın klinik toksisitelerden biridir. Radyasyon pnömonisi riski verilen dozun sınırlandırılmasına neden olur ve bu nedenle tümör kontrolüne engel olabilir. Hastaların büyük bir bölümü subklinik radyasyon pnömonisi geçirir (örneğin solunum fonksiyon testlerinde bozulma ve/veya radyolojik değişiklikler, bu kronikleşebilir ve hastanın gelecekte oluşabilecek kardiyopulmoner stres ile mücadelesi için rezervini azaltabilir) (48,49). Tablo 5’te Radyoterapiye bağlı akciğer toksisitesi için oluşturulmuş değişik gradeleme sistemleri gösterilmiştir Önerilen doz/volüm sınırları tartışmalıdır çünkü açık ve tutarlı eşik değerler yoktur ve kabul edilebilir risk seviyesi klinik tabloya göre değişkenlik gösterir. Akciğer kanseri için radyoterapi sahaları hedef volüme uygun olarak geniş tutulabilir, doktor ve hastalar sıklıkla önemli ve anlamlı pulmoner riskleri kabul etmek durumunda kalırlar. Ayrıca, hastalar arasında radyoterapi öncesi akciğer fonksiyonları açısından belirgin farklılıklar vardır ve bu semptom gelişimini etkileyebilir ve radyoterapi sonrası tümöre bağlı disfonksiyon gelişebilir. 13 Bu uyarılara rağmen, küratif tedavi edilen küçük hücreli dışı akciğer kanserli hastalarda eğer radyasyon pnömonisi riskini ≤ %20 sınırında tutmak isteniyorsa V20 ≤ %3035 ve MLD ≤ 20-23 Gy (konvansiyonel fraksiyonasyonla) sınırı içinde tutmak için ihtiyatlı olunmalıdır. Santral havayollarına ≤ 80 Gy doz uygulanması bronşiyal striktür riskini azalttığı gösterilmiştir (50). Tablo 5. Radyoterapiye bağlı akciğer toksisitesi için oluşturulmuş değişik gradeleme sistemleri (50) Şekil 6’da akciğer kanseri nedeniyle akciğere radyoterapi uygulanan hastada oluşan radyografik değişikliklerin bilgisarlı tomografi görüntüsü verilmiştir. 14 Şekil 6. Akciğer kanseri nedeniyle toraksa uygulanan radyoterapi sonrası radyografik değişikliklerin bilgisayarlı tomografi görüntüleri: A- Grade 1; buzlu-cam görünümü, B- Grade 2; düzensiz konsolidasyon, C- Grade 3; ışınlanan alana uyan daha düzenli ve birleşik konsolidasyon alanı (50) Akciğer fibrozisi daha önceden ışınlanan alanda sinsice gelişir ve radyoterapi sonrası 1-2 yıl içerisinde tamamiyle yerleşir (39). Klinik olarak bulgular, fibrozis gelişen akciğer parankimi miktarına bağlıdır. Semptomları, şiddetli dispne ve son evrelerinde ortopne, siyanoz, solunum yetmezliği ve cor pulmonale gibi farklı derecede bulgulardan oluşmaktadır. Seppenwoolde ve ark (51) larının yaptığı bir çalışmada nedeni tam olarak ortaya konamamakla birlikte akciğer kanserinde alt lob yerleşimli tümör nedeniyle ışınlanan hastaların radyasyon pnömonisi açısından çok daha yüksek riske sahip olduğu gösterilmiştir. 15 Radyasyon Pnömonisi İçin Predispozan Faktörler 1. Radyasyon dozu: Radyasyon pnömonisi için eşik değer 30 Gy’dir. Ancak burada radyasyona maruz kalan akciğer volümü çok büyük önem taşımaktadır. Örneğin; tüm akciğerin %25’ine fraksiyone olarak 30 Gy uygulandığında herhangi bir semptom olmayabilir. Ancak aynı doz bütün akciğer alanlarına uygulanırsa fatal olabilir. Yirmidört çalışmadan toplam 1911 hastanın alındığı bir çalışmada 45 Gy altında radyasyon pnömonisi insidansı %6, 55 Gy üzerinde ise %12 olarak bildirilmiştir (52). 2. Işınlanan akciğer volümü: Radyasyona maruz kalan normal akciğer dokusu ne kadar azsa radyasyon pnömoniside o kadar az olur. Bu açıdan üç boyutlu-konformal RT geleneksel RT yöntemlerine göre iki-dört kat avantaj sağlamaktadır. Ayrıca, akciğerin tabanında alveol sayısı daha fazla olduğu için bu bölgeye RT uygulanması durumunda apekse göre radyasyon pnömonisi daha çok görülmektedir. Eşik volüm, bazal akciğer alanları için %10, apeks için %30-40’tır. Altmış hastanın alındığı bir çalışmada alt akciğer alanları ışınlandığında radyasyon pnömonisi sıklığı %70, üst alanlar için ise %20 olarak bildirilmiştir. 25 Gy doz %30’dan fazla akciğer volümüne verildiğinde radyasyon pnömonisi %38, %30’dan az volüme uygulandığında ise %4 oranında görülmüştür (52). 3. Fraksiyon dozu ve sayısı: Günde iki kez uygulamada bir kez uygulamaya göre daha az sıklıkta radyasyon pnömonisi görülmektedir. Günde 2.67 Gy dozu tek seferde alanlarda, iki seferde alanlara göre riskin arttığı gösterilmiştir (52). 4. Küçük volüme yüksek doz mu, büyük volüme düşük doz mu?: Çalışmalar 10 Gy altındaki dozları büyük bir akciğer volümüne vermenin daha uygun olacağını düşündürmektedir. Ancak daha yüksek dozlarda bunun tersinin daha uygun olacağı ifade edilmektedir. Elbette ideal olanı mümkünse hem RT dozunu hem de ışınlanan akciğer volümünü sınırlamaktır. Ancak tümör dozunu azaltmanın aynı zamanda tümör kontrolünü de azaltacağı düşünülerek normal akciğerin korunması için gerekli önlemleri almak daha akılcı olacaktır (52). 5. Eş zamanlı kemoterapi uygulaması: Bağımsız bir risk faktörüdür. Bu konuda özellikle doksorubisin, aktinomisin-D, busulfan, bleomisin, gemcitabine, mitomisin, irinotekan ve taksan grubu ilaçlar suçlanmaktadır. Beş klinik çalışmadan toplam 461 hastanın 16 alındığı bir derlemede üçüncü derece ve üzerinde akciğer toksisitesinin eş zamanlı sisplatinli kemoradyoterapi alanlarda %20, ardışık alanlarda ise %10 oranında görüldüğü bildirilmiştir. Eş zamanlı RT ve paklitaksel alan hastalarda %70’lere varan ikinci derece ve üzeri akciğer toksisitesi bildirilmiş, ancak bazı çalışmalarda da performans durumunun riski arttırmadığı görülmüştür. İrinotekanla ilgili çalışmalarda irinotekan alanlarda %56, almayanlarda ise %14 radyasyon pnömonisi bildirilmiştir. Dosetaksel ve eş zamanlı konvansiyonel RT alan hastalarda üçüncü derece ve üzeri radyasyon pnömonisi %47, fatal seyreden radyasyon pnömonisi oranı %19 olarak bildirilmiştir (52). 6. Daha önce RT uygulanmış olması: Hodgkin lenfoma nedeniyle daha önce RT uygulanan hastalarda tekrar RT uygulanması durumunda radyasyon pnömonisi görülme oranının %15, ilk kez uygulananlarda ise %6.4 olduğu bildirilmiştir (52). 7. Önceden kullanılan steroidlerin kesilmesi: Hodgkin lenfoma nedeniyle steroid kullanan hastalarda steroid kesildikten hemen sonra radyasyon pnömonisi geliştiğinin görülmesi üzerine özellikle yüksek doz steroidlerin hızlı kesilmesi durumunda radyasyon pnömonisini aktive edebileceği tezi ortaya atılmıştır (52). 8. Kötü performans durumu: Performans durumu 1 olanlarda %16, 0 olanlarda ise %2 oranında radyasyon pnömonisi bildirilmiştir (52). 9. Altta yatan başka akciğer hastalığı varlığı: Altta yatan akciğer hastalığı olanlarda radyasyon pnömonisi riskinin arttığını gösteren çalışmalar mevcuttur. Bir çalışmada radyasyon pnömonisi gelişen gruptaki hastaların %47.1’inde altta yatan akciğer hastalığı olduğu, %5,3’ünde ise olmadığı görülmüştür. PaO2 80 mmHg’nın altında olanlarda radyasyon pnömonisi %19, üzerinde olanlarda ise %5 oranında görülmüştür. Bir başka çalışmada da KOAH’lılarda radyasyon pnömonisi riskinin 4,82 kat arttığı gösterilmiştir. Sigarayla ilgili çalışmaların sonuçları çelişkilidir. Bir çalışmada aktif sigara içiminin radyasyon pnömonisinden koruduğu bildirilmiş, bir başka çalışmada ise daha önce sigara içmiş olmanın radyasyon pnömonisi riskini arttırdığı gösterilmiştir. Sigaranın radyasyon pnömonisine etkisine ilişkin daha ileri çalışmalara ihtiyaç bulunmaktadır (52). 17 10. Yaş ve cinsiyet: Yaşla ilgili olarak yapılan bir çalı şmada yaşlılarda radyasyon pnömonisinin daha yaygın olduğu, ancak daha ciddi olmadığı, diğer bir çalışmada ise bunun tam tersinin olduğu iddia edilmiştir. Bugün için yaş, radyasyon pnömonisinde bağımsız bir risk faktörü olarak kabul edilmemektedir (52). 11. Genetik: Başka herhangi bir risk faktörü olmadığı halde yine de bazı hastalarda radyasyon pnömonisi görülmesi nedeniyle genetik yapı farklılıklarının da radyasyon pnömonisi gelişiminde etkili olabileceği düşünülmektedir. RT’ye bağlı akciğer hasarında M6P/IGF2R geninin rol oynadığı ve bu genin kaybının radyasyon pnömonisi riskini arttırdığı düşünülmektedir (52). Tedavi Hastaların büyük çoğunluğu subklinik ya da hafif semptomlu olduğu için tedavi gerektirmemekte ve kendiliğinden rezolüsyona uğramaktadır. RT portuna uyan alanda hafif değişikliklerin olduğu hastalarda sadece izlem önerilmektedir. Ayrıca, minör semptomların ileride ciddi bir hastalık gelişeceğinin habercisi olmadığı da bilinmelidir (29). Radyasyon pnömonisi tedavisinin temel taşı sistemik steroidlerdir. Deneysel çalışmalar ve klinik tecrübeler steroidlerin yararını desteklemektedir. Tavşanlarda yapılan bir çalışmada steroidin erken kesildiği grupta mortalitenin daha yüksek olduğu gösterilmiştir. Hastaların yaklaşık %80’i steroid tedavisine iyi yanıt vermektedir. Steroid dozu konusunda kesin bir görüş olmamakla birlikte 1 mg/kg veya ciddiyetine göre 60-100 mg prednizonla başlanması ve iki haftada bir 10 mg azaltılarak üç-dört ayda kesilmesinin uygun olacağı düşünülmektedir. Hatta dispne ve öksürük düzelinceye kadar başlangıç dozunda devem edilmesi ve düzeldikten sonra doz azaltılmasının uygun olacağı da ileri sürülmektedir. Ayrıca, özelikle lipooksijenazı inhibe eden nonsterid antiinşamatuvar ilaçların steroidlerin etkisine katkıda bulunduğu da bildirilmiştir. Hastalığın ciddiyetine göre istirahat, bronkodilatatör ve oksijen tedavisi de yararlı olmaktadır. Yüksek doz inhale steroidlerle ilgili yeterli çalışma bulunmamakta ve genellikle olgu sunumları şeklinde yayınlar yer almaktadır (29). Pentoksifilin, metil ksantin türevidir ve TGF-β inhibisyonu yapmaktadır. Ancak henüz penroksifilinin rutin kullanımını destekleyecek yeterli çalışma bulunmamaktadır. Azatioprin ve siklosporin, sistemik steroidleri tolere edemeyenlerde kullanılabilir. Ancak bu konuda da yeterli çalışma bulunmamaktadır (29). 18 Tedaviye bağlı komplikasyonların önlenmesinde modern radyoterapi teknikleri önemli rol oynamaktadır. Stereotaktik radyoterapi, 3-boyutlu konformal radyoterapi, yoğunluk ayarlı radyoterapi ve görüntü kılavuzluğunda radyoterapi gibi daha konformal radyoterapi uygulamaları kritik normal dokuların aldığı dozları sınırlandırmakta büyük avantaj sağlamakta ve böylece tedaviye bağlı komplikasyonlar daha az görülmektedir. Radyoterapi tekniğinin yanında, hastanın eğitimi ve yaşam stilinde yaptığı değişiklikler de (örneğin; sigarayı bırakmak, diyetteki değişiklikler, kilo kontrolü) oldukça önemli rol oynamaktadır (53). Sonuç olarak, mediastinal tümörler nedeniyle radyoterapi uygulanacak olan hastalarda hastaya ait risk faktörleri ve uygulanacak ek tedaviler göz önüne alınarak en uygun radyoterapi planı ve tekniği seçilmeli, olgular sıkı takip edilmeli ve komplikasyon geliştiği taktirde gerekli tedaviler uygulanmalıdır. Prognoz Ciddi radyasyon pnömonisinin mortalitesi %50’ye kadar çıkmaktadır. Meme CA nedeniyle toraksa RT alanlarda radyasyon pnömonisinin mortalitesinin %2-3 olduğu bildirilmiştir (54). Radyasyon Pnömonisinden Korunma Yöntemleri 1. Yeni radyoterapi teknikleri: Sürekli hiprefraksiyone akselere radyoterapi: Günde üç fraksiyon (1.5 Gy), 12 günde total 54 Gy uygulamanın riski azalttığı düşünülmektedir. Bir çalışmada sürekli hiprefraksiyone akselere radyoterapi ile semptomatik radyasyon pnömonisi oranı %10 iken konvansiyonel RT ile bu oranın %19 olduğu bildirilmiştir (55). Üç boyutlu konformal radyoterapi: Daha küçük radyasyon alanı, daha küçük fraksiyon ve tümöre daha yüksek radyasyon imkanı sağlamaktadır. Özellikle 25 Gy ve üzerinde RT alan hastalarda bu yöntemle radyasyona maruz kalan ortalama akciğer volümünün ipsilateral akciğerde %11, karşı akciğerde ise %51 oranında daha az olduğu gösterilmiştir. Bu açıdan üç boyutlu konformal radyoterapi (3D-CRT) geleneksel RT yöntemlerine göre iki-dört kat avantaj sağlamaktadır. Paklitaksel-karboplatinle birlikte 3D-CRT uygulanan 62 hastalık bir çalışmada sadece bir hastada iki derece ve üzeri radyasyon pnömonisi bildirilirken, 18 19 hastanın alındığı ve 92,4-102,9 Gy RT uygulanan hastaların hiçbirinde ikinci derece ve üzeri radyasyon pnömonisi olmadığı saptanmıştır (56). Yoğunluğu ayarlanmış radyoterapi “Intensity Modulated Radiotherapy”: Burada helikal BT kullanılmaktadır. Konvansiyonel RT’ye göre ışınlanan normal akciğer volümünü %10-20 oranında azaltırken hedef dokuya RT dozunu arttırmaktadır. 