Slayt 1

3/6/2016
• Ürün saflaştırma prosesleri
GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ
Saflaştırma prosesi
Saflaştırma prosesi seçilirken dikkate alınması
gereken kriterler
• Fermentasyon ürünlerinin saflaştırılması oldukça
masraflı bir süreçtir.
• Amaç, en az maliyetle en yüksek kalitedeki ürünün
mümkün olan en kısa sürede elde edilmesidir.
• Doğal olarak seçilen proses ve bunun ürün
maliyetine etkisi istenilen son ürüne bağlıdır.
• Bir fermentasyon prosesi sonunda ortam sıvısı içinde
ürün düşük konsantrasyonlardadır ve ürünle birlikte
ortamda m.olar, hücre parçaları, çözünmüş ve
çözünmemiş ortam bileşenleri ile birlikte diğer
metabolik ürünler bulunur
Bütün bu
faktörler
saflaştırma
prosesini
zorlaştıran
etkenlerdir
•
•
•
•
•
•
•
•
Ürünün hücre içi veya hücre dışı oluşu
Ürünün fermentasyon sonundaki konsantrasyonu
Ürünün fiziksel ve kimyasal özellikleri
Ürünün kullanım alanı
Kabul edilebilir en düşük saflık oranı
Ürünün toksisitesi
Fermentasyon sırasında ortamda bulunan safsızlıklar
Ürünün fiyatı
• Öte yandan ürün hücre içi bir metabolit de olabilir.
3
• Ürün saflaştırmada ilk adım büyük katı
parçaların, çöktürme, santrifüj veya filtrasyon
yolu ile ortamdan uzaklaştırılmasıdır
• İkinci adım, elde edilen sıvının ultrafiltrasyon,
ters osmoz, kromatografi yöntemleri, sıvı-sıvı
ekstraksiyonu, çöktürme yolu ile
bölümlenmesidir.
• Son adımda ise daha hassas kromatografik
yöntemler veya kristalizasyon teknikleri
kullanılarak yüksek saflıkta ürün elde edilir.
4
Çöktürme
• Çöktürme ürün saflaştırmanın çeşitli
evrelerinde kullanılan bir yöntemdir.
• Tek bir adımda hem zenginleştirme hem de
konsantre etmesi bakımından oldukça
kullanışlı bir yöntemdir.
• Çöktürme için kullanılan kimyasallar arasında
asitler ve bazlar, tuzlar, organik çözücüler vb
yer almaktadır.
5
6
1
3/6/2016
• Santrifüj
Santrifüjleme
(seperasyon)
• Kesikli ve sürekli olmak üzere iki tipte uygulanabilen santrifüj işleminde kesikli
uygulamanın kapasitesi oldukça düşüktür ve endüstriyel uygulamalar için
uygun değildir.
• Endüstriyel uygulamalarda sürekli sistemler kullanılır (seperatorler)
• Hem farklı yoğunluktaki maddeleri hem de katı ve sıvıları birbirinden ayırmak
için kullanılabilirler.
Çözeltideki partiküllerin uygulanan merkezkaç
kuvvetin etkisiyle çeperlere veya tabanlara
oturtulması esasına dayanır.
M.o’lar ve benzer büyüklükte diğer partiküller,
filtrasyonla iyi sonuç alınamadığında santrifüj
yardımı ile ortamdan ayrılabilirler.
Santrifüj filtrasyon ile birleştirildiğinde pahalı
bir seçenek olsa da, filtrasyonun zor
gerçekleştiği, filtrasyonu kolaylaştıracak
kimyasalların kullanılamadığı ve yüksek saflıkta
ayırmanın gerektiği durumlarda zorunlu bir
seçenektir.
8
Hücre parçalama
Eğer istenilen ürün hücre dışına salınmıyorsa, m.o’nın
hücre duvarının parçalanarak ürünün dışarı alınması
gerekmektedir.
Bu amaçla bazı hücre parçalama yöntemleri
geliştirilmiştir.
Bu yöntemlerin sahip olması gereken en önemli özellik,
elde edilmesi istenilen ürüne zarar vermeyecek şekilde
olmasıdır. Endüstriyel amaçlarla kullanılan yöntemler
1) fiziko-kimyasal yöntemler: dondurma-çözündürme,
ultrasonikasyon gibi yöntemleri içerir
2) Kimyasal yöntemler: deterjanlar, alkali kimyasallar ve
enzim uygulamalarından yararlanılır
Genellikle amilaz, proteaz ve lipaz enzimleri kullanılır.
• Filtrasyon
• Filtrasyon tüm ölçeklerde süspansiyon
parçacıkları uzaklaştırmak için en çok
yöntemlerden biridir.
halindeki
kullanılan
• Filtrasyon farklı koşullarda gerçekleştirilebilir
• Uygun yöntemin seçimini filtrat özellikleri, katı
parçacıkların boyutları, katı/sıvı oranı, katı fazın mı sıvı
fazın mı toplanması gerektiği, prosesin boyutu,
filtrasyonun kesikli mi sürekli mi olacağı, steril şartlara
olan ihtiyaç, filtrasyon sırasında vakuma gerek olup
olmadığı gibi faktörler belirler.
