Moleküler Tanı

Moleküler Tanı
yöntemleri ve
uygulamaları
Prof. Dr. Fatma Savran
Oğuz
50 years since four of its scientists were awarded Nobel prizes —
Max Perutz, John Kendrew, James Watson and Francis Crick.
Nobel success: What makes a great lab?
William Bynum
Nature 490, 31–32 (04 October 2012)
Canlılar hücrelerin özelliklerine
göre iki gruba ayrılırlar:
• Ökaryotik hücreler;
- Kromozomlar
çekirdek zarı ile
çevrilidir.
- İnsan haploid genomu:
3x109 baz çiftinden
meydana gelir.
• Prokaryotik hücreler
- Tek kromozom hücre
içinde bulunur
- E. Coli’de
• 1971’de rekombinant DNA teknolojilerinin
başlangıcı
• Enzim; bakteri suşundan izole edilmiş
• Viral DNA ‘yı kırmak için kullanılmış
• Restriksiyon enzimi ile kesilmiş DNA
Biyoteknoloji
• Rekombinant DNA teknolojisi, özellikle
gen organizasyonu ve gen ifadesinin
kontrolü ile ilgili temel araştırmalara
yardımcı olması için geliştirilmiş olmasına
rağmen....
• bilim adamları bu teknolojinin ticari,
olanaklarını da gözardı etmemişlerdir.
Biyoteknoloji rekombinant DNA
teknolojisinin doğal sonucudur
• İlerleyen yıllar…
• Bu teknoloji günlük hayatın bir parçası olmuş......
-hormonlar
-pıhtılaşma faktörleri
-herbisitlere dirençli bitkiler
-yiyeceklerin korunmasını sağlayan enzimler
-aşılar
Hormonlar-İnsülin hormonu
İnsan Genleri Moleküler
Seviyede haritalanabilir.
• Sorumlu olan genlerin haritalanması ilk
hasta bireylerde bozuk olan gen ürünlerinin
belirlenmesi ile başlamıştır.
• Bu bilgi sayesinde genin kromozom
üzerindeki
yerleşimi
kolayca
belirlenmektedir.
Genin Haritalanması
• Bir genin haritalanmasının, önce hastalığın
fenotipi ile bağlantılı olan bir genetik
belirleyicinin (marker) tanımlamasıyla
mümkün olduğu görülmektedir.
Genetik belirleyici (marker)
olarak RFLPler
• İnsan genomu boyunca (özellikle kodlayıcı
olmayan bölgelerde), her 200 nükleotite 1 dizi
farklılığı görülür.
• Bu özel bölgelerdeki nükleotit değişiklikleri;
-tek bir nükleotit çiftindeki değişiklik
-tek bir nükleotit çiftinin çıkarılması (delesyon)
-araya bir nükleotitin sokulması
şeklinde olabilir.
Restriksiyon enzimi
Restriksiyon enzimi
• Genetik hastalıkların bir ailede
nesilden nesile geçişini takip etmek
amacıyla belirleyici-marker olarak
kullanılırlar
Restriksiyon enzimi
• Restriksiyon enzim kesimleri ile oluşturulan
bu parça uzunluklarındaki farklılıklar,
restriksiyon parça uzunluk polymorfizmleri
(restriction fragment-length polymorphisms
RFLPs)
Rekombinant DNA
• 1971’de rekombinant DNA teknolojilerinin
başlangıcı
• Enzim; bakteri suşundan izole edilmiş
• Viral DNA ‘yı kırmak için kullanılmış
• Restriksiyon enzimi ile kesilmiş DNA
Restriksiyon enzimi
• Kesim noktasını ortadan kaldırabilir ya da
yeni bir kesim noktası yaratabilir.
• Bu restriksiyon bölgesi bir kromozomda
bulunur diğer homolog kromozomda
bulunmazsa, bu iki kromozom, restriksiyon
parçalarının
membrana
aktarılan
profillerinin analizi ile birbirinden ayırt
edilebilir.