3D-CRT ile karşılaştırılan bir çalışmada yoğunluğu ayarlanmış radyoterapi ile radyasyon pnömonisi %7, 3D-CRT ile %13 olarak bildirilmiştir (56). Bu tekniğin kullanımı henüz sınırlıdır ve yeterli çalışma bulunmamaktadır. “Boost” radyoterapi: Büyük alanlara düşük doz, tümöre yüksek doz RT esasına dayanmaktadır. Konvansiyonel RT’ye üstün olduğunu gösteren çalışmalar bulunmaktadır. Proton RT, karbon-iyon RT gibi yeni yöntemler de bulunmaktadır. Ancak henüz sınırlı kullanımları vardır. 3D-CRT ve yoğunluğu ayarlanmış radyoterapi ile normal akciğere verilen ışın dozu azalmakta ve tümör yanıtı korunmaktadır. Bu tekniklerde hasta immobilize edilmektedir. Ancak akciğer ve göğüs duvarı inspiryum-ekspiryum nedeniyle hareketli dokular oldukları için diğer organlardaki gibi tam bir immobilizasyon sağlanamamakta ve az ya da çok normal akciğer dokusu da RT’ye maruz kalmaktadır. 3D-CRT’de derin inspiryum nefes tutma tekniğiyle bu sorun da aşılmaya çalışılmaktadır (56). 2. Radyoprotektif ilaç tedavisi: Profilaktik amaçla RT’den önce prednizolon ve azatioprin kullanılan hastalarda etkili olduklarını gösteren çalışmalar kadar herhangi bir etkilerinin olmadığını gösteren çalışmalar da bulunmakta ve rutin kullanılmamaktadırlar. Amifostin (aminothiol) serbest oksijen radikallerini azaltmakta ve bu yolla radyasyon pnömonisinden korunmada da yararlı olabileceği düşünülmektedir. Amifostinin profilaktik olarak haftada iki-dört kez 500 mg kullanıldığı eski çalışmalarda etkili olduğu bildirilmiştir. Ancak yeni Faz III çalışmalar bu sonucu doğrular nitelikte değildir. Anjiotensin inhibitörü olan ve thiol içeren kaptoprille ilgili olarak yapılan deneysel çalışmalarda radyasyon pmönonisi ve fibrozisinden koruduğu gösterilmiş, ancak retrospektif analizlerde hipertansiyon nedeniyle kaptopril kullanan hastalara bakıldığında radyasyon pnömonisi sıklığını azaltmadığı görülmüştür (57). 20 Pentoksifilinle ilgili olarak yapılan plasebo kontrollü bir çalışmada karbonmonoksit diffüzyon kapasitesini koruduğu görülmüştür. Ancak rutin kullanımını destekleyecek düzeyde çalışma bulunmamaktadır. Ayrıca, melatonin, karvediol, süperoksit dismutaz, TNF-α inhibitörleri, şutikazon, selektif siklooksijenaz (COX)-2 inhibitörleri gibi çeşitli ilaçlar üzerinde araştırmalar devam etmektedir. RADYOTERAPİNİN OLUMSUZ ETKİLERİNİN GENETİK PREDİKTÖRLERİ Radyasyonun olumsuz/yan etkileri genel olarak radyasyon tedavisine verilen istenmeyen klinik ve fizyolojik yanıtlar olarak tanımlanmaktadır. Klonojenik tümör hücrelerinin yok edilmesi ve bunları çevreleyen normal dokuların hasar görme oranını minimize etme işlemleri arasındaki dengeyi sağlamak adına her iki dalda uğraşan bilim adamları ve klinisyenlerce olumsuz yanıtlara neden olan mekanizmalar üzerinde çalışmalar yapılmaktadır (58-62). Genetik Faktörler ve Radyosensitivite Radyoterapi sonrası oluşan normal doku reaksiyonlarının şiddetinin değişkenliğine hasta, tümör veya tedaviyle ilgili, hücresel ve moleküler faktörler etki etmektedir. Yaş, nutrisyonel durum, medikasyon, vücut habitusu ile diyabet veya yakın zamanda geçirilen cerrahi uygulamalar gibi var olan morbiditeler gibi hasta karakteristiklerinin tümü radyasyon toksisitesine katkıda bulunabilir (63). Boyut, histoloji ve tümörün evresi (grade) gibi tümörle ilgili faktörler de radyoterapiyi etkileyebilir. Tedavi edilen volüm, alan boyutu, anatomik prescription point, total doz, fraksiyon başına uygulanan doz ve eşzamanlı kemoterapi uygulaması gibi tedaviyle ilgili parametrelerdeki değişiklikler de yanıt heterojenitesine etki edebilir. Normal dokularda aşırı doz–yanıt ilişkisi nedeniyle, doz uygulamaları arasındaki farklar sonuçlarda değişikliğe yol açabilmektedir (64,65). Buna ek olarak, bireysel genetik farklılıkların da radyasyona verilen olumsuz yanıtlara etkisi olabileceği hipotezi öne sürülmektedir (66-71). Bu teoriyi destekleyen bulgular, meme kanseri hastalarından oluşan bir kohortta radyasyon kaynaklı telenjiektazi oluşumunun insidansı ve zamanını inceleyen bir çalışmadan elde edilmiştir (72). Tek tip radyasyon tedavisine rağmen, bu hasta popülasyonunda geniş aralıkta değerler rapor edilmiştir. Radyoterapi gören hastaları üzerinde daha önce yapılan analizlerle uyumlu olarak, gözlenen farklılıkların yaklaşık %80 ila %90’ muhtemelen bireysel genetik farklılıklardan kaynaklanan deterministik etkilere yorulurken, 21 sadece %10 ila %20’sinin radyasyonun indüklediği hücre ölümünün rastgele yapısıyla dozimetri ve doz yayılımındaki rastgele farklarla ilişkili stokastik olaylarla ilgili olduğu düşünülmektedir (65,73,74). Normal Doku Radyosensitivitesinde Tahminsel Çözümlemeler Hazırlama Yönündeki Çabalar Radyoterapi hastalarındaki normal doku hasarının boyutunu hesaplama gücüne sahip in vitro bir radyosensitivite çalışması geliştirmek uzun süreli araştırma gerektirmektedir (75). Sınırlı başarıya rağmen bu hedefi gerçekleştirme çabaları devam etmektedir çünkü radyasyonun istenmeyen etkilerini tahmin edebilmedeki üst düzey duyarlılık radyoterapi protokollerinin bireysel bazda uyarlanıp etkin şekilde uygulanabilmesine olanak sağlayacaktır. Bu şekilde, terapötik indekste önemli ölçüde iyileşme olacağı tahmin edilmektedir (73,76). İrradyasyon sonrası sonucu öngören ve böylece tedavi yönergesine rehberlik eden bilgileri klinisyene sağlayan sayısız çalışma yapılagelmektedir ama bunların hiç biri güncel uygulamalarda yerini sağlamlaştırmış değildir. Bu çalışmaların başarısını sınırlayan en büyük güçlükler sensitivite ve spesifite, prosedürlerin teknik yükü, çalışmanın yapıldığı hücrelerin yetersiz karakterizasyonu ve normal doku radyobiyolojisinin kompleks yapısı gibi etmenlerdir (77). Moleküler Yaklaşımlar Hangi hastanın radyoterapinin olumsuz etkilerine karşı daha hassas olabileceğini öngören bir çalışma yapmak yönündeki birçok ve çeşitli girişimlere rağmen bu güne dek hiçbir çalışma radyoterapi gören hastalarda oluşabilecek yan etkileri doğru ve tutarlı bir şekilde hesaplayabilmiş değil. Fakat moleküler biyolojideki yeni teknolojiler prediktif bir çalışma geliştirmek adına klinik uygulanabilirliği olan yeni stratejiler üretebilir (78). Bireyler arasında, farklı genlerin ekspresyon paternlerini baz alan, radyasyona normal doku sensitivitesinin varyasyonlarını öngörebilecek gen ekspresyon dizilimlerinin kullanımı ile ilgili çalışmalar devam etmektedir (79-84). Bir dizi çalışmada, insan tümörlerinde tedavi öncesi ekspresyon profillemenin gücü ortaya konmasına rağmen normal dokularda radyasyonun indüklediği toksisitenin boyutunu değerlendiren geniş skalalı çalışmalar henüz yapılmamıştır. Buna ek olarak, primer olarak sitokin yanıtlarına odaklanılarak morbiditeyle anlamlı korelasyonlar ortaya konmuştur (85). Başka bir moleküler yaklaşım da, irradyasyon sonrası DNA çift iplik kırılmaları oluşturan DNA bağlayıcı (end-binding) komplekslerinin 22 analizini içermektedir. SF2’ ile ölçüldüğü şekilde hücresel radyosensitivite ile ATM içeren komplekslerin seviyeleri korelasyon halindedir. Bu yeni moleküler yaklaşımlar umut verici görünse de henüz herhangi birinin klinik uygulanabilirliği olup olmayacağı bilinmemektedir (86). “Genetic Predictors Of Adverse Radiotherapy Effects” Projesi Radyasyonun indüklediği komplikasyonları yaşama ihtimali daha yüksek hastaların hangileri olabileceğini hesaplayabilen alternatif bir çalışma geliştirmek adına, klinik radyosensitiviteyle bağlantılı genetik faktörleri tanımlayan bir araştırma programı başlatılmıştır. Genetic Predictors Of Adverse Radiotherapy Effects (Gene-PARE) projesinin amacı, radyosensitiviteyle bağlantılı genetik faktörleri tanımlayarak hangi hastanın radyasyon tedavisi sonrası komplikasyonlar geliştirme ihtimalinin daha yüksek olduğunu öngörebilecek bir sistem geliştirmektir. Bu düşünceden yola çıkarak bu projede, radyasyonun indüklediği normal doku hasarının tahmin edilebilen boyutta olduğu, genel popülasyondan bu bireyleri ayırt edebilme amaçlanmıştır. Radyasyona karşı hassasiyeti yüksek olan bu hastalar için cerrahi tedavi daha uygun olsa da paradoksal şekilde aslında bu hastalar için radyasyon tedavisi en uygun tedavi olabilir çünkü bu hastaların sahip olduğu kanser tiplerinde radyosensitiviteyle bağlantılı benzer sekansta değişimler yaşanabilir. Bu, potansiyel radyoterapi dozu modifikasyonuna işaret edebilir çünkü radyosensitivitesi olan tümörler, genetik olarak farklılığı olmayan aynı tipteki tümörlere oranla teorik olarak daha az tedavi dozuna gerek duyarlar. Tam tersi şekilde, radyosensitiviteyle ilgili genetik değişkenlere sahip olmayan geniş çoğunluktaki hasta popülasyonu için doz artışı mümkündür ve kanserin iyileşme oranı potansiyel olarak daha fazladır. Ataksi Telenjiektazi Mutasyon Geni ve Klinik Radyosensitivitede Rolü Genetic Predictors Of Adverse Radiotherapy Effects projesinin ilk yılları boyunca ATM geni ve radyosensitiviteyle bağlantısı üzerindeki incelemelere büyük önem verilmiştir ve bu da radyasyona olumsuz yanıtın prediktörleri olarak ele alınan diğer genetik değişkenlerin incelenmesinin önünü açmıştır (87-90). ATM proteini; hücresel stres yanıtı, hücre siklusu kontrol noktası ve DNA onarımı ile bağlantılı protein kinaz olarak işlev görür. Bu fonksiyonların kaybı azalmış DNA onarımı yeterliliğine ve defektif hücre siklusu kontrol noktası kontrolüne neden olabilir. Fonksiyonu olmayan ATM proteini üreten ve bunun sonrasında iyonize edici radyoterapiye yıkıcı yanıtlar veren hastalar arasındaki klinik bağlantı 23 tanımlanmıştır (91,92). Buna ek olarak, ATM’de mutasyon için heterozigoz olan bireylerden elde edilen hücrelerin, Ataksi telenjiektazi teşhisi konan hastalarla ATM taşıyıcısı olmayan hastalarda görülen radyosensitivitenin seviyesinin arasında bir noktada radyosensitiviteye sahip olduğu gözlemlendi (93-98). Klinik radyosensitivitede ATM değişkenlerinin rolünü inceleyen ilk çalışmalarda, meme kanseri hastalarında, ATM mutasyon statüsü ve artmış normal doku hasarı arasında pozitif korelasyon saptanmadı. Fakat, tüm bu çalışmalarda protein truncation test kullanıldı ve bu da sadece protein truncation olayına neden olan genetik değişimleri tespit etmekteydi (99103). Bu raporların ardından, protein truncation’dan ziyade amino asit substitüsyonuyla sonuçlanan yanlış anlam mutasyonunun kanser hastalarında daha yoğun olduğu ve bu yüzden bunların ATM mutasyon durumunu değerlendirmede daha uygun bir DNA alterasyonu türü olduğu konusunda bulgular elde edildi (104-106). İlave Radyosensitiviteye Aday Çalışma Altındaki Genler Artık ATM’nin klinik radyosensitivite ile ilişkili bir gen olduğunu kanıtlayan deliller olmasına rağmen yine de olumsuz radyoterapi yanıtından sorumlu tek gen değişiminin bu olmadığı sanılmaktadır. Artmış radyasyon yanıtıyla bağlantılı olduğu düşünülen ilave radyosensitivite aday genleri TGF-1, XRCC1, XRCC3, SOD2, ve hHR2 genlerini içermektedir. TGF-1 ile kodlanan bir protein ola, hücre büyümesi ve immünsupresif aktivitelerin düzenlenmesinden sorumlu, anahtar konumunda olan bir sitokindir. Bu, ayrıca ekstrasellülerr matriks proteinlerinin çökelmesiyle de ilişkilidir ve radyasyonun sebep olduğu fibroziste önemli rol oynamaktadır. XRCC1 proteininin birincil görevi radyasyon nedeniyle oluşan hasarın tamirinde ana çekip çıkarma görevindeki enzimlerin yönlendirmesini sağlamaktır. Fonksiyonel bir XRCC1 proteininin eksikliğini çeken hücreler radyasyona