9
10
11
12
2
3/6/2016
• Kromatografi
• Düşük konsantrasyonlarda ürün elde edilen
proseslerde fiziksel ayırmanın ardından ürün
saflaştırmanın en önemli basamağı
kromatografidir.
• Kromatografi karışımdaki maddeleri birbirinden
ayırmada kullanılan en etkin yöntemdir.
• Endüstride kullanılan kromatografi türleri
Adsorbsiyon kromatografisi
İyon değiştirme kr.
Jel filtrasyon kr.
Affinite kr.
• Mikrobiyal gelişme ve ürün oluşum kinetiği
13
• M.o’ların gelişmeleri ve ürün oluşturmaları çevreye
bağımlı olarak meydana gelir.
• Bu nedenle gelişme ve ürün oluşumunu anlayabilmek
için mikrobiyal metabolizmanın düzenlenmesiyle
fiziksel ve kimyasal çevre arasındaki ilgiyi anlamak
gerekir.
• Mikroorganizma gelişmesi genellikle hücre
kitlesi veya hücre sayısındaki artışın 2 katına
ulaşması için geçen zaman olarak tanımlanır.
Buna jenerasyon süresi (ikilenme süresidoubling time) denir.
• Gelişme kinetiği: mikroorganizmaların üremesini ve
ürün oluşturmasını matematiksel bağlantılarla
tanımlar.
Mikroorganizmaların büyüme eğrisi
• M.o’ların büyümesi belirli kurallara uyar. Bu
nedenle bazı koşullar altında inkübasyon
sonunda beklenen hücre sayısı ve biyokitle
miktarı hakkında önceden tahminde
bulunulabilir.
• Kesikli bir
sistemde
m.o’ların
gelişmesi
şekildeki gibi
olur.
• Bakteriler, mayalar ve küflerin birçoğunun
büyümesinde ayrı ayrı fazlar (üreme eğrisi)
vardır
17
3
3/6/2016
A) Lag faz:
• B) Uyum (adaptasyon) ve hızlanma
fazı (asselerasyon)
Bu fazda hiç hücre bölünmesi olmaz ve
bu faz ilk hücre bölünmesi
gerçekleşinceye kadar devam eder.
bu fazda hücre çoğalması başlar ama
yavaştır. Artış eksponansiyel
değildir.
• DNA miktarı artar enzim sentezi
devam eder. Hücrelerdeki RNA
miktarında önemli artış olur.
• Genellikle A ve B fazları birlikte
değerlendirilir.
• Aşılanan hücre sayısında hiçbir
değişiklik olmaz. Besi ortamından su
ve substratlar alınıp RNA, ribozom ve
protein (özellikle enzim)
biyosentezinde kullanılır.
• Bu nedenle hücre çoğalması olmadığı
halde biyokütle artar.
• Bu fazın süresi, aşı kültürü miktarına,
aşı materyalinin yaşına, substratın
uygunluğuna bağlıdır.
C) Eksponansiyel faz
(logaritmik)
Büyüme hızı pratikte sabittir
ve maksimuma ulaşmıştır.
RNA’ya kıyasla DNA sentezi
daha fazladır. M.o
gelişmesinin sınırlayan hiçbir
faktör yok
• Hücre çoğalması kolaylıkla
hesaplanabilir.
D) Geçiş fazı
bu fazda hücre çoğalma hızı sürekli azalır.
Fakat global olarak düşünüldüğünde hücre
sayısı ve biyokitle artışı devam eder.
•
Logaritmik fazdan üreme hızının düşük
olduğu geçiş fazına geçmenin başlıca
sebepleri:
 Toksik metabolik ürünlerin oluşması
 Substratın tükenmesi
 Viskozite artışı ile oksijen alımının
zorlaşması
Bu fazda değişik yaşlarda hücreler bulunur
E) durağan faz (stationary
phase)
Bu fazda yeni oluşan hücre sayısı ile ölen
hücre sayısı dengelenmiştir. Toplam hücre
sayısı sabit kalır.
•
Metabolizma anabolizmadan
katabolizbolizmaya dönmüştür.
•
Biyosentezler daha çok sekonder metabolit
üretimine yöneliktir.
•
Sekonder metabolit üretimi amaçlanıyorsa
bu fazın mümkün olduğu kadar uzun
sürmesinde yarar vardır.
F) Azalma ve ölüm fazı (lethal
faz): ölen hücrelerin sayısı yeni
oluşan hücrelerden fazladır.
m.o’ların ölüm hızları arttığı için
zamanla konsantrasyonlarında
azalma olur.
Spesifik gelişme hızı (-) olur
4
3/6/2016
Spesifik (özgül) gelişme hızı (μ):
•
•
•
Birim zamanda toplam hücre sayısına kıyasla hücre miktarındaki artıştır.