Bi – Allelik bölge polimorfizmi ( RFLP )
1
2
,
= Restriksiyon Enzim Bölgesi
= Prob
Minisatellitler ve VNTR’lar
• Minisatellitler; 2 ila 100 nükleotit
uzunluğundaki DNA bölgeleridir.
Örneğin;
GGAAGGGAAGGGAAGGGAAG
baz
dizisi, beş nükleotitlik GGAAG dizisinin
dört kez tekrarından oluşmuştur.
• Bunun gibi diziler insan genomunda yaygın
olarak bulunur.
Minisatellitler ve VNTR’lar
• Her tekrardaki nükleotit sayısı 14’ten-100
nükleotite kadar değişebilir ve her bölge
tekrar sayısı 2 ila 100’den fazla sayıda
olabilir. Bu bölgeler, değişken sayıdaki
ardışık tekrarlar (variable- number of
tandem repeats repeats, VNTR)
AA
AB
BB
AA
AB
BB
A
*
B
Probe
A
B
Probe
Mikrosatellit ( STR ) tekrar polimorfizmleri
CACACACACACACACACACACA
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
11 CA Tekrarları
CACACACACACACA
GTGTGTGTGTGTGT
7 CA Tekrarları
Primerler ile PCR amplifikasyonu
DNA parmak izi (DNA fingerprinting)
• İnsan genomundaki ikinci tip farklılıklar;
- Tekrarlayan DNA dizi bölgelerinin
uzunlukları arasındaki değişkenlikler olarak
bulunmuştur.
- İnsan DNA’sındaki bu polimorfizm,
bireylere özgü moleküler profiller oluşur ve
DNA parmak izi denilen tekniğin temelini
teşkil ederler.
DNA parmak izi
• DNA sekans analizi çalışmaları bu
lokusların her bir kişide farklı sayıda tekrar
ünitesinden oluştuğunu göstermiştir.
• Mendel kalıtım kurallarına uygun aktarılır.
DNA parmak izi (DNA fingerprinting)
• 1988 yılından itibaren ABD’de suç
davalarında delil olarak kullanılmaktadır.
• Göçmen sorunları
• Babalık davaları vb.çok geniş bir uygulama
alanı vardır.
• Standart adli testlerde detaylı bir DNA
parmak izi profili elde etmek için, VNTR
veya STR probları kullanılır.
Sitogenetik ve Moleküler Sitogenetik Tanı
Yöntemleri
I. Sitogenetik Tanı Yöntemleri
1. Klasik Sitogenetik Tanı Yöntemleri
2. Özelleşmiş Sitogenetik Tanı
yöntemleri
a. Kardeş kromatid değişimi
(Sister Chromatid Exchange= SCE)
b. Mikronükleus (MN)
c. Frajil bölge tayini
II. Moleküler Sitogenetik Tanı Yöntemleri
Örnekler:
Floresans in situ hibridizasyon
(FISH)
Multicolor-FISH
Multiplex-FISH (M-FISH)
2. Moleküler Genetik Tanı Yöntemleri :
Örnekler
I. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR)
II. Allel-özgü oligonükleotid analizi (Allelespecific oligonucleotid= ASO)
III. DNA dizi Analizi
IV. Mikroarray Analizi
Kromozomlar
• Her insan
kromozomunda tek ve
devamlı bir DNA çift
sarmalı bulunmaktadır.
Nükleustaki her
kromozom, uzun doğrusal
bir çift sarmal DNA
molekülüdür.
Kromozomlar  mitotik/mayotik metafaz
Spontan olarak bölünen
dokularda
Kültürde bölünmeleri için
uyarılan hücrelerde
Hücre- doku kültürü
• Spontan olarak bölünme hızı düşük olan
hücreler için
• Kısa süreli kültür (24-72, bazen 96 saat)
Örn: Kemik iliği, kan …
• Uzun süreli kültür (1-3 hafta)
Örn: Amniyon sıvısı, deri ve diğer
dokular ...