karşı hiper-sensitivite gösterir. Radyasyon nedenli DNA çift zincir kırıklarının recombinant tamirinde XRCC3 gerekir. SOD2, irradyasyoun indüklediği rektif oksijen türlerine karşı önemli bir hücresel antioksidan koruma görevi gören manganez süperoksit dismutazı tanımlar. hHR21, DNA çift zincir kırıkları ve eş kromotid yapışıklıklarının tamirinde, apoptozda gereken mayadaki rad21 in insan homoloğudur (107). Transforming growth faktör-beta geni: Radyasyon pnömonisi ve fibrozisinde solübl mediatörler ve sitokinler de önemli rol oynamaktadır. Bunlardan en önemlisi TGF-β’dır. TGF-β, lenfosit ve fibroblastları stimüle 24 eder ve yoğun fibronektin, kollagen üretimi ve fibrozis gelişimine yol açar. RT’den 1-14 gün sonra TGF-β gen ekspresyonu artmakta ve RT süresince de persistan olarak yükselmektedir. Ayrıca, RT bitikten sonra yüksek kalmasının radyasyon pnömonisinin prediktörü olabileceği düşünülmektedir. Ancak unutulmamalıdır ki sitokinler aynı zamanda tümörlerden de salgılanabilmektedir (107) Superoksid dismutaz geni: Superoksid dismutaz geni (SOD), süperoksitin hidrojen peroksite dismutasyonunu katalize eden bir metaloenzimdir (108). Süperoksit anyonu nitrik oksit ile reaksiyona girer ve normal durumlarda indirekt olarak vasküler basıncın düzenlenmesinde rol oynar; inflamasyon durumlarında ise toksik nitrojen metabolitlerin oluşmasında yer alır. Böylece, SOD hücre içi ve dışı O2, H2O2 ve nitrojen metabolitlerinin düzenlenmesine katılır (109). Oksijen kullanımı yüksek olan dokularda SOD aktivitesi fazla, buna karşılık hücre dışı sıvılarda SOD aktivitesi çok düşüktür (110). Ökaryotlarda üç çeşit SOD enzimi bulunmaktadır; hücre sitozolünde bulunan bakır ve çinko içeren homodimer, bakır-çinko süperoksitdismutaz (CuZnSOD=SOD1); mitokondride bulunan ve mangan içeren homotetramer mangan süperoksit dismutaz (MnSOD=SOD2); hücre dışında bulunan, bakır ve çinko içeren homotetramer ekstrasellüler süperoksit dismutaz (ECSOD=SOD3) (111). Süperoksit Dismutaz 2 enzimi süperoksit radikalini dismutasyona uğratarak hidrojen perokside ve moleküler oksijene dönüşümünü sağlar. Organizmada, substrat olarak serbest radikal kullanan tek enzim süperoksit dismutazdır. Süperoksit Dismutaz 2, bakteriden insana kadar, bütün aerobik organizmalarda bulunan bir metaloenzimdir (112). Mitokondride bulunan diğer enzimler gibi SOD2 geni tarafından kodlanır. SOD2 geninin transkripsiyonu sonucunda 3 küçük (1 kb) ve bir büyük (4,2 kb) olan mesenger RNA sitozole çıkar (113). Buradaki translasyon sürecinde 222 amino asit içeren SOD2 alt birimi meydana gelir. SOD2’nin translasyon sonrası mitokondri içine girmesi gereklidir. Süperoksit Dismutaz 2’nin süperoksitin hücrelere zarar vermemesi için, çok önemli koruyucu görevi vardır. SOD2 radyasyon vb. aksi koşulardan dolayı oluşan oksidatif strese hücrenin direnmesini sağlayarak hücrenin yaşamasında önemli yer alır (114). SOD2’nin seviyesinde olan değişikliklerin bir çok hastalık ile ilişkisi vardır, bunların arasında Parkinson hastalığı (115), Alzheimer hastalığı (116), yaşlanma (117), ateroskleroz sayılabilir (118). SOD2 aktivitesinin kanserde değişiklik gösterdiği bildirilmiştir (119). Düşük SOD2 aktivitesi 25 birçok değişik tümör tipinde görülmüştür (120). SOD2’nin yüksek seviyede (overekspresyon) olması, meme kanseri, prostat kanseri (121) ve insan glioma hücrelerinde (122) tümör oluşumuna engel olmaktadır. Bunun sonucu olarak SOD2’nin birçok tümör oluşumunda baskılayıcı (süpresor) olduğu tahmin edilmektedir (123,124). Enzimatik analizler kullanılarak insanın SOD2 geninin 6.kromozomda bulunduğu ilk olarak Creagan ve ark. 125) tarafından 1973 aydınlatılmıştır. Süperoksit Dismutaz 2’ın promoter bölgesinde üç özel mutasyonun görülmesi ilgi çekici olmuştur (Şekil 7) (126,127). Şekil 7. Süperoksit Dismutaz 2 enziminin yapısı (a) Homodimer; mavi ve yeşil monomer, aktif bölgedeki mangan kofaktörü pembe küre ile gösterilmiştir. (b) Tek mnomerin pembe Mn kofaktörü ve altı-koordinatlı aktif bölge. N-terminal α-heliks bölgesi lila renkli ve α-heliks yapısı mavi, antiparalel β-kırmalı tabaka yapısı ise sarı olarak gösterilmektedir. (c) Altı-koordinatllı aktif bölgedeki mangan iyonunun ve ona bağlı 4 protein kalıntısının yakından görüntüsü (127). Birçok kanserde, intronik bölgelerde metilasyon ve yüksek AP-2 seviyesinden dolayı SOD2’nin sentezi azalmaktadır (128). Bazı normal dokularda düşük seviyede görülen SOD2’nin sentezi sitokinler (IL-1, IL-4, IL-6, TNF-α), lipopolisakarit ve alkol gibi çok sayıda 26 madde tarafından arttırılmaktadır. Bundan ötürü SOD2’nin stresten sorumlu gen olduğu öne sürülmektedir (129). 27 GEREÇ VE YÖNTEMLER Bu çalışma Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Radyasyon Onkolojisi Anabilim Dalı, Patoloji Anabilim Dalı ve Biyofizik Anabilim Dalı tarafından Trakya Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma Laboratuvarı’nda gerçekleştirildi. Çalışmamız Trakya Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu onayı alınarak gerçekleştirilmiştir. (Ek-1). DENEY PROTOKOLÜ Çalışmada Trakya Üniversitesi Deney Hayvanları Araştırma Laboratuvar’ından temin edilen, başlangıçta ortalama ağırlıkları 200 gr olan 30 adet dişi ve ortalama ağırlıkları 260 gr olan 30 adet erkek olmak üzere toplam 60 adet Wistar Albino cinsi rat kullanıldı. Grupların oluşturulması ve prosedürün uygulanmasının ardından ratlar takibe alındı. Takip sırasında deneklerin hepsi sağ kaldı. Tüm ratların deneyin sonuna kadar 10’arlı gruplar halinde, ortalama %50 nispi nem, 22±1 °C oda sıcaklığında, 12 saat gece ve 12 saat gündüz ışıklı periyodu olan ortamda bakım ve takipleri yapıldı. Ratların tümüne %20 protein içeren yem ve su verildi. Deneyin tamamlandığı gün–sakrifikasyon gerçekleştirildi. Çalışmada 15’er ratlık 4 grup oluşturuldu. Kontrol erkek grubu: Sadece gözlem yapılan erkek ratlardan oluşan deney grubu Kontrol dişi grubu: Sadece gözlem yapılan dişi ratlardan oluşan deney grubu Deney erkek grubu: Radyoterapi uygulanan erkek ratlardan oluşan deney grubu Deney erkek grubu: Radyoterapi uygulanan dişi ratlardan oluşan deney grubu Çalışma süresince kontrol ve radyoterapi gruplarındaki tüm hayvanların genel durum takipleri ve tartımları yapıldı, belirli aralıklarla ağırlıklarının genel ortalaması saptandı. İzlem 28 süresi sonrasında sakrifiye edilen ratlardan alınan akciğer dokusu ve kan örneklerinde DNA izolasyonu sonrası ATM, TGF TGF-1 ve SOD2 geni incelendi. Anestezi Tüm deney boyunca genel anestezi için 50 mg/kg bw ketamin (Ketasol, Richter Farma AG, Avusturya) ve 3.9 mg/kg bw xylazine (Rompun, Bayer Türk Kimya San. Ltd. Şti., Türkiye) kullanıldı. Işınlama Radyoterapi grubundaki hayvanlar anestezileri uygulandıktan sonra mavi köpük üzerine prone pozisyonda sabitlendi (Şekil 8,9). Mecaserto marka Simics model simülatör kullanılarak dişiler için 6x4 cm. boyutlarında erkekler için 6x5 cm boyutlarında akciğer alanları simüle edildi (Şekil 10,11). Simüle edilen ilk ratların alan görüntülenmesi için simülasyon grafisi çekildi. Ratların ön-arka kalınlığı cetvelle ölçülerek dişiler için d=1,5 cm, erkekler için d=1,75 cm. yarı kalınlık saptandı. Çalışmamızın sıfırıncı (0.) gününde kaynakcilt mesafesi 100 cm. olacak şekilde yarı kalınlıkta doz hesaplanarak belirlenen alana Varian Linak Cihazı (lineer akseleratör) ile tek fraksiyonda tüm ratların total –sağ ve sol- akciğerine 10 Gy radyoterapi uygulandı. Şekil 8. Prone pozisyonda simüle edilen dişi rat 29 Şekil 9. Prone pozisyonda dişi rat simülasyon grafisi Şekil 10. Prone pozisyonda simüle edilen erkek rat 30 Şekil 11. Prone pozisyonda erkek rat simülasyon grafisi Sakrifikasyon Radyoterapi uygulanması sonrası 6 hafta izlem sonunda derin anestezi verilen ratlardan kalp kanı alınarak sakrifikasyonları yapıldı. Akciğer dokusu örnekleri alındı. Doku örnekleri histopatolojik inceleme için formolde, moleküler inceleme için de -80 °C’de saklandı. RNA EKSTRAKSİYONU: ATM, SOD ve TGF-1 Genlerine ait hedef gen ekspresyonlarını tespit etmek amacıyla gerekli olan RNA örnekleri BIONEER Marka ExiPrepTM16 Model Tam Otomatik DNA/RNA Ekstraksiyon Cihazı ile elde edildi (130) (Şekil 12). Temel Teknik Özellikler Genomik DNA’dan (Kan, Doku, Hücre, Bakteri, Bitki vb), RNA, Viral DNA/RNA, Plasmid DNA ve Fragment DNA’dan DNA, RNA veya PROTEİN ekstraksiyon yapar. İzolasyon Tipi : Silika manyetik boncuk yöntemi Hızı : 60 dakikada 16 Örnek Pipetleme : Robotik Sterilizasyon Tipi : Ultraviyole 31 Decontaminator : VAR Isıtmalı blok kontrol : 60-90 ºC arasında otomatik Bağlantı ara yüzü : TCP/IP Şekil 12. BIONEER Marka ExiPrepTM16 Model Tam Otomatik DNA/RNA Ekstraksiyon Cihazı (130) DNA veya RNA Uyumlu protokoller: Sıvı numuneler : Kan, Serum, Plazma, İdrar vb. Katı numuneler : Doku (Canlı veya Bitki), Tohum, Yaprak vb. Hücre topluluğu : Bakteri, Mantar, hücre kültürü vb. Plasmid DNA : Virüs, E.Coli vb. Örneklerin RNA izolasyonu için BIONEER Marka ExiPrepTM Tissue Total RNA Kit’i kullanıldı. Ekstraksiyon robotunun 202 Numaralı (Animal Tissue) protokolü seçilerek örneklerin total RNA’ları elde edildi (Tablo 6). 32 Tablo 6. RNA izolasyon protokolü (131) 50 veya 100 µl’lik final hacim içindeki DNA’lar 0,2 ml’lik tüplere pipetlenmiş olarak cihazdan alındı, etiketlendi, saflık ve miktar tayini yapıldıktan ve cDNA’ya sentezlendikten sonra derin dondurucuya kaldırıldı. KALİTE VE KONSANTRASYON TESTİ Elde edilen hasta RNA’larının saflık ve miktar tayinleri Nanodrop Spektrofotometre ile yapıldı. Elde edilen RNA’ların saflık derecesinin uygunluğu ve konsantrasyonların yeterliliği olduğu kayıt altına alındı (Şekil 13). 33 Şekil 13. RNA’ların saflık derecesinin uygunluğu ve konsantrasyonları OLİGO SENTEZİ Dişi, erkek ve kontrol gruplarında; ATM, SOD ve TGF-1 Genlerine hedef gen ekspresyonlarını tespit etmek amacıyla BIONEER Marka Primer setleri (S-1001) kullanıldı. Elde edilen RNA’lar RT-Premix ile cDNA’ya dönüştürülerek DNA gibi Amlifikasyon kontrolü sağlandı (Şekil 13), Real Time polimeraz zincir reaksiyon (PCR) cihazında cDNA’ları çoğaltılması ve miktar tayini yapabilmek için; GreenStar qPCR Master Mix’ler kullanıldı. Primer veya problar, kullanmış oduğumuz Q-PCR cihazının özelliklerine uygun olarak dizayn edildi. Primer setlerinin, % 20-80 oranında Guanin (G) – Sitozin (C) içermesine, özellikle G ile benzer çalışan nükleotitlerden ve probun 5’ ucuna G bazı gelmemesine, seçilen dizide G’den çok C bazı olmasına, melting temperature (Tm) sıcaklığının 65-85 oC arasında olmasına dikkat edildi (Tablo 7). Tablo 7. Gen bölgesini çoğaltmak için kullanılan Primer dizileri Primer Setleri Sekanslar ATM F: TTGCAGATATTTGTAAAAGCTTGG R: CATCATCATCATCTCTCAACGAA SOD F: TGGACAAACCTGAGCCCTAA R: GACCCAAAGTCACGCTTGATA TGF-1 F: CCTGGAAAGGGCTCAACAC R: CAGTTCTTCTCTGTGGAGCTGA 34 Buna göre Q-PCR deneylerimizde GreenStar qPCR Mastr Miks ve primer setleri kullanıldı. Primerin gen bölgelerini arttırıp azaltması SYBER GREEN Boyasının serbest halde DNA üzerine bağlanmasıyla oluşan sinyalin, 6-karboksifloresan filtresi kullanılarak floresan miktarının ölçülmesi prensibine dayanmaktadır. Uygun PCR koşullarında primerin hedef bölge üzerine bağlanması ve uzamasının ardından yeni zincir oluşmaya başlar. DNA zincir sentezi uzadıkça ve her bir döngüde ürün miktarı arttıkça floresan ışıma da ona bağlı olarak artmaya devam eder. Kullanılan primer dizileri uygun ve uyumlu olduğu sürece ilgili gen bölgesi çoğalır, tek bir baz değişikliği bile gen bölgesinin tamamının çoğalmasını engelleyeceği ve sonraki dizinin bölgeyi çoğaltmasına izin vermeyeceği için; aynı diziye sahip olmayan gen bölgelerinde farklı Amplifikasyon eğrileri elde edilecektir (Şekil 14,15). Şekil 15. Amplifikasyon Eğrileri Şekil 15 . Logaritmik Skalada Amplifikasyon Eğrileri 35 MASTER MİKSLER VE Q-PCR KOŞULLARI Kullanmış olduğumuz GreenStar qPCR Master Mix protokolu, 50-100 µl’lik reaksiyon hacmi hazırlamak için 1-100 ng arasında cDNA eklenmesini önermektedir. Ekstraskiyon cihazımızdan elde ettiğimiz RNA miktarları 200 ng’ın üzerinde olduğu için bu çalışmada kullanımı uygundur. Çalışmalarımızda BIONEER Marka AccuPower GreenStar qPCR PreMix kullanıldı. Bu miksler, PCR koşulları için gerekli tüm materyali içerisinde bulundurmakta ve kullanıcı sadece primer ve örnek cDNA’sını ekleyerek kullanılır. 