μ= 0.6 g m.o 1 saat sonunda 1.6 g olmuş demektir. (biyokitle miktarında % 60 artış
olmuştur) birimi=1/h ; h-1
M.o’lar logaritmik evrede üstel çoğalırlar. Buna göre logaritik evredeki m.o gelişme
hızı:
• Problem: Bir maya fermentasyonunda inokülasyonun 6. saatinde ve 8.
saatinde alınan örneklerde yapılan ölçümlerde biyokitle miktarları sırası ile
3.5 ve 5.4 g/L olarak ölçülmüştür. Bu mikroorganizmanın özgül gelişme
hızını hesaplayınız.
dN
dx
= μN
= μx
dt
dt
N=hücre sayısı
Hücre sayısının deneysel olarak belirlenmesi zor olduğundan hücre
büyümesi biyokitle artışı olarak hesaplanır.
lnx2/x1
μ=
∆t
μ= spesifik üreme hızı
X1= hücre kons (g/L)
t= süre (saat)
M.o’ların üreme eğrileri ile spesifik üreme hızlarının
bağlantısı
• Lag fazda μ=0
• Uyum fazında sürekli artar
• Logaritmik fazda sabittir ve
μ=μmax
• geçiş fazında azalmaya
başlar
• Durağan fazda sıfıra yakındır
İkilenme (jenerasyon) süresi (generation doubling time)
(td)
• M.o konsantrasyonunun iki katına çıktığı süredir
lnx2/x1
μ=
∆t
Denkleminde
yerine konulursa
ln2
td=
μ
• Problem: Belirli kültür koşullarında spesifik
gelişme hızı μ= 0.524 h-1 olan bir
mikroorganizmanın ikilenme süresini
hesaplayınız.
• M.o’lar için tipik gelişme hızı değerleri
μmax
Jenerasyon süresi
(h)
Bakteri
0.69-3.0
1-0.25
Maya
0.34-0.6
2-1.15
Küf
0.1-0.34
6.9-2
5
3/6/2016
Verim katsayıları
Bazı bakterilerin çeşitli substratlar üzerindeki ikilenme süreleri
Bakteri
substrat
jenerasyon süresi
(dakika)
Escherichia coli
Glikoz
17
Bacillus megaterium
Sakkaroz
25
Streptococcus lactis
Süt
26
Streptococcus lactis
Laktoz broth
48
Lactobacillus acidophilus
Süt
66-87
• M.o’ların gelişmeleri ve ürün oluşturmaları biyodönüşüm
işlemleridir. Burada biyodönüşümü besleyen kimyasal besin
maddeleri hücre kitlesi ve metabolitlere dönüşür.
• Besin maddeleri ve enerji kaynakları ile oluşan hücre kitlesi ve
ürünler arasındaki bağlantıları açıklayabilmek için verim
etkinliğin bilinmesi gerekir.
• Bu biyodönüşümler tüketilen her birim besin maddesine
karşılık oluşan ürün veya hücre kitlesi olarak verim katsayıları
şeklinde kantitatif olarak hesaplanabilir.
Verim katsayıları
• Hücre verim katsayısı: Tüketilen her birim
substrata karşılık oluşan birim biyokitle
Yx 
s
• Ürün oluşum verim katsayısı: Tüketilen her
birim substrata karşılık oluşan ürün miktarı
dx x  xo

ds so  s
Yp 
s
dP P  P0

ds s0  s

Teorik verim
• Yukarıda açıklanan verim değerleri gözlemlenen (gerçekleşen)
verim değerlerini ifade eder
• Substrat üzerinden hücre kitlesi veya ürünlerin teorik
verimlerini de hesaplamak mümkündür.
• Örneğin : etil alkol fermentasyonunda
•
C6H12O6
(180g)
•
• Pratikte substratın bir kısmı hücre kitlesi
oluşmu ve enerji bir kısmı da diğer yan
ürünlerin oluşumunda kullanıldığı için
belirtilen teorik verim elde edilemez. Ancak
çok yaklaşılabilir. Örn etil alkol üretiminde
teorik verimin % 90-95’ine ulaşılabilir.
2C2H5OH + 2CO2
(92 g)
100 g glikozdan 51.1 g etil alkol oluşur
6
3/6/2016
Substrat dönüşüm oranı
• Gerçekleşen verimin teorik verime oranı ile % verim
hesaplanır
% verim
=
Gerçekleşen verim
*100
Teorik verim
Substratın % kaçının kullanıldığını gösterir.
(Başlangıç subs miktarı – kalan substrat)
Substrat dönüşümü % =
* 100
başlangıçtaki subs. miktarı
• Bu değer denemeleri planlamada ve sonuçları yorumlamada
standart bir ölçü olarak kullanılır
(S1- S2)
Substrat dönüşümü % =
* 100
S1
• Problem: S. cerevisiae ile glikozdan etil alkol üretiminin
yapıldığı bir çalışmada 48 saatlik fermentasyon sonucunda
aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir
Glikoz
Biyokitle
Etil alkol
Buna göre;
Başlangıç
200g
0.5
0.8
48h
16 g
4.8
83
a) ürün oluşum verimini
b) biyokitle verimin
c) % verimi
d) substrat dönüşüm oranını hesaplayınız
7