Mitozu uyaranlar
Mitojenler : EBV(Epstein Bar Virus),
Pokeweed mitojen (PWM),
Phorbol ester (TPA)
Pytohemagglutinin :
insan periferik kan kültüründeki olgun
lenfositleri uyararak bölünmeye teşvik
eder.
Sitogenetik
Prob
• Tek yada çift zincirli moleküller olarak
hazırlanır.
• Hibridizasyon reaksiyonlarında tek zincir
halinde bulunur.
• Radyoaktif yada kimyasal olarak hazırlanan
polinükleotitlerdir.
FISH yönteminin sitogenetik amaçlı
kullanımı
• Belirli bir DNA dizisinin hücrede kaç kopya
halinde olduğunun belirlenmesi
• Lokusa özgü problar ile delesyon,
insersiyon,dublikasyon ve inversiyon gibi yapısal
anomalilerin saptanması
• İnterfaz hücrelerde de kromozom analizi
yapabilme olanağı sunması
• Farklı işaretlenmiş probların bir arada kullanılması
FLORESAN IN SITU HİBRİDİZASYON
İŞLEM AKIŞI
Örneğin hazırlanması
Örnek DNA’sının prob DNA’sına hibridizasyonu
Örneğin değerlendirilmesi
FISH
www.nature.com/.../
v1/n1/full/nprot.2006.41.html
Polimeraz zincir reaksiyonu
• 1986 yılında polimeraz zincir reaksiyonu
(PCR)
• DNA klonlamasını kolaylaştırarak konakçı
hücrenin kulanıldığı klonlamanın yerini
almıştır.
PCR
• Özgül hedef DNA dizilerinn doğrudan çoğaltılmasına
dayanır.
• Çok az miktarda DNA bile yeterlidir.
• Hedef DNA’nın nükleotit dizisini bilmek gerekir.
• Bu bilgiler tek zincirli hale getirilmiş olan DNA’ya
bağlanacak olan iki oligonükleotit primerin sentezi için
kullanılır.
• Isıya dayanıklı bir DNA polimeraz çalışılan DNA’daki
hedef bölgenin sentezini sağlar.
PCR’a dayalı metodlar
PCR: Çok az miktarlarda dahi alıcı ve verici hücrelerini
saptayabilir.
• Radyoaktif veya enzim işaretli problar ile hibridizasyon
• PCR amplifikasyonu, agaroz veya polyakrilamid jel
elektroforez
• Floresans işaretli primerler ile PCR ve kapiller elektroforez
Human Genome Projesi
• 1999 yılında ABD’de Ulusal Sağlık
Enstitüsü ile Ulusal Enerji Bölümünün ortak
bir projesi olarak başlamıştır.
• Fransa, ingiltere ve Japonya
• İnsan Genom Organizasyonu (HUGO)
tarafından koordine edilen benzer projelere
başlamıştır.
Human Genome Projesi
• Temeli rekombinant DNA teknolojilerine
dayanmaktadır.
• Genomun tüm bölgelerinin yerleri ve
nükleotit dizileri tanımlanarak genomik
haritalar oluşturulmuştur.
• 2001 yılında baz dizilim çalışmalar
taamlanmıştır
Human Genome Projesi
• 23 kromozomda 30.000 gen (3.2 milyar
base çifti)
• %99.9 (ırk, cins vb.) nükleotit dizisi aynı
- Genetik testler
- Gen terapi
Moleküler Diagnostik testler
•
•
•
•
Tek gen bozukluklarının
Multifaktöryel bozuklukların
Bazı kanser türlerinin
Enfeksiyöz hastalıkların
tespit edilmesinde
kullanılmaktadır
Moleküler Diagnostik testler
• DNA analizi hastalıkla ilgili gen haritası
ortaya çıkarılmış ve belirlenmişse
yapılabilir.
• Gen belirlenememişse linkage analizi
yapılabilir.
• Gen klonlanmış ve mutasyon belirlenmiş ise
mutasyon analizi yapılabilir.
Moleküler Diagnostik testler
• Direk mutasyon analizi;
- hastalık taşıyıcılarının belirlenmesini
- Fetal risk değerlendirilmesini sağlar.