8’li strip tüpler içerisinde hazır olarak gelen bu kitler liyofilize halde derin dondurucularda saklandığı için miadları 1-2 yıldır. Absolute Quantification çalışmasından (Kantitatif Analizlerde) sonra yapılan ekspresyon testi deneylerinde, primerlerin ve örnek cDNA (veya Negatif Kontrol için PCR Grade suyun) hazır reaksiyon tüplerine eklendi, PCR Grade su ile son örnek hacmi 50 µl’ye tamamlanarak çalışıldı. Tüpler Q-PCR chazına yüklenmeden önce, homojenliğin sağlanması için hem vortex hem de spin işlemini programlı şekilde otomatik olarak yapan BIONEER Marka ExiSpin Model Vortex-Mikser kullanıldı. Tablo 8 . Real-Time PCR protokolü (130) 36 Hazırlanan miksler, optik şeffaf filme kaplı 0,2ml’lik PCR tüpleri içerisinde (BIONEER Marka ExiSpin Model Vortex-Mixer cihazı ile homojenliği sağlandıktan sonra) BIONEER Marka ExiCycler96 Model Q-PCR cihazına yerleştirildi. Deneylerin amplifikasyon koşulları, (SyberGreen Master Mix için gerekli sıcaklık, süre ve döngü sayıları) zaten BIONEER (Cihazları, Master Mix’leri ve Primer-Prob’ların üreticisi) tarafından optimize edildiği için çalışmalardan olumlu sonuçlar alındı. Eşik Değerine Göre Amplifikasyon Eğrileri Syber Green yöntemiyle yapılan Q-PCR’ın başlangıcında ortamda tek zincirli cDNA molekülü, primerler ve reaksiyon tampon çözeltisi içinde Syber Green boyası bulunmaktadır. Bağlı olmayan serbest cDNA molekülü tek zincirli olduğu için çok az bir floresan ışıma yapmaktadır. Primerler bağlanıp uzama başladığında ise Syber Green, çift zincirli cDNA’nın arasına girerek floresan yayılımı başlatmaktadır. Başlangıçtaki döngülerde zayıf olan floresan sinyal; oluşan ekspresyona bağlı olarak belirli sayıda çoğaltım sonrasında ilerleyen döngülerde hızla artmaya başlamaktadır. Bu artış miktarı Q-PCR cihazının 2D-CCD kamerasının algılayabildiği miktara ulaştığında Ct (Eşik Değeri) olarak algılanmakta ve analiz yazılımı bu değerleri kullanarak sonuç vermektedir (Şekil 16). Amplifikasyon Eğrisi Ct / Eşik Değeri Şekil 16. Eşik değerine göre amplifikasyon eğrileri STANDART’lar, her bir kopya için Ct (Treshold: İlk algılanma, Eşik değeri) değerleri ile ‘Standart Doğru’ oluşturabilmek için kullanılır (Şekil 17). Yazılım, miktarları yani kopya sayıları arasındaki farkı bilinen standartlar kullanarak bir doğru çizer, örneklerin Ct 37 değerlerini bu doğruya göre kıyaslayarak örneklerin başlangıçtaki kopya sayılarını hesaplar. Hedef miktarı ile kopya sayısı oranı doğru orantılı olduğu için, örnekler ve kontroller arasındaki Amplifikasyon oranı veya kıyası kolaylıklar hesaplanır (Şekil 18,19). 105 104 103 102 Şekil 17. “Standart Doğru” oluşturup örneklerin kopya sayılarını bulabilmek için kullanılan seri dilüsyon Standartları. Şekil 18. Standart Doğru ve Ct değerleri ile Konsantrasyonlar arasındaki ilişki. 38 Şekil 19. Örneklerin Standart Doğruya oranları ile kopya sayılarının bulunması DOKUDAN DNA İZOLASYONU Doku örnekleri 0,1 M sodyum klorür, 0,2 M Sukroz, 0.01 M Etilen diamin tetraasetik asit ve 0,3 M Tris-Hidrojenklörür (pH 8,0) içeren homojenlendirme tamponunda (100 gr/ml) teflon uçlu cam homejinazatör kullanılarak 4 oC’de homojenize edilir ve derişimi % 0.5 olacak şekilde sodyum dosesil sülfat eklenip vortekslendikten sonra 65oC’de 30 dakika inkübe edilir. Örnek üzerine derişimi 1M olacak şekilde potasyum asetat eklenip vortekslendikten sonra 1 saat süreyle 0 oC’de bekletilir. Örnekler 5000 xg’de 10 dakika santrifüjlenir ve DNA içeren üst sıvı steril bir tüpe aktarılarak, 1 hacim kloroform/fenol (1:1) karışımı ile yıkandıktan sonra 1 hacim kloroform ile tekrar yıkanır ve son olarak 5 hacim soğuk etenol ile çöktürülür. Elde edilen DNA çökeleği 350 µl TE tamponu içinde çalkalamalı olarak oda sıcaklığında iki saat süreyle inkübe edilerek DNA’nın çözünmesi sağlanır. Genomik DNA örneklerinin derişimleri ve saflık dereceleri ultraviyole spektrofotometre cihazında 260 ve 280 nm’deki absorbsiyonları okunarak belirlenir. İSTATİSİKSEL ANALİZ Deneklere ait ATM, SOD2 ve TGF-1 değerleri SPSS 17.0 istatistiksel veri analiz sistmine girildi. Değerlerin grup içindeki dağılımları One-way ANOVA (Benfoeroni) testi ile yapıldı. Normal dağılım gösteren parametreler için Student’s T tsti, normal dağılım göstermeyen parametreler için ise Mann-Whitney U testi kullanıldı. p<0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. 39 BULGULAR Çalışmaya dahil edilen deneklerin ağırlıkları ortalama 200-250 gr olarak belirlendi Ataksi Telanjiektazi Mutasyon Geni Çalışmaya katılan deneklerin ATM gen değerleri radyoterapi almayan erkek ratlarda 17431,8+10213,6 bulunurken dişi ratlarda 17077,1+24040,3 olarak bulundu. Kontrol grubundaki ratlarda ATM geni cinsiyetlerine göre karşılaştırıldıklarında anlamlı bir fark bulunmadı (p=0,958) (Tablo 9,10). Çalışmaya katılan erkek ratlarda ATM geni radyoterapi uygulanan ve uygulanmayan kontrol grubu ile kıyaslandığında ise anlamlı derecede azalmıştı. (p=0,008) (Tablo 9,10). Çalışmaya katılan dişi ratlarda ATM geni radyoterapi uygulanan ve uygulanmayan kontrol grubu ile kıyaslandığında, iki grup arasında anlamlı bir fark bulunmadı (p=0,814) (Tablo 9,10). Radyoterapi uygulanan erkek ratlarda 8267,7+7229,2 dişi ratlarda 19315,3+27418,5 olarak saptandı. Radyoterapi alan ratlar cinsiyetlerine göre birbirleri ile karşılaştırıldıklarında erkek ratlarda ATM geni dişi ratlara göre daha düşük bulunmasına rağmen istatistiksel olarak dişi ve erkek ratlar arasında anlamlı bir fark bulunmadı (p=0,143) (Tablo 9,10). Tüm gruplar birbirleri ile karşılaştırıldıklarında erkek ratlarda ATM geni diğer tüm gruplara göre daha düşük bulunmasına rağmen istatistiksel olarak tüm gruplar arasında anlamlı bir fark bulunmadı (p=0,407) (Tablo 9) (Şekil 20). 40 Tablo 9. Çalışmaya katılan deneklerin ataksi telanjiektazi mutasyon değerlerinin karşılaştırılması Erkek Dişi Erkek Radyoterapi alan Dişi Radyoterapi alan Erkek Kontrol Radyoterapi alan Dişi Kontrol p** Kontrol ATM 17431,8+10213,6 17077,1+24040,3 8267,7+7229,2 19315,3+27418,5 8267,7+7229,2 17431,8+10213,6 19315,3+27418,5 17077,1+24040,3 0,407 p* 0,958 0,143 0,008 0,814 ATM: Ataksi Telanjiektazi Mutasyon ANOVA One-Way (Benferroni), * Radyoterapi alan ve kontrol grubundaki ratlar cinsiyetlerine göre karşılaştırıldığında, ** Tüm gruplar karşılaştırıldığında, p<0,05 istatistiksel olarak anlamlı Tablo 10. ATM, SOD2 ve TGF-1 gen değerlerinin karşılaştırılması Radyoterapi alan Kontrol Erkek Dişi Erkek-Dişi ort Erkek-Dişi ort Radyoterapi alan- kontrol ort Radyoterapi alan- kontrol ort ATM SOD2 TGF-1 (8267,7-19315,3) 0,143 (22745,7-6154,0) 0,080 (1023,4-5992,4) 0,025* (17431,8-17077,1) 0,958 (11178,1-12701,4) 0,790 (170,6-170,7) 0,999 (8267,7-17431,8) 0,008* (22745,7-11178,1) 0,271 (1023,4-170,6) 0,064 (19315,3-17077,1) 0,814 (6154,0-12701,4) 0,045* (5992,4-170,7) 0,021* ATM: Ataksi Telanjiektazi Mutasyon, SOD2: Süperoksit Dismutaz 2, TGF-1: Transforme Edici Büyüme Faktörü Beta 1 ANOVA One-Way (Benferroni), *p<0,05 istatistiksel olarak anlamlı 41 ATM: Ataksi Telanjiektazi Mutasyon Şekil 20. Çalışmaya katılan deneklerin ataksi telanjiektazi mutasyon değerlerinin karşılaştırılması Süperoksit Dismutaz 2 Çalışmaya katılan deneklerin SOD2 gen değerleri kontrol grubundaki erkek ratlarda 11178,1+20871,6, dişi ratlarda 12701,4+6817,7 olarak saptandı. Kontrol grubundaki dişi ve erkek ratlarda SOD2 gen değerleri karşılaştırıldığında anlamlı bir fark bulunmadı (p=0,790) (Tablo 10,11). Çalışmaya katılan erkek ratlarda SOD2 geni radyoterapi uygulanan ve uygulanmayan kontrol grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı bir fark bulunmadı (p=0,271) (Tablo 10,11). Çalışmaya katılan dişi ratlarda SOD2 geni radyoterapi uygulanan ve uygulanmayan kontrol grubu ile karşılaştırıldığında radyoterapi alan dişi ratlarda kontrol grubundaki dişi ratlara göre anlamlı derecede azaldığı bulundu (p=0,045) (Tablo 10,11). Radyoterapi alan erkek ratlarda 22745,7+33996,6, dişi ratlarda 6154,0+9968,0 olarak saptandı. Radyoterapi alan erkek ve dişi rat grupları birbirleri ile karşılaştırıldığında ise erkek ratlarda SOD2 gen değerleri dişi ratlara göre daha yüksekti. İki grup arasındaki bu fark istatistiki olarak anlamlılığa ulaşamamış ancak anlamlılığa yakın bir fark tespit edilmiştir. (p=0,080) (Tablo 10,11). Tüm gruplar birbirleri ile karşılaştırıldığında erkek ratlarda SOD2 gen değerleri diğer tüm gruplara göre daha yüksek bulunmasına rağmen istatistiksel olarak tüm gruplar arasında anlamlı bir fark bulunmadı (p=0,184) (Tablo 11) (Şekil 21). 42 Tablo 11. Çalışmaya katılan deneklerin süperoksit dismutaz 2 gen değerlerinin karşılaştırılması Erkek Dişi Erkek Radyoterapi alan Dişi Radyoterapi alan Erkek Kontrol Radyoterapi alan Dişi Kontrol p** Kontrol SOD2 11178,1+20871,6 12701,4+6817,7 22745,7+33996,6 6154,0+9968,0 22745,7+33996,6 11178,1+20871,6 6154,0+9968,0 12701,4+6817,7 0,184 p* 0,790 0,080 0,271 0,045 SOD2: Süperoksit Dismutaz 2 ANOVA One-Way (Benferroni), *Radyoterapi alan ve kontrol grubundaki ratlar cinsiyetlerine göre karşılaştırıldığında, ** Tüm gruplar karşılaştırıldığında, p<0,05 istatistiksel olarak anlamlı SOD2: Süperoksit Dismutaz 2 Şekil 21. Çalışmaya katılan deneklerin süperoksit dismutaz 2 gen değerlerinin karşılaştırılması Transforme Edici Büyüme Faktörü Beta 1 Radyoterapi almayan kontrol gruplarındaki erkek ve dişi ratlarda TGF-1 gen değerleri biribirine benzer idi (170,6-170,7) (p=0,999) (Tablo 10,12). Çalışmaya katılan erkek ratlarda, TGF-1 gen değerleri radyoterapi uygulanan ve uygulanmayan kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, radyoterapi uygulanan erkek ratlarda 43 artma eğilimi göstermiş ancak bu fark istatistiki anlamlılığa ulaşamamıştır. (1023,4-170,6) (p=0,064) (Tablo 10,12). Radyoterapi alan dişi ratlarda TGF-1 gen değerleri kendi kontrol grubu ile karşılaştırıldığında ise istatistiki olarak anlamlı bir artış göstermiştir ( (p=0,021) (Tablo 8,10). Radyoterapi alan erkek ve dişi ratların TGF-1 gen değerleri alan erkek ratlarda 1023,4+1701,2 bulunurken dişi ratlarda 5992,4+7962,2 olarak bulundu. Erkek ve dişi rat grupları karşılaştırıldığında fark oldukça anlamlı olarak tespit edilmiştir (p=0,025) (Tablo 10,12). Tüm gruplar birbirleri ile karşılaştırıldıklarında radyoterapi alan erkek ve dişi ratlarda TGF-1 gen değerleri kontrol grubundaki ratlara göre istatistiksel olarak anlamlı derecede daha yüksek bulundu (p=0,001) (Tablo 12) (Şekil 22). Tablo 12. Çalışmaya katılan deneklerin transforme edici büyüme faktörü beta 1 gen değerlerinin karşılaştırılması Erkek Dişi Erkek Radyoterapi alan Dişi Radyoterapi alan Erkek Kontrol Radyoterapi alan Dişi Kontrol p** Kontrol TGF-1 170,6+190,5 170,7+118,1 1023,4+1701,2 5992,4+7962,2 1023,4+1701,2 170,6+190,5 5992,4+7962,2 170,7+118,1 0,001 p* 0,999 0,025 0.064 0.021 TGF-1: Transforme Edici Büyüme Faktörü Beta 1 ANOVA One-Way (Benferroni), * Radyoterapi alan ve kontrol grubundaki ratlar cinsiyetlerine göre karşılaştırıldığında, ** Tüm gruplar karşılaştırıldığında, * p<0,05 istatistiksel olarak anlamlı 44 TGF-1: Transforme Edici Büyüme Faktörü Beta 1 Şekil 22. Çalışmaya katılan deneklerin transforme edici büyüme faktörü beta 1 gen değerlerinin karşılaştırılması 45 TARTIŞMA Radyoterapi toraks ve çevresinde yerleşimli pek çok tümörün tedavisinde önemli rol oynar. Radyasyon pnömonisi, torasik radyoterapide temel doz sınırlayıcı toksisitedir. Radyasyon pnömonisi genellikle radyoterapiden sonraki 4-12 hafta içinde oluşur ve öksürük, dispne, ateş, halsizlik veya pek çok olguda hipoksi oluşturabilir. Tedaviye rağmen radyasyon pnömonisi ölümcül olabilir. Potansiyel olarak yaşamı tehdit edebilen bu toksisitenin öngörülmesi özellikle toraksa küratif radyoterapi alan hastalar açısından önemlidir (132). Literatürde radyasyon pnömonisi gelişimi için birçok risk faktörü tanımlanmıştır. Bunlar; düşük performans skoru, düşük akciğer kapasitesi, sigara kullanım öyküsü, plasma TGF-β1 seviyelerindeki değişimler, günde bir kez uygulanan radyoterapi fraksiyonasyon şeması, radyoterapiyle eş zamanlı kemoterapi uygulanması, ve her fraksiyonda uygulanan yüksek radyoterapi dozlarıdır (>2,67 Gy) (133-139). Torasik radyoterapinin en çok verilme sebebi olan küçük hücreli dışı akciğer kanserinde kuratif dozlar (60-66Gy) daha kompleks radyoterapi planları ile normal dokuyu maksimum derecede koruyup, sadece tümoral dokuya maksimum dozu verse de halen pnömoni toksisitesi nedeni ile radyoterapi dozları belli bir limitte kalmak zorundadır. Bununla birlikte literatürde, akciğer kanserinde radyoterapiyle birlikte en çok kullanılan kemoterapi ajanlarının sisplatin, karboplatin, paklitaksel, etoposid pnömoni riskini arttırdığı net olarak gösterilememiştir (140-144). Daha modern ajanlar örneğin dosetaksel ve 46 gemsitabin torasik radyoterapiyle eş zamanlı kullanıldığında daha büyük oranlarda pulmoner toksisiteyle ilişkili bulunmuştur (48,145,146). Roach ve ark. (147)’larının yaptığı bir metaanalizde fraksiyon boyutu, radyoterapi dozu ve günlük tedavi radyasyon pnömonisiyle ilişkili bulunmuştur. Benzer şekilde, Yamada ve ark. (148) ile Byhardt ve ark. (149)’ları geniş tedavi sahaları ve radyasyon pnömonisi gelişimi arasında ilişki rapor etmişlerdir. Bazı pre-klinik datalar radyoterapiye bağlı dispne gelişiminde akciğer ve kalp arasında bazı etkileşimler olabileceğini öne sürmüştür. Sıçanlarda torasik radyoterapi sonrası solunum hız ve fonksiyonu, ışınlanan akciğer ve kalp volümüyle ilişkili bulunmuştur (150-152). İnsan akciğerinin ışınlanmasından sonraki histopatolojik değişikliklerle ilgili mevcut veriler sınırlıdır, çünkü hastaların akciğer radyoterapisi sonrası diagnostik torakotomiye gitmesi olası değildir ve bu amaçla otopsiler nadiren yapılır. Mevcut veriler daha çok hayvan modellerinden elde edilmektedir. Radyoterapi sonrası genlerin ekspresyonundaki kalitatif ve kantitatif değişiklikler ışınlanan hücreler tarafından büyük miktarda sitokin ve büyüme faktörlerinin aşırı üretimine yol açar ve bu otokrin ve parakrin bir yolda rol oynar. Sonuç olarak bu fark edilir histopatolojik değişikliklere ve klinik sendromlara yol açar (153,154). Yeni yayınlanan bir rapor, gen ekspresyonundaki bu değişikliklerin artan transkripsiyondan çok artan mesajcı RNA translasyonunun bir sonucu olduğunu öne sürmüştür (155). İyonizan radyasyonun neden olduğu, büyüme faktörleri ve adezyon moleküllerinin direkt indüksiyonu ile sitokin overekspresyonu aşaması muhtemelen radyasyon pnömopatisinin sonraki kaskadlarını başlatan ilk olaydır. Radyoterapiye bağlı toksisite değerlendirmelerinde kullanılan gen paneli “Genetic Predictors of Adverse Radiotherapy Effects (Gene-PARE)” adı altında toplanmaktadır. Bu genler; ATM, TGF-1, XRCC1, XRCC3, SOD2 ve hHR21’dir (156-160). Gene-PARE paneli gelecekte radyasyon onkologlarının kişiye özgü tedavi kararını verirken kullanabileceği ek bir parametre olabilir (161). Bu konuda yapılacak prospektif klinik çalışmalar Gene-PARE panelinin rutine geçişini sağlayacaktır. Bilal (162)’in çalışmasında kullandığı gen panelindeki; K-ras, H-ras protoonkogenleri ve p53 tümör baskılayıcı geninin incelenmesi sonucunda erkek ve dişi radyoterapi ve kontrol grupları arasında fark gözlenmediğini bildirmişlerdir. Aynı şekilde erkek ve dişi radyoterapi grupları arasında da bu gen paneli açısından da bir farkın bulunmadığını, radyoterapiye bağlı 47 akut akciğer toksisitesini saptamanın incelemiş olduğu K-ras, H-ras ve p53 gen paneli ile mümkün olmadığını bildirmiştir. Kanser tedavisinde cinsiyet farkı literatürün son yıllardaki araştırma konusu olmaktadır. Gerek prospektif gerek retrospektif klinik çalışmalarda tedavi etkinliği ölçülürken, tedavilere yanıtta ve yan etkilerin oluşmasında cinsiyet farkının etkisi olup olmadığı ek bir faktör olarak incelenmektedir. Bu konuda literatür taraması yapıldığında serilerin daha çok kolorektal kanser üzerinde yoğunlaştığını görmekteyiz (163-166) Literatürde Kaminski ve ark. (163)’larının rektal kanser tedavisindeki yan etkileri cinsiyet farkını gözeterek incelemeleri sonucunda, kadın cinsiyeti daha toksik bulmaları önemli ve dikkat çekici olmuştur. Akciğer kanserinde ise cinsiyet farkı incelendiğinde, bilgi epidemiyolojiden öteye gidememektedir. Halbuki akciğer kanserinin son 50 yılda kadın cinsiyetinde görülme oranı sigara kullanımının artışıyla birlikte artmakta ve bugün ABD istatistiklerine göre kanserden ölümlerin 1/4’ünü oluşturmaktadır (167). Bilal (162)’in yapmış olduğu çalışmada radyoterapiye bağlı akciğer toksisitesinde cinsiyet farkının etkisinin olup olmadığını genetik ve immünohistokimyasal olarak tespit etmek istemişler ve bu amaçla genetik marker olarak H-ras, K-ras, p53 gen mutasyonlarını kullanmışlar. Fakat cinsiyet farkının bir etkisinin olmadığını bildirmişlerdir. Bu açıdan bakıldığında akciğer kanserinde cinsiyet farkıyla ilgili daha çok ve kapsamlı çalışmalara ihtiyaç vardır. Literatürde bu bilgi çok sınırlıdır. Bizim çalışmamızda da Bilal (162)’in çalışmasına benzer şekilde radyoterapiye bağlı akciğer toksisitesinde cinsiyet farkının etkisinin olup olmadığını radyoterapinin olumsuz etkilerinin göstergesi olan genetik prediktör faktörlerden ATM, TGF-1 ve SOD2’yi inceledik. Bu amaçla her biri kendi kontrol grubunu barındıran erkek ve dişi ratların akciğerine 10 Gy radyoterapi uyguladık. İncelediğimiz genetik prediktörlerden ATM proteini; hücresel stres yanıtı, hücre siklusu kontrol noktası ve DNA onarımı ile bağlantılı protein kinaz olarak işlev görür.Atm geninin overekspresyonu ATM proteininin artışına neden olmakta,ATM proteini de ptrotein kinaz gibi işlev görmektedir. Bu proteinin azlığı ise DNA onarım yetersizliğine ve defektif hücre siklusuna neden olmaktadır. Çalışmamızda elde ettiğimiz bulguları değerlendirdiğimizde radyoterapi almayan erkek ve dişi ratlarda ATM gen miktarı açısından bir fark bulunmadı. Radyoterapi uygulandıktan ve altı hafta takip edildikten sonra ratlarda erkek grupta ATM gen miktarı anlamlı derecede azalmıştı (p=0,008). Dişi ratlarda ise radyoterapi almak, ATM gen miktarında bir miktar artışa sebep olmuş ama anlamlı derecede değiştirmemiştir. 48 Çalışmamızdan elde ettiğimiz önemli sonuç; radyoterapiden hasar görmüş hücredeki DNA onarım mekanizmasını aktive eden ATM geni erkek cinsiyette azalarak radyoterapinin DNA hasarından korunma yeteneğini kaybetmiştir. Dişiler ise bu yeteneği korumaya devam ettirmiştir. Hatta radyoterapi almayan dişilerle kıyaslandığında bir miktar artış göstermiştir (17077,1-19315,3). Radyoterapi uygulanmış dişi ve erkek ratlar birbiri ile kıyaslandığında (19315,38267,7) ATM gen miktarı farklı bulunmuş ancak istatiksel anlamlılığa kavuşturulamamıştır (p=0,143). Her ne kadar istatistiksel anlamlılığa ulaştırılamamış olsa bile ATM gen miktarındaki cinsiyetler arası bu fark önemlidir ve bundan sonra yapılacak gerek deneysel gerek klinik çalışmalarda tekrar tekrar bakılarak değerlendirilmelidir. Süperoksit Dismutaz 2, radyasyonun indüklediği reaktif oksijen türlerine karşı önemli hücresel antioksidan koruma görevi gören mangan süperoksit dismutazı tanımlar. Mangan süperoksid dismutazın stresten sorumlu gen olduğu öne sürülmektedir. Çalışmamızda SOD2 gen miktarı radyoterapi almayan kontol grubundaki erkek ve dişilerde benzer miktarda bulunmuştur (11178,1-12701,4). Radyoterapi uygulamasından altı hafta sonrasında akciğer dokusundaki SOD2 miktarı erkek ratlarda artma eğilimi göstermiştir. Erkek ratlardaki SOD2 genindeki bu artış anlamlı bulunmamıştır (p=0,271). Dişi ratlarda ise radyoterapi uygulaması ile SOD2 gen miktarı azalmıştır (12701,4-6154). Radyoterapi alan dişi ratlar kendi kontrol grubu ile kıyaslandığında istatiksel olarak anlamlıdır (p=0,045). Süperoksit Dismutaz 2 geninin erkek akciğer dokusunda radyoterapi ile artışı, strese neden olan radyoterapi hasarının ortaya çıkışı ile açıklanabilir. Dişi akciğer dokusunda ise erkek akciğer dokusunun tersine radyoterapi almak, SOD2 genini azaltmıştır. Erkek ve dişi SOD2 gen miktarı kıyaslandığında, bu farkın istatistiki anlamlılığa yakın bulunması (p=0,08) dişi akciğer dokusunun kendini koruyabildiğinin bir kanıtı olabilir. Bu sonuç ATM geninde elde ettiğimiz sonucu da desteklemektedir. Çünkü erkek akciğer dokusu radyoterapinin indüklediği ATM proteinini dişi ratlar gibi koruyamamış aksine azalarak stres ile başbaşa kalmıştır. Erkek ratlardaki SOD2 miktarının yüksekliği de bu stres ile başbaşa kalışının bir kanıtı olmuştur. İncelediğimiz diğer bir radyoterapi sensitivite geni olan TGF-1’deki değişimler ise şöyle olmuştur: TGF-1 proteini radyasyona bağlı hücresel cevapta ve radyasyona bağlı fibrozisin oluşumundan sorumludur. Bu proteinin az yapımı ya da genin mutasyona uğramasından dolayı düzgün yapılamaması radyoterapiye bağlı normal doku hasarını artırmaktadır. 49 Bizim çalışma sonuçlarımızda da radyoterapi alan erkek akciğer dokusunda TGF-1 yapımı artmıştır. Ancak bu dişi akciğer dokusundaki TGF-1 seviyesine göre yetersiz kalmıştır. Dişi akciğer dokusu hem radyoterapi almayan dişi akciğer dokusuna kıyasla oldukça anlamlı yükselmiş (p=0,021), hem de erkek akciğer dokusundaki TGF-1 gen seviyesinde de istatistiki anlamlılığa ulaşacak şekilde daha yüksek seviyelere yükselmiştir (p=0,064). TGF-1 geninin overekspresyonu ve buna bağlı TGF-1 protein artışı radyoterapi hasarına karşı dişi akciğer dokusunu daha fazla koruyabilmiştir. İncelediğimiz ATM, SOD2 ve TGF-1 gen seviyeleri birlikte değerlendirildiğinde; hücrenin radyasyon hasarından korunmasına işaret eden ATM ve TGF-1 değerlerine baktığımızda, radyoterapi alan dişi akciğer dokusunda erkek akciğer dokusuna göre TGF-1 geni istatistiki olarak anlamlı olarak yükselmiş, ATM ise her ne kadar istatistiki anlamlılığa ulaşmamış ise de artma eğilimi oluşturmuştur. Radyoterapiye ait stresin bir göstergesi olan SOD2 geni ise bu sonuçları destekleyecek şekilde dişide daha düşük, erkek akciğer dokusunda ise daha yüksek bulunmuştur. Yani dişi akciğer dokusu radyoterapi stresine karşı TGF-1 ve ATM genlerini yükselterek hücre DNA’sını kurayabilmiş ve radyoterapiye ait stresi ortadan kaldırdığı için SOD2 gen seviyesinde artış meydana gelmesine gerek kalmamıştır. Sonuç olarak dişi ratların akciğer dokusu radyoterapi hasarına karşı kendini erkek ratlara göre daha iyi koruyabilmiştir. Çalışmamızın sonuçları bu yüzden dikkat çekicidir. Ancak bu bilgiyi kronik radyoterapi hasarını gösteren üçüncü ay ve altıncı ay sonuçları ile kıyaslama ve değişimleri bu süreçlerde de izleme gerekliliği doğmuştur. Bundan sonraki hedefimiz, kronik akciğer dokusunda inceleyeceğimiz bu üç gendeki değişimleri tespit etmek olacaktır. 50 SONUÇLAR Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Radyasyon Onkolojisi Anabilim Dalı’nda radyoterapiye bağlı gelişen akut akciğer toksisitesinin oluşumunda cinsiyet farkının etkisinin olup olmadığını perditör olarak ATM, TGF-1ve SOD2 panelini kullanarak değerlendirmeyi amaçladığımız çalışmamızda; 1- ATM, TGF-1 ve SOD2 genin incelenmesi sonucunda erkek ve dişi radyoterapi alan grup ve kontrol grubu arasında fark gözlenmedi. Aynı şekilde erkek ve dişi radyoterapi grupları arasında ATM ve SOD2 gen panelleri açısından da bir fark bulunmaz iken radyoterapi alan erkek ve dişi ratlarda TGF-1değerleri radyoterapi almayan erkek ve dişi ratlara göre anlamlı derecede yüksek bulundu. 2- Radyoterapiye bağlı akut akciğer toksisitesini saptamak için TGF-1’in etkili olduğunu, fakat cinsiyet ayrımında hiçbir gen paneli ile mümkün olmamıştır. 3- Sonuçta çalışmamızda cinsiyet farklılığının radyoterapiye bağlı akut akciğer toksisitesinde etkisinin olmadığı saptandı. Bu konuda yeni çalışmaların yapılması gerekliliği sonucuna varılmıştır. 51 ÖZET Radyasyona bağlı akciğer hasarı toraks ve etrafındaki farklı birçok tümör için uygulanan radyoterapi sonrası gözlenen, iyi bilinen bir yan etkidir. Tipik olarak iki farklı ve birbirini takip eden klinik faz olarak ortaya çıkar: pnömoni ve fibrozis. Radyoterapinin tamamlanmasından 4-12 hafta sonra görülür ve klinik olarak sessiz gidişli olabileceği gibi bazı hastalarda öksürük, dispne, ateş ve göğüs ağrısı görülebilir. Çalışmamızda ratlarda radyoterapiye bağlı akut akciğer toksisitesi üzerine cinsiyet farkının etkisinin olup olmadığının değerlendirmesi amaçlandı. Denekler kontrol erkek, kontrol dişi, radyoterapi erkek ve radyoterapi dişi olarak gruplandırıldı. Radyoterapi gruplarında ratların akciğerinin totaline tek fraksiyonda 10 Gy radyoterapi uygulandı. Kontrol gruplarına radyoterapi uygulanmadı. İzlem süresi sonrasında sakrifiye edilen ratlardan alınan akciğer dokusu ve kan örneklerinde DNA izolasyonu sonrası, ataksi telenjiektazi mutasyon, transforme edici büyüme faktörü-β1 ve süperoksit dismutaz 2 geni incelendi. Gen panelindeki; ataksi telenjiektazi mutasyon, transforme edici büyüme faktörü-β1 ve süperoksit dismutaz 2 genin incelenmesi sonucunda erkek ve dişi radyoterapi ve kontrol grupları arasında fark gözlenmedi. Aynı şekilde erkek ve dişi radyoterapi grupları arasında ataksi telenjiektazi mutasyon ve süperoksit dismutaz 2 gen panelleri açısından da bir fark bulunmaz iken radyoterapi alan erkek ve dişi ratlarda transforme edici büyüme faktörü-β1 değerleri radyoterapi almayan erkek ve dişi ratlara göre anlamlı derecede yüksek bulundu. Sonuçta radyoterapiye bağlı akut akciğer toksisitesini saptamak için transforme edici büyüme 52 faktörü-β1 geninin etkili olduğunu, fakat cinsiyet ayrımında hiçbir gen paneli ile mümkün olmamıştır. Çalışmamızda cinsiyet farklılığının radyoterapiye bağlı akut akciğer toksisitesinde etkisinin olmadığı saptandı. Bu konuda yeni çalışmaların yapılması gerekliliği sonucuna varılmıştır. Anahtar kelimeler: Radyoterapiye bağlı akut akciğer toksisitesi, pnömoni, genetik prediktörler 53 SUMMARY GENDER DIFFERENCE OF THE RADIATION DUE TO ACUTE PULMONARY TOXICITY THE EFFECTS OF GENETIC PREDICTOR ATM, TGF1 AND SOD2 INVESTIGATION Radiation lung injury is a well-known side effect after radiotherapy for different tumors in and around the thorax. Typically presents with two distinct, subsequent clinical phases: pneumonitis and fibrosis. It occurs 4–12 weeks after RT completion and can be clinically silent, although some patients may experience cough, dyspnea, fever, and chest discomfort. In our study it was aimed whether gender difference has an effect on acute lung toxicity in rats dependent on radiotherapy or not. Test subjects were grouped as control male, control female, radiotherapy male, radiotherapy female. In radiotherapy groups it was applied 10 Gy radiotherapy to right and left lungs of rats per fraction. Radiotherapy was not applied to control groups. After the observation period, ATM, TFG-1 and SOD2 gene was examined after DNA isolation in blood samples and lung tissues taken from the sacrificed rats. Gen panel of the, ATM, TGF-1, and SOD2 gene by examining radiation therapy and control groups did not differ between male and female. In the same way between the groups of male and female radiotherapy ATM and SOD2 gene was not found a difference in terms of panels in male and female rats receiving radiotherapy radiotherapy TGFΒ1 values are not significantly higher 54 than that found in male and female rats. As a result of acute pulmonary toxicity due to radiotherapy is effective for detecting TFG-1 'in, but it has not been possible by sex, with no gene panel. In our study it was detected gender difference has no effect in acute lung toxicity dependent on radiotherapy. It was concluded new studies must be carried out in this field. Key words: Radiotherapy induced acute lung toxicity, pneumonitis, genetic predictors 55 KAYNAKLAR 1. Sener G, Atasoy BM, Ersoy Y, Arbak S, Sengöz M, Yeğen BC. Melatonin protects against ionizing radiation induced oxidative damage in corpus cavernosum and urinary bladder in rats. J Pineal Res 2004;37:241-6. 2. Perez CA, Brady LW. Principles and practice of radiation oncology. 4th ed. Philadelphia: Lippincott Co; 2004. p.2-75. 3. Cox JD, Ang KK. Radiation oncology rational, technique, results. 8th ed. St Louis: Mosby; 2003. p.1-62. 4. Arıncı K, Elhan A. Anatomi. 3. baskı. Ankara: Güneş Kitabevi Ltd. Şti, 2001;307-9. 5. Tortora GJ, Grabowski SR. Principals of anatomy and physiology. 9th ed. New York: Chichester Wiley; 2000. p.1-24. 6. Nohl-Oser HC. An investigation of the anatomy of the lymphatic drainage of the lungs as shown by the lymphatic spread of bronchial carcinoma. Ann R Coll Surg Engl 1972;51(3):157-76. 7. Guyton AC. (Çeviri: H. Çavuşoğlu, B. Çağlayan Yeğen, Z. Aydın, İ. Alican). Tıbbi Fizyoloji. 10. baskı. İstanbul: Yüce Yayınları; 2001. s.432-43. 8. Hall EJ. Radiobiology for the radiologist. 5th ed. Philadelphia: Lippincott Co; 2000. p.515. 9. Özalpan A. Temel radyobiyoloji. 1. basım. İstanbul: Haliç Üniversitesi Yayınları; 2001. p.1-218. 10. Sener G, Jahovic N, Tosun O, Atasoy BM, Yeğen BC. Melatonin ameliorates ionizing radiation induced oxidative organ damage in rats. Life Scie 2003;74(5):563-72. 56 11. Radford IR. Evidence for a general relationship between the induced level of DNA double-strand breakage and cell-killing after x-irradiation of mammalian cells. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med 1986;49(4):611-20. 12. Elkind MM, Utton HE. X-ray damage and recovery in mammalian cells in culture. Nature 1959;184:1293-5. 13. Little JB, Hahn GM, Frindel E, Tubiana M. Repair of potentially lethal radiation damage in vitro and in vivo. Radiology 1973;106(3):689-94. 14. Kinsella TJ, Dobson PP, Mitchell JB, Fornace AJ Jr. Enhancement of x ray induced DNA damage by pre-treatment with halogenated pyrimidine analogs. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1987;13(5):733-9. 15. Wang Y, Pantelias GE, Iliakis G. Mechanism of radiosensitization by halogenated pyrimidines: the contribution of excess DNA and chromosome damage in BrdU radiosensitization may be minimal in plateau phase cells. Int J Radiat Biol 1994;66(2):133-42. 16. Terasima T, Tolmach LJ. Variations in survival responses of HeLa cells to x- irradiation during the division cycle. Biophys J 1963;3:11-33. 17. Choy H, Rodriguez FF, Koester S, Hilsenbeck S, Von Hoff DD. Investigation of Taxol as potential radiation sensitizer. Cancer 1993;71(11):3774-8. 18. Tishler RB, Geard CR, Hall EJ, Schiff PB. Taxol sensitizes human astrocyroma cells to radiation. Cancer Res 1992;52:3495-7. 19. Perez CA, Brady LW, Halperin EC. Principles and Practice of Radiation Oncology, 5th Ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins; 2008. p.1-700. 20. Emami B, Lyman J, Brown A, Coia L, Goitein M, Munzenrider JE, et al. Tolerance of normal tissue to therapeutic irradiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1991;21(1):10922. 21. Abid SH, Malhotra V, Perry MC. Radiation-induced and chemotherapy-induced pulmonary injury. Curr Opin Oncol 2001;13:242-8. 22. McDonald S, Rubin P, Philips TL, Marks LB. Injury to the lung from cancer therapy: clinical syndromes, measurable endpoints, and potential scoring systems. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1995;31(5):1187-203. 23. Vujaskovic Z, Marks LB, Anscher MS. The physical parameters and molecular events associated with radiation-induced lung toxicity. Semin Radiat Oncol 2000;10(4):296307. 24. Chen L, Brizel DM, Rabbani ZN, Samulski TV, Farrell CL, Larrier N, et al. The protective effect of recombinant human keratinocyte growth factor on radiation-induced 57 pulmonary toxicity in rats. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2004;60(5):1520-9. 25. Rubin P, Johnston CJ, Williams JP, McDonald S, Finkelstein JN. A perpetual cascade of cytokines postirradiation leads to pulmonary fibrosis. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1995;33(1):99-109. 26. Topuz E, Aydıner A. Akciğer kanseri. Topuz E, Aydıner A, Karadeniz AN, (Editörler). Klinik onkoloji’de. İstanbul: İ. Ü. Onkoloji Enstitüsü Yayınları; 2000. s. 82-9. 27. Kayıhan E, Özyardımcı N. Akciğer Kanserleri Tanı ve Tedavide Temel İlkeler ve Uygulamalar (1. Basım). İstanbul Avrupa Tıp Kitapçılık Ltd. Şti; 2001.1-201. 28. Coggle JE, Lambert EB, Moores SR. Radiation effects in the lung. Environ Health Perspect 1986;70:261-91. 29. Perez CA, Brady LW, Halperin EC. Principles and Practice of Radiation Oncology, 5th Ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins; 2008. p.701-2106. 30. Tsujino K, Hirota S, Endo M, Obayashi K, Kotani Y, Satuchi M. Predictive value of dose-volume histogram parameters for predicting radiation pneumonitis after concurrent chemoradiation for lung cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2003;55:110-5. 31. Lind PA, Marks LB, Hollis D, Fan M, Zhou SM, Munley MT, et al. Receiver operating characteristic curves to assess predictors of radiation-induced symptomatic lung injury. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2002;54:340-7. 32. Kasten-Pisula U, Tastan H, Dikomey E. Huge differences in cellular radiosensitivity due to only very small variations in double-strand break repair capacity. Int J Radiat Biol 2005; 81:409-19. 33. Kong FM, Anscher MS, Sporn TA, Washington MK, Clough R, Barcellos-Hoff MH, et al. Loss of heterozygosity at the mannose 6-phosphate insulin-like growth factor 2 receptor (M6P/IGF2R) locus predisposes patients to radiation- induced lung injury. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2001;49:35-41. 34. Rubin P, Casseratt GW. Clinical radiation pathology. 3rd ed. Vol. 1. Philadelphia: WB Saunders; 1968. p.423-70. 35. Morgan GW, Breit SN. Radiation and the lung: A reevaluation of the mechanisms mediating pulmonary injury. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1995;31:361-9. 36. Gross TJ, Hunninghake GW. Idiopathic pulmonary fibrosis. N Engl J Med 2001;345:517-25. 37. Colloy TV, Yousem SA. Lungs. In: Stenberg SS (Ed.). Histology for pathologists. 1st ed. New York: Raven Press; 1992. p.479-81. 38. Rubin P, Siemann DW, Shapiro DL, Finkelstein JN, Penny DP. Surfactant release as an early measure of radiation pneumonitis. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1983;9:1669-73. 58 39. McDonald S, Rubin P, Phillips TL, Marks LB. Injury to the lung from cancer therapy: Clinical syndromes, measurable endpoints, and potential scoring systems. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1995;31:1187-203. 40. Rosai J. Acute pulmonary injury and interstitial pneumonia. In: Rosia J. Ackerman’s surgical pathology. Vol. 1, 8th ed. New York: Mosby; 1996. p. 358-9. 41. Gross NJ. Experimental radiation pneumonitis: IV. Leakage of circulatory proteins onto the alveolar surface. J Lab Clin Med 1980;95:19-31. 42. Abdollahi A, Li M, Ping G, Plathow C, Domhan S, Kiessling F, et al. Inhibition of platelet derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. J Exp Med 2005;201:925-35. 43. Travis EL, Hanley RA, Fenn JO, Klobukowski CJ, Hargrove HB. Pathologic changes in the lung following single and multifraction radiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1977;2:475-90. 44. Kapanci Y, Ribaux C, Chaponnier C, Gabbiani G. Cytoskeletal features of alveolar myofibroblasts and pericytes in normal human and rat lung. J Histochem Cytochem 1992;40:1955-63. 45. Roberts CR, Walker DC, Schellenberg RR. Extracellular matrix. Clin Allergy Immunol 2002;16:143-78. 46. Rubin P, Johnston CJ, Williams JP, McDonald S, Finkelstein JN. A perpetual cascade of cytokines postirradiation leads to pulmonary fibrosis. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1995;33:99-109. 47. Mah K, Van Dyk J, Keane T, Poon PY. Acute radiation-induced pulmonary damage: A clinical study on the response to fractionated radiation therapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1987;13:179-88. 48. Mehta V. Radiation pneumonitis and pulmonary fibrosis in nonsmall- cell lung cancer: Pulmonary function, prediction, and prevention. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2005;63:5-24. 49. Marks LB, Yu X, Vujaskovic Z, Small W Jr, Folz R, Anscher MS. Radiation-induced lung injury. Semin Radiother Oncol 2003;13:333-45. 50. Hara R, Itami J, Komiyama T,Katoh D, Kondo T. Serum levels of KL-6 for predicting the occurrence of radiation pneumonitis after stereotactic radiotherapy for lung tumors. Chest 2004;125:340-4. 51. Faria SL, Aslani M, Tafazoli MS, Souhami L, Freeman CR. The challenge of scoring radiation-induced lung toxicity. 2009;21(5):371-5. 59 52. Patel AB, Edelman MJ, Kwok Y, Krasna MJ, Suntharalingam M. Predictors of acute esophagitis in patients with nonsmallcell lung carcinoma treated with concurrent chemotherapy and hyperfractionated radiotherapy followed by surgery. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2004;60(4):1106-12. 53. Ng AK, Mauch PM. Late Effects of Hodgkin’s Disease and Its Treatment. Cancer J 2009;15:164-8. 54. Schallenkamp JM, Miller RC, Brinkmann DH, Foote T, Garces YI. Incidence of radiation pneumonitis after thoracic irradiation: Dose-volume correlates. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2007; 67(2):410-6. 55. Sekine I, Sumi M, Ito Y, Nokihara H, Yamamoto N, Kunitoh H, et al. Retrospective analysis of steroid therapy for radiation-induced lung injury in lung cancer patients. Radiother Oncol 2006; 80: 93-7. 56. Wagner H. Resectable non-small cell lung cancer in the medically inoperable patient: Curative management with radiation therapy and stereotactic radioablation. In: Pass IH, Carbone DP, Minna JD, Johnson DH, Turrisi AT (Eds). Lung Cancer Principles and Practice. 3rd ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins; 2005: 534-44. 57. Bensadoun RJ, Schubert MM, Lalla RV, Keefe D. Amifostine in the management of radiation-induced and chemo-induced mucositis. Support Care Cancer 2006; 14(6): 56672. 58. Anscher MS, Vujaskovic Z. Mechanisms and potential targets for prevention and treatment of normal tissue injury after radiation therapy. Semin Oncol 2005;32:86-91. 59. McBride WH, Chiang CS, Olson JL, Wang CC, Hong JH, Pajonk F, et al. A sense of danger from radiation. Radiat Res 2004;162:1-19. 60. Stone HB, Coleman CN, Anscher MS, McBride WH. Effects of radiation on normal tissue: Consequences and mechanisms. Lancet Oncol 2003;4(9):529-36. 61. Denham JW, Hauer-Jensen M. The radiotherapeutic injury a complex ‘wound.’ Radiother Oncol 2002;63(2):129-45. 62. Hall EJ. Do no harm-normal tissue effects. Acta Oncol 2001;40:913-6. 63. Bentzen SM, Overgaard J. Patient-to-patient variability in the expression of radiationinduced normal tissue injury. Semin Radiat Oncol 1994;4:68-80. 64. Jackson A, Kutcher GJ, Yorke ED. Probability of radiationinduced complications for normal tissues with parallel architecture subject to non-uniform irradiation. Med Phys 1993;20:613-25. 65. Tucker SL, Turesson I, Thames HD. Evidence for individual differences in the radiosensitivity of human skin. Eur J Cancer 1992;28:1783-91. 60 66. Fernet M, Hall J. Genetic biomarkers of therapeutic radiation sensitivity. DNA Repair 2004;3:1237-43. 67. Baumann M, Holscher T, Begg AC. Towards genetic prediction of radiation responses: ESTRO’s GENEPI project. Radiother Oncol 2003;69:121-5. 68. Andreassen CN, Alsner J, Overgaard J. Does variability in normal tissue reactions after radiotherapy have a genetic basis-where and how to look for it? Radiother Oncol 2002; 64:131-40. 69. Andreassen CN. Can risk of radiotherapy-induced normal tissue complications be predicted from genetic profiles? Acta Oncol 2005;44:801-15. 70. Jones IM, Thomas CB, Xi T, Nelson DO , Mohrenweiser HW . The genetic basis for variation in radiation sensitivity in the general population. Radiat Res 2005;163(6):7001. 71. Bourguignon MH, Gisone PA, Perez MR, Michelin S, Dubner D, Giorgio MD, et al. Genetic and epigenetic features in radiation sensitivity. Part II: implications for clinical practice and radiation protection. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2005;32:351-68. 72. Safwat A, Bentzen SM, Turesson I, Hendry JH. Deterministic rather than stochastic factors explain most of the variation in the expression of skin telangiectasia after radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2002;52(1):198-204. 73. Tucker SL, Geara FB, Peters LJ, Brock WA. How much could the radiotherapy dose be altered for individual patients based on a predictive assay of normal-tissue radiosensitivity? Radiother Oncol 1996;38(2):103-13. 74. Turesson I, Joiner MC. Clinical evidence of hypersensitivity to low doses in radiotherapy. Radiother Oncol 1996;40:1-3. 75. Fletcher GH. Regaud lecture perspectives on the history of radiotherapy. Radiother Oncol 1988;12:253-71. 76. Mackay RI, Hendry JH. The modelled benefits of individualizing radiotherapy patients’ dose using cellular radiosensitivity assays with inherent variability. Radiother Oncol 1999;50:67-75. 77. Dubray B, Pavy JJ, Giraud P, Danhier S, Cosset JM. Predictive tests of response to radiotherapy. Assessment and perspectives in 1997. Cancer Radiother 1997;1(5):47383. 78. Twardella D, Chang-Claude J. Studies on radiosensitivity from an epidemiological point of view-overview of methods and results. Radiother Oncol 2002;62(3):249-60. 79. Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, Ma C , Lossos IS , Rosenwald A, et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature 61 2000;403(6769):503-11. 80. Pomeroy SL, Tamayo P, Gaasenbeek M, Sturla LM, Angelo M, McLaughlin ME. Prediction of central nervous system embryonal tumour outcome based on gene expression. Nature 2002;415(6870):436-42. 81. van’t Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, He YD, Hart AA, Mao M. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 2002;415(6871):530-6. 82. Torres-Roca JF, Eschrich S, Zhao H, Bloom G , Sung J , McCarthy S, et al. Prediction of radiation sensitivity using a gene expression classifier. Cancer Res 2005;65(16):7169-76. 83. Sotiriou C, Lothaire P, Dequanter D, Cardoso F , Awada A. Molecular profiling of head and neck tumors. Curr Opin Oncol 2004;16(3):211-14. 84. Lonning PE, Sorlie T, Borresen-Dale AL. Genomics in breast cancer-therapeutic implications. Nat Clin Pract Oncol 2005;2:26-33. 85. Quarmby S, West C, Magee B, Stewart A, Hunter R, Kumar S. Differential expression of cytokine genes in fibroblasts derived from skin biopsies of patients who developed minimal or severe normal tissue damage after radiotherapy. Radiat Res 2002;157:243-8. 86. Ismail SM, Buchholz TA, Story M, Brock WA, Stevens CW. Radiosensitivity is predicted by DNA end-binding complex density, but not by nuclear levels of band components. Radiother Oncol 2004;72:325-32. 87. Shiloh Y. ATM and related protein kinases: Safeguarding genome integrity. Nat Rev Cancer 2003;3:155-68. 88. Savitsky K, Bar-Shira A, Gilad S, Rotman G, Ziv Y, Vanagaite L, et al. A single ataxia telangiectasia gene with a product similar to PI-3 kinase. Science 1995;268(5218):174953. 89. Lavin MF, Birrell G, Chen P, Kozlov S , Scott S , Gueven N. ATM signaling and genomic stability in response to DNA damage. Mutat Res2005;569:123-32. 90. McKinnon PJ. ATM and ataxia telangiectasia. EMBO Rep 2004;5:772-6. 91. Gotoff SP, Amirmokri E, Liebner EJ. Ataxia telangiectasia. Neoplasia, untoward response to x-irradiation, and tuberoussclerosis. Am J Dis Child 1967;114:617-25. 92. Morgan JL, Holcomb TM, Morrissey RW. Radiation reaction in ataxia telangiectasia. Am J Dis Child 1968;116:557-8. 93. Pandita TK, Hittelman WN. Increased initial levels of chromosome damage and heterogeneous chromosome repair in ataxia telangiectasia heterozygote cells. Mutat Res 1994;310: 1-13. 94. Parshad R, Sanford KK, Jones GM, Tarone RE. G2 chromosomal radiosensitivity of 62 ataxia-telangiectasia heterozygotes. Cancer Genet Cytogenet 1985;14:163-8. 95. Shiloh Y, Parshad R, Sanford KK, Jones GM. Carrier detection in ataxia-telangiectasia. Lancet 1986;1:689-90. 96. Sanford KK, Parshad R, Price FM, Rosen B, Bradley L, Fan I, et al. Enhanced chromatid damage in blood lymphocytes after G2 phase x irradiation, a marker of the ataxia-telangiectasia gene. J Natl Cancer Inst 1990;82:1050-4. 97. Paterson MC, MacFarlane SJ, Gentner NE, Smith BP. Cellular hypersensitivity to chronic gamma-radiation in cultured fibroblasts from ataxia-telangiectasia heterozygotes. Kroc Found Ser 1985;19:73-87. 98. Weeks DE, Paterson MC, Lange K, Andrais B, Davis RC, Yoder F, et al. Assessment of chronic gamma radiosensitivity as an in vitro assay for heterozygote identification of ataxia-telangiectasia. Radiat Res 1991;128:90-9. 99. Appleby JM, Barber JB, Levine E, Varley JM, Taylor AM, Stankovic T, et al. Absence of mutations in the ATM gene in breast cancer patients with severe responses to radiotherapy. Br J Cancer 1997;76:1546-9. 100.Ramsay J, Birrell G, Lavin M. Testing for mutations of the ataxia telangiectasia gene in radiosensitive breast cancer patients. Radiother Oncol 1998;47:125-8. 101.Clarke RA, Goozee GR, Birrell G, Fang ZM, Hasnain H, Lavin M,et al. Absence of ATM truncations in patients with severe acute radiation reactions. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1998;41:1021-7. 102.Oppitz U, Bernthaler U, Schindler D, Sobeck A, Hoehn H, Platzer M, et al. Sequence analysis of the ATM gene in 20 patients with RTOG grade 3 or 4 acute and/or late tissue radiation side effects. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1999;44:981-8. 103.Weissberg JB, Huang DD, Swift M. Radiosensitivity of normal tissues in ataxiatelangiectasia heterozygotes. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1998;42:1133-6. 104.Concannon P, Gatti RA. Diversity of ATM gene mutations detected in patients with ataxia-telangiectasia. Hum Mutat 1997;10:100-7. 105.Gilad S, Khosravi R, Shkedy D, Uziel T, Ziv Y, Savitsky K, et al. Predominance of null mutations in ataxia-telangiectasia. Hum Mol Genet 1996;5:433-9. 106.Telatar M, Teraoka S, Wang Z, Chun HH, Liang T, Castellvi-Bel S, et al. Ataxiatelangiectasia: identification and detection of founder-effect mutations in the ATM gene in ethnic populations. Am J Hum Genet 1998;62:86-97. 107.Wall RJ, Schnapp LM. Radiation pneumonitis. Respiratory Care 2006; 51: 1255-60. 108.McCord JM, Fridovich I. Superoxide dismutase: an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem 1969;244:6049-55. 63 109.Oury TD, Ho YS, Piantados CA, Crapo JD. Extracellular superoxide dismutase, nitric oxide, and central nervous system O2 toxicity. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:97159. 110.Uysal M. Serbest radikaller ve oksidatif stres. Gürdöl F, Ademoğlu E. ˝Biyokimya˝. Nobel Tıp Kitabevleri. (2006). 111.Zelko IN, Mariani TJ, Folz RJ. Superoxide dismutase multigene family: a comparasion of the CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2), and ECSOD (SOD3) gene, structures, evolution and expression. Free Radic Biol Med. 2002;33(3):337-49. 112.Barra D, Schinina ME, Simmaco M, Bannister JV, Bannister WH, Rotilio G, et al. The primary structure of human liver manganese superoxide dismutase. J Biol Chem. 1984;259(20):12595-601. 113.Church SL. Manganese superoxide dimutase: nucleotide and deduced amino acid sequence of a cDNA encoding a new human transcript. Biochim Biophys Acta. 1990;1087(2):250-2. 114.Epperly MW, Defilippi S, Sikora C, Gretton J, Greenberger JS. Radioprotection of lung esophagus by overexpression of the human manganese superoxide dismutase transgene. Mil Med. 2002;167(2):71-3. 115.Kushleika J, Checkoway H, Woods JS, Moon JD, Smith-Weller T, Franklin GM, et al. Selegiline and lymphocyte superoxide dismutase activites in Parkinson’s disease. Ann Neurol. 1996;39(3):378-81. 116.Marcus DL, Strafaci JA, Freedman ML. Differential neuronal expression of manganese superoxide dismutase in Alzheimer’s disease. Med Sci Monit. 2006;12(1):BR8-14. 117.Wallace DC. A mitochondrial paradigm for degenerative disease and ageing. Novartis Found Symp. 2001;235:247-63; 118.Gottlieb MG, Schwanke CH, Santos AF, Jobim PF, Müssel DP, da Cruz IB. Association among oxidized LDL levels, MnSOD, apolipoprotein E polymorphisms and cardiovascular risk factors in a South Brazilian region population. Genet Mol Res. 2005;4(4):691-703. 119.Oberley TD. Oxidative damage and cancer. Am J Pathol. 2002;160(2):403-8. 120.Oberley LW, Buettner GR. Role of superoxide dismutase in cancer. Cancer Res. 1979;39(4):1141-9. 121.Duan H, Zhang HJ, Yang JQ, Oberley LW, Futscher BW, Domann FE. MnSOD upregulates maspin tumor supressor gene expression in human breast and prostate cancer cells. Antioxid Redox Signal. 2003;5(5):677-88. 64 122.Zhong W, Oberley LW, Oberley TD, St Clair DK. Suppresion of the malignant phenotype of human glioma cells by overexpression of manganese superoxide dismutase. Oncogene. 1997;14(4):481-90. 123.Li JJ, Oberley LW, St Clair DK, Ridnour LA, Oberley TD. Phenotypic changes induced in human breast cancer cells by overexpression of manganese-containing superoxide dismutase. Oncogene. 1995;10(10):1989-2000. 124.Oberley LW. Mechanism of the tumor suppressive effect of MnSOD overexpression. Biomed Pharmacother. 2005;59(4):143-8. 125.Creagan R, Tischfield J, Ricciuti F, Ruddle FH. Chromosome assignments of genes in man using mouse-human somatic cell hybrids: mitochondrial superoxide dismutase (indophenol oxidase-B, tetrameric) to chromosome 6. Humangenetik. 1973;20(3):203-9. 126.Xu Y, Krishnan A, Wan XS, Majima H, Yeh CC, Ludewig G, et al. Mutations in the promoter reveal a cause for the reduced expression of the human manganese superoxide dismutase gene in cancer cells. Oncogene. 1999;18(1):93-102. 127.Borgstahl GE, Parge HE, Hickey MJ, Johnson MJ, Boissinot M, Hallewell RA, et al. Human mitochondrial manganese superoxide dismutase polymorphic variant Ile58Thr reduces activity by destabilizing the tetrameric interface. Biochemistry. 1996;35(14):4287-97. 128.Xu Y, Porntadavity S, St Clair DK. Transcriptional regulation of the human manganese superoxide dismutase gene: the role of specificity protein (Sp1) and activating protein-2 (AP-2). Biochem J. 2002;362(Pt 2):401-12. 129.St Clair DK. Manganese superoxide dismutase: genetic variation and regulation. J Nutr. 2004;134(11):3190S-3191S. 130.Bioneer Inc. ExiPrepTM 16, Fully Automated DNA/RNA/Protein Purification System. Alameda, USA. http://us.bioneer.com/pdf/brochure/2011/brochureExiPrep%2016Plus.pdf. Erişim Tarihi: 12/09/2012. 131.SchmittgenTD, Livak KJ, Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols 2008;3:1101-8. 132.Bradley J, Graham MV, Winter K, Purdy JA, Komaki R, Roa WH, et al. Toxicity and outcome results of RTOG 9311: A phase I-II dose-escalation study using three dimensional conformal radiotherapy in patients with inoperable non-small-cell lung carcinoma. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2005;61:318-28. 133.Monson JM, Stark P, Reilly JJ, Sugarbeker DJ, Strauss GM, Swanson SJ, et al. Clinical radiation pneumonitis and radiographic changes after thoracic radiation therapy for lung carcinoma. Cancer 1998;82:842-50. 134.Anscher MS, Murase T, Prescott DM, Marks LB, Reisenbichler H, Bentel GC, et al. 65 Changes in plasma TGF beta levels during pulmonary radiotherapy as a predictor of the risk of developing radiation pneumonitis. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1994;30:671-6. 135.Segawa Y, Takigawa N, Kataoka M, Takata I, Fujimoto N, Ueoka H. Risk factors for development of radiation pneumonitis following radiation therapy with or without chemotherapy for lung cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1997;39:91-8. 136.Mah K, Keane TJ, Dyk JV, Braban LE, Poon PY, Hao Y. Quantitative effect of combined chemotherapy and fractionated radiotherapy on the incidence of radiationinduced lung damage: A prospective clinical study. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1994;28:563-74. 137.Roach M 3rd, Gandara DR, Yuo HS, Swift PS, Kroll S, Shieve DC, et al. Radiation pneumonitis following combined modality therapy for lung cancer: Analysis of prognostic factors. J Clin Oncol 1995;13:2606- 12. 138.Dillman RO, Seagren SL, Propert KJ, Guerra J, Eaton WL Jr, Perry MC, et al. A randomized trial of induction chemotherapy plus high-dose radiation versus radiation alone in stage 3 non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 1990;323:940-5. 139.Dillman RO, Herndon J, Seagren SL, Eaton WL Jr, Gren MR. Improved survival in stage 3 non-small-cell lung cancer: seven-year follow-up of Cancer and Leukemia Group B (CALGB) 8433 trial. J Natl Cancer Inst 1996;88:1210-5. 140.Graham MV, Purdy JA, Emami B, Harms W, Bosch W, Lockett MA, et al. Clinical dose-volume histogram analysis for pneumonitis after 3D treatment for non-small cell lung cancer (NSCLC). Int J Radiat Oncol Biol Phys 1999;45:323-9. 141.Hope AJ, Lindsay PE, El Naqa I, Alaly JR, Vicic M, Bradley JD, et al. Modeling radiation pneumonitis risk with clinical, dosimetric, and spatial parameters. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2006;65:112-24. 142.Robnett TJ, Machtay M, Vines EF, McKenna MG, Algazy KM, Bradley JD, et al. Factors predicting severe radiation pneumonitis in patients receiving definitive chemoradiation for lung cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2000;48:89-94. 143.Hernando ML, Marks LB, Bentel GC, Zhou SM, Hollis D, Das SK, et al. Radiationinduced pulmonary toxicity: A dose-volume histogram analysis in 201 patients with lung cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2001;51:650-9. 144.Kong FM, Ten Haken R, Eisbruch A, Lawrence TS. Non-small cell lung cancer therapy-related pulmonary toxicity: An update on radiation pneumonitis and fibrosis. Semin Oncol 2005;32:42-54. 145.Movsas B, Raffin TA, Epstein AH, Link CJ Jr. Pulmonary radiation injury. Chest 1997;111:1061-76. 146.Onishi H, Kuriyama K, Yamaguchi M, Komiyama T, Tanaka S, Araki T, et al. Concurrent two dimensional radiotherapy and weekly docetaxel in the treatment of 66 stage III non-small cell lung cancer: A good local response but no good survival due to radiation pneumonitis. Lung Cancer 2003;40:79-84. 147.Roach M III, Gandara DR, Yuo HS, Swift PS, Kroll S, Shrieve DC, et al. Radiation pneumonitis following combined modality therapy for lung cancer: Analysis of prognostic factors. J Clin Oncol 1995;13:2606-12. 148.Yamada M, Kudoh S, Hirata K, Nakajima T, Yoshikawa J. Risk factors of pneumonitis following chemoradiotherapy for lung cancer. Eur J Cancer 1998;34:71-5. 149.Byhardt RW, Martin L, Pajak TF, Shin KH, Emami B, Cox JD. The influence of field size and other treatment factors on pulmonary toxicity following hyperfractionated irradiation for inoperable non-small cell lung cancer (NSCLC)-Analysis of a Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) protocol. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1993;27:53744. 150.Novakova-Jiresova A, van Luijk P, van Goor H, Kampinga HH, Coppes RP. Pulmonary radiation injury: Identification of risk factors associated with regional hypersensitivity. Cancer Res 2005;65:3568-76. 151.Van Luijk P, Novakova-Jiresova A, Faber H, Schippers JM, Kampinga HH, Meertens H, et al. Radiation damage to the heart enhances early radiation induced lung function loss. Cancer Res 2005;65:6509-11. 152.Wiegman EM, Meertens H, Konings AWT, Kampinga HH, Coppes RP. Loco-regional differences in pulmonary function and density after partial rat lung irradiation. Radiother Oncol 2003;69:11-9. 153.Boerma M, van der Wees CG, Vrieling H, Svensson JP, Wondergem J, van der Laarse A, et al. Microarray analysis of gene expression profiles of cardiac myocytes and fibroblasts after mechanical stress, ionising or ultraviolet radiation. BMC Genomics 2005;6:6. 154.Christiansen H, Batusic D, Saile B, Hermann RM, Dudas J, Rave M, et al. Identification of genes responsive to gamma radiation in rat hepatocytes and rat liver by cDNA array gene expression analysis. Radiat Res 2006;165:318-25. 155.Lu X, de la Pena L, Barker C, Camphausen K, Tofilon PJ. Radiation-induced changes in gene expression involve recruitment of existing messenger RNAs to and away from polysomes. Cancer Res 2006;66:1052-61. 156.Anscher MS, Vujaskovic Z. Mechanisms and potential targets for prevention and treatment of normal tissue injury after radiation therapy. Semin Oncol 2005;32:86-91. 157.McBride WH, Chiang CS, Olson JL, Wang CC, Hong JH, Pajonk F, et al. A sense of danger from radiation. Radiat Res 2004;162:1-19. 158.Stone HB, Coleman CN, Anscher MS, McBride WH. Effects of radiation on normal tissue: Consequences and mechanisms. Lancet Oncol 2003;4:529-36. 67 159.Denham JW, Hauer-Jensen M. The radiotherapeutic injury a complex ‘wound.’ Radiother Oncol 2002;63:129-45. 160.Hall EJ. Do no harm-normal tissue effects. Acta Oncol 2001;40:913-6. 161.Alice Y. Ho, David P. Atencio, Sheila P, Stock RG, Formenti SC, Ceserati JA, et al. Genetic Predictors of Adverse Radiotherapy Effects: The Gene-PARE Project. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2006 Jul 1;65(3):646-55. 162.Bilal BÜ. Dişi erkek ratlar arasındaki cinsiyet farkının radyoterapiye bağlı akut akciğer toksisitesi üzerine etkisinin polimeraz zincir reaksiyonu ve immünohistokimyasal yöntemlerle araştırılması. (Tıpta Uzmanlık Tezi). Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi, 2011. 163.Kaminski A, Joseph D, Elsaleh H. Differences in toxicity across gender in patients treated with chemoradiation for rectal cancer. Australas Radiol 2007;51:283-8. 164.Sloan JA, Goldberg RM, Sargent DJ, Vargas-Chanes D, Nair S, Cha SS, et al. Women experience greater toxicity with fluorouracil-based chemotherapy for colorectal cancer. J Clin Oncol 2002;20:1491-8. 165.Elsaleh H, Joseph D, Grieu F, Zeps N, Spry N, Iacopetta B. Association of tumour site and sex with survival benefit from adjuvant chemotherapy in colorectal cancer. Lancet 2000;355:1745-50. 166.Pahlman L, Glimelius B. Pre or postoperative radiotherapy in rectal and rectosigmoid carcinoma. Report from a randomized multicenter trial. Ann Surg 1990;211:187-95. 167.Donington JS, Colson YL. Sex and gender differences in non-small cell lung cancer Semin Thorac Cardiovasc Surg. 2011;23(2):137-45